響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取黃粱木葉蛋白工藝

■謝藝瀟 王 雨 楊富裕*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；2.北京助爾生物科學(xué)研究院，北京100085)

由于世界蛋白資源匱乏，人類正在努力通過(guò)昆蟲(chóng)、藻類、植物葉片等多種途徑獲取蛋白質(zhì)[1]。葉蛋白（Leaf protein concentration，LPC）是將新鮮的植物莖葉壓榨取汁，將汁液中蛋白質(zhì)分離、干燥后得到的高質(zhì)量濃縮物[2]，是世界上最大的蛋白質(zhì)來(lái)源[3]，其營(yíng)養(yǎng)全面，富含多種活性因子，還具有一定的保健作用[4]。黃粱木在1972年的世界林業(yè)大會(huì)上被譽(yù)為“奇跡之樹(shù)”，以生長(zhǎng)快著稱。黃粱木葉量大，蛋白含量較高，對(duì)其進(jìn)行葉蛋白提取具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前木本植物葉蛋白提取研究以蛋白桑、辣木為主，鮮有用黃粱木提取葉蛋白的研究報(bào)道，曾凡枝等[5]曾用纖維素酶對(duì)苜蓿進(jìn)行浸泡處理提取葉蛋白。朱天明等[6]和熊瑤[7]則分別用纖維素酶對(duì)桑樹(shù)葉粉和辣木葉粉進(jìn)行處理，提取葉蛋白，三者均取得了較好的效果，表明纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁有一定的降解作用，從而可以提高葉蛋白的提取率。但是曾凡枝等先用纖維素酶處理葉片后再進(jìn)行打漿，這種工藝可能會(huì)阻礙纖維素酶對(duì)葉片內(nèi)部細(xì)胞壁的降解，而朱天明和熊瑤等用干粉提取葉蛋白的方法在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)增加烘干成本。因此本試驗(yàn)采取先打漿再酶解的工藝，研究纖維素酶對(duì)新鮮黃粱木葉片葉蛋白提取工藝的影響，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法，得到纖維素酶活性范圍內(nèi)提取葉蛋白的最佳提取工藝，為更好地開(kāi)發(fā)黃粱木葉蛋白資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

纖維素酶：活性≥10 000 U/g（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)植物

試驗(yàn)黃粱木葉片于2016年12月取自中國(guó)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，經(jīng)測(cè)定葉片含水量66.4%，粗蛋白含量11.9%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 黃粱木葉蛋白提取工藝

稱量新鮮采摘黃粱木葉片12 g，按照料液比1∶6加入1%NaCl溶液72 g，打漿4 min。在得到的葉漿中加入纖維素酶，恒溫水浴2 h后用四層紗布過(guò)濾得到葉汁。葉汁80℃水浴10 min后，置于離心機(jī)6 000 r/min離心20 min。倒去上清液（棕色液）后將得到的葉蛋白置于65℃烘箱恒溫干燥48 h，稱重。

1.3.2 提取率的計(jì)算

用凱氏定氮法測(cè)定葉蛋白中蛋白質(zhì)含量，按照下式計(jì)算提取率：

粗蛋白質(zhì)提取率=葉蛋白中粗蛋白質(zhì)含量/試樣中粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

纖維素酶的反應(yīng)溫度一般為30～60℃，pH值4～5.5，文獻(xiàn)顯示其最適反應(yīng)條件為溫度45℃[8]，pH值5[5]。考慮到過(guò)高的溫度可能導(dǎo)致葉蛋白提前沉淀，縮小溫度試驗(yàn)溫度范圍至40～50℃。采用軟件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以加酶量、溫度和pH值為自變量，以葉蛋白提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理與分析采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到黃粱木葉蛋白提取率與酶法處理各因素編碼值之間的二次方程模型：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

回歸方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

模型P=0.000 2＜0.05，失擬項(xiàng)P=0.445 3＞0.05，說(shuō)明模型回歸顯著失擬不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=97.04%，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間有較高的相關(guān)性，依照方程預(yù)測(cè)纖維素酶法提取黃粱木葉蛋白結(jié)果較可靠。在各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)葉蛋白提取率影響大小排序?yàn)椋簆H值＞溫度＞加酶量，方程中主因素B（pH值）對(duì)葉蛋白提取率影響顯著，AC、A2、B2對(duì)葉蛋白提取率影響極顯著，表明各個(gè)因素和響應(yīng)值間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)黃粱木葉蛋白提取率也有影響。

2.2 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3?？筛鶕?jù)等高線的密集程度判斷因素間交互作用的強(qiáng)弱，等高線為橢圓形說(shuō)明交互作用顯著，等高線密集說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)因素?cái)?shù)值變化更加敏感。如圖2等高線較為密集，說(shuō)明溫度和加酶量的交互作用對(duì)黃粱木葉蛋白提取率有顯著影響。由軟件分析得，當(dāng)pH值為4，溫度為50℃，纖維素酶濃度為11.93 U/g時(shí)，黃粱木葉蛋白提取率理論值可達(dá)30.26%，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)際可達(dá)29.88%，接近理論值。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

圖1 加酶量和pH值對(duì)提取率的影響

圖2 加酶量和溫度對(duì)提取率的影響

圖3 溫度和pH值對(duì)提取率的影響

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析在保證纖維素酶活性的條件下得到了提取黃粱木葉蛋白的最佳工藝，此時(shí)的提取率達(dá)到最大。同時(shí)在纖維素酶的作用下，黃粱木葉片細(xì)胞壁纖維素、木質(zhì)素也被分解，從而可以提高棕色液中可溶性糖的含量，在當(dāng)pH值為4，溫度為45℃，纖維素酶濃度為30 U/g時(shí)，可溶性糖含量可達(dá)4 528.547 mg/kg。將棕色液和葉渣混合發(fā)酵產(chǎn)乙醇[9]或者用作飼料都是葉蛋白提取后副產(chǎn)品的有效利用方式，纖維素酶對(duì)纖維素、木質(zhì)素的水解將對(duì)棕色液的利用起到有利影響。

但是，由于酶解時(shí)加酸的影響，可能導(dǎo)致打漿后浸出的蛋白質(zhì)部分沉淀，被紗布濾走，從而造成了部分蛋白損失，這是本試驗(yàn)?zāi)壳盁o(wú)法避免的一個(gè)缺點(diǎn)，不過(guò)并不影響得到的優(yōu)化條件。本試驗(yàn)得到的研究結(jié)果可為黃粱木葉蛋白提取工藝開(kāi)發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值，但保持纖維素酶活性在另一方面可能限制葉蛋白的提取條件，因此本試驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化所得到的最優(yōu)條件也存在邊緣水平，這在將來(lái)實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)有所取舍，可以擴(kuò)大范圍進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。

4 結(jié)論

在纖維素酶法提取黃粱木葉蛋白試驗(yàn)中，溫度、纖維素酶濃度對(duì)葉蛋白提取率無(wú)顯著影響(P＞0.05)，pH值對(duì)葉蛋白提取率影響顯著(P＜0.05)，最優(yōu)提取工藝為纖維素酶濃度為11.93 U/g，溫度為50℃，pH值為4，提取率達(dá)29.88%。