食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.174—2016中普魯蘭酶（比色法）檢測(cè)方法的解讀

■程 瑛 徐 麗 陳雪姣 鄧曉旭 張雅潔 洪澤坤 周 櫻 熊海容

（1.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢430074；2.中南民族大學(xué)，湖北武漢430074）

由于普魯蘭酶來(lái)源不同，它的酶學(xué)性質(zhì)存在著很大的差異，而關(guān)于酶活性的檢測(cè)方法，各廠家企業(yè)都是根據(jù)酶的性質(zhì)制定的，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)沒統(tǒng)一之前，酶活性檢測(cè)方法并不能統(tǒng)一。程池等在1988年提出了改善Kobayashi的碘色法，主要有以糯米淀粉為底物的碘色法和以普魯蘭多糖為底物的3,5-二硝基水楊酸（DNS）法兩種酶活性測(cè)定法[4]。而DNS比色法簡(jiǎn)便快捷，使用更加廣泛，但由于DNS的配制方法版本較多，導(dǎo)致酶活性的結(jié)果差異很大。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.174—2016規(guī)定了兩種酶活性測(cè)定方法，比色法和染色普魯蘭（紅）法，從根本上統(tǒng)一了普魯蘭酶活性測(cè)定的方法。

阿卡波糖在國(guó)標(biāo)GB 1886.174—2016中重復(fù)出現(xiàn)，意義很大，但是關(guān)于阿卡波糖在酶制劑方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道，在醫(yī)用領(lǐng)域報(bào)道的比較多。阿卡波糖是一種很復(fù)雜的低聚糖，它可逆地抑制小腸黏膜刷狀緣上的α-糖苷酶活性，其抑制力的順序?yàn)槠咸烟堑矸勖福菊崽敲福钧溠刻敲福井慃溠刻敲竅5]。阿卡波糖（Acarbose）是臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，屬于2型糖尿病的常用藥物之一，它是一種生物合成的假性四糖，能抑制小腸壁細(xì)胞的α-糖苷酶活性，從而延緩腸道內(nèi)寡糖、雙塘或多糖的降解，延緩葡萄糖和果糖的吸收和降解，以達(dá)到降低餐后血糖的效果[6]。國(guó)標(biāo)提到添加阿卡波糖的作用是抑制樣品中葡萄糖淀粉酶的活性。如果酶制劑產(chǎn)品里面含有其他可水解普魯蘭多糖（如葡糖淀粉酶），就需要加入一定量的阿卡波糖。

本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體情況選擇常見的比色法作為研究對(duì)象，通過系列試驗(yàn)來(lái)解析國(guó)標(biāo)中各參數(shù)對(duì)酶活性的影響，以便于更好地理解國(guó)標(biāo)。

1 材料與方法

除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T 6682中規(guī)定的二級(jí)水。

1.1 試劑材料

普魯蘭酶、糖化酶、中溫淀粉酶均來(lái)源于武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司。

普魯蘭多糖P4516(Sigma公司)、普魯蘭多糖P0978(TCI公司)、3,5-二硝基水楊酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、阿卡波糖(購(gòu)于市場(chǎng))、無(wú)水乙酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、冰乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無(wú)水葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)、WH-2微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器有限公司)、移液器(Thermo公司)、THZ-82恒溫振蕩器(國(guó)華電器有限公司)。

由于飼料添加劑木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和纖維素酶活性測(cè)定方法中使用的終止劑DNS配制方法均同于GB/T 23874—2009中的DNS試劑，因此，本文選取了GB/T 23874—2009中的DNS試劑作為對(duì)比。

1.2 方法

1.2.1 普魯蘭酶活性測(cè)定

各個(gè)單位要支持、鼓勵(lì)會(huì)計(jì)人員的到訪調(diào)查以及研究，并且各個(gè)單位要自覺接受會(huì)計(jì)監(jiān)督，與其他單位交流意見。這樣做既能夠處理好核算、監(jiān)管與管理這三者的關(guān)系，并且也可以加深核算、監(jiān)管與管理這三者的交流，充分發(fā)揮會(huì)計(jì)職能的作用。同時(shí)還要構(gòu)建有效的約束機(jī)制，定期深入到單位來(lái)分析經(jīng)濟(jì)活動(dòng)等，不斷規(guī)范管理。

采用3，5-二硝基水楊酸法，在1.0 ml的0.5%的普魯蘭多糖溶液（用醋酸緩沖液配制）中加入1.0 ml適當(dāng)稀釋的酶液，于60℃保溫反應(yīng)30 min，加入3,5-二硝基水楊酸DNS試劑3.0 ml，沸水浴7 min后取出，迅速冷卻至室溫，加入10 ml水，搖勻，以空白管中溶液（對(duì)照液先加終止劑DNS，保溫30 min后加入1.0 ml適當(dāng)稀釋的酶液）調(diào)儀器零點(diǎn)，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm下測(cè)量溶液的吸光度。酶活單位定義為在上述條件下，1 ml或1 g產(chǎn)品每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成1 μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。

1.2.2 影響普魯蘭酶活性因素的部分試驗(yàn)

1.2.2.1 阿卡波糖及淀粉酶制劑的添加對(duì)普魯蘭酶活性的影響的試驗(yàn)

設(shè)計(jì)幾組試驗(yàn)，其中包括a組：普魯蘭酶；b組：普魯蘭酶+糖化酶；c組：普魯蘭酶+中溫淀粉酶；d組：普魯蘭酶+糖化酶+中溫淀粉酶。按一定比例配置四組試驗(yàn)用酶制劑，添加阿卡波糖，采用比色法分別檢測(cè)四組酶制劑中的普魯蘭酶的酶活性；同時(shí)進(jìn)行四組不添加阿卡波糖試驗(yàn)組，并進(jìn)行比較。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.2 兩種底物Sigma P4516和TCI P0978對(duì)普魯蘭酶活性的影響的試驗(yàn)

設(shè)計(jì)如表1的四組酶制劑，分別使用不同廠家的底物進(jìn)行酶活性檢測(cè)，最后進(jìn)行比較。

1.2.2.3 不同配制方法的3,5-二硝基水楊酸試劑對(duì)普魯蘭酶活性影響的試驗(yàn)

設(shè)計(jì)如表1的四組酶制劑，分別使用不同方法配置的3,5-二硝基水楊酸試劑作為終止劑，進(jìn)行普魯蘭酶活性的檢測(cè)，最后進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 阿卡波糖及淀粉酶制劑的添加對(duì)普魯蘭酶活性的影響

阿卡波糖及淀粉酶制劑對(duì)普魯蘭酶活性測(cè)定的影響結(jié)果見表2。比較a組，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.61%，可以判斷阿卡波糖對(duì)單一普魯蘭酶活性的測(cè)定沒有明顯影響；比較b、d組，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差38.23%、18.15%可知，糖化酶的添加對(duì)普魯蘭酶活性的影響非常大，但阿卡波糖可消除這種影響，它可抑制樣品中糖化酶的活力，這也是國(guó)標(biāo)中為什么要求添加阿卡波糖的原因；比較c、d組相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差14.20%、18.15%可知，中溫淀粉酶對(duì)普魯蘭酶活性的測(cè)定也有一定的影響。

表2 阿卡波糖及淀粉酶對(duì)普魯蘭酶活性影響

2.2 兩種底物Sigma P4516和TCI P0978對(duì)普魯蘭酶活性的影響

不同廠家的底物對(duì)普魯蘭酶活性的影響結(jié)果見表3。比較a、b、c、d四組的兩個(gè)廠家的底物的試驗(yàn)結(jié)果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.26%、0.90%、8.82%和6.83%，可以看出，TCI廠家的底物測(cè)試的酶活性結(jié)果高于Sigma公司的結(jié)果，并且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，如果按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的10%，加上實(shí)驗(yàn)員的偶然誤差，兩種底物的檢測(cè)結(jié)果差異并不是很大，因此，這兩家公司的底物在某種程度上，具有相同的作用效果。

表3 不同廠家的底物對(duì)普魯蘭酶活性的影響

2.3 不同配制方法的3,5-二硝基水楊酸試劑對(duì)普魯蘭酶活性的影響

不同配制方法的3,5-二硝基水楊酸試劑對(duì)普魯蘭酶活性的影響結(jié)果見表4。比較兩種不同配制方法的DNS的四組試驗(yàn)，他們之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)分別是1.502 6、1.489 5、1.502 1、1.502 5，從轉(zhuǎn)換系數(shù)上看，無(wú)論是否添加淀粉酶，GB/T 23874—2009中的DNS測(cè)試的酶活性結(jié)果均比新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試的酶活性結(jié)果高，并且它們之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)大約是1.5倍的關(guān)系。如果實(shí)驗(yàn)室使用的GB/T 23874—2009的DNS比較多，可以考慮使用GB/T 23874—2009的DNS，測(cè)試酶活性結(jié)果除以1.5即可。

表4 不同配制方法DNS對(duì)普魯蘭酶活性影響

3 討論

3.1 阿卡波糖及淀粉酶制劑的添加對(duì)普魯蘭酶活性的影響。

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，阿卡波糖的添加對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大。通過幾組重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果分析，如果酶制劑中只含有一個(gè)酶種普魯蘭酶，則是否添加阿卡波糖，對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果基本沒有影響。而試驗(yàn)組中的b、c組和d組試驗(yàn)結(jié)果顯示添加阿卡波糖與否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，因此，比較符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中添加阿卡波糖的要求。淀粉酶有很多種，本試驗(yàn)中選擇的中溫淀粉酶是α-淀粉酶的一種，屬于內(nèi)切酶，作用機(jī)理是從淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)切割α-1，4-糖苷鍵，不切α-1，6-糖苷鍵；而糖化酶是外切酶，從非還原末端依次切割葡萄糖單位，遇到α-1，4鍵或α-1，6鍵都能水解。而普魯蘭酶是脫支酶的一種，屬于內(nèi)切酶，水解支鏈淀粉和糖原中的α-1，6-糖苷鍵。從作用方式和專一性來(lái)看，糖化酶的添加對(duì)普魯蘭酶活性影響很大，而中溫淀粉酶的影響相對(duì)較小。

3.2 兩種底物P4516和P0978對(duì)普魯蘭酶活性的影響。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的底物是Sigma公司的P4516普魯蘭多糖，本試驗(yàn)選取了TCI公司的P0978的底物，同Sigma公司的底物進(jìn)行比較，通過多組重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TCI公司的底物檢測(cè)出的酶活性高于Sigma公司，通過多組重復(fù)試驗(yàn)，也可以得出一定的轉(zhuǎn)換系數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件，特殊情況下可以考慮使用不同廠家的底物，以到達(dá)相同的效果。

3.3 不同配制方法的3,5-二硝基水楊酸試劑對(duì)普魯蘭酶活性的影響。

由于DNS試劑配制較繁瑣，使用周期較長(zhǎng)，很多企業(yè)院校使用的DNS并非國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.174—2016中的DNS，本實(shí)驗(yàn)室使用GB/T 23874—2009的DNS試劑較多。對(duì)比這兩種DNS試劑的配制方法，成分相同，只是濃度存在一定差異，造成對(duì)葡萄糖的顯色能力不同。GB/T 23874—2009的DNS試劑檢測(cè)的酶活性結(jié)果高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.174—2016中DNS的檢測(cè)結(jié)果，在試驗(yàn)沒有特殊的要求下，可以考慮采用GB/T 23874—2009的DNS試劑作為終止劑，檢測(cè)結(jié)果除以轉(zhuǎn)化系數(shù)即可。但是，在一般情況下，應(yīng)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)普魯蘭酶的酶活性。

4 結(jié)論

①阿卡波糖及淀粉酶對(duì)普魯蘭酶活性的測(cè)試影響很大，阿卡波糖的作用機(jī)制目前尚未清楚，還需試驗(yàn)進(jìn)行研究。

②可以尋找具有相同作用效果的普魯蘭多糖作為試驗(yàn)用底物，如果實(shí)驗(yàn)室使用的普魯蘭國(guó)標(biāo)GB 1886.174—2016DNS試劑比較少，可以考慮使用GB/T 23874—2009的DNS試劑或者實(shí)驗(yàn)室常用的DNS試劑來(lái)替代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的DNS試劑，以減少試驗(yàn)檢測(cè)成本。但是，在沒有特殊情況下，必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

③本研究中所列出的所有參數(shù)均對(duì)普魯蘭酶活性檢測(cè)有影響，這僅代表本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果，僅供參考，為普魯蘭酶活性檢測(cè)可能會(huì)產(chǎn)生的誤差提供一些幫助。