固態(tài)發(fā)酵麩皮制備復(fù)合多糖的菌種和營養(yǎng)鹽優(yōu)化

■安曉萍 王 園 史俊祥 王瑞芳 王乃鳳 齊景偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

小麥麩皮是小麥加工面粉的副產(chǎn)物，約占小麥籽粒重的22%～25%[1]。麩皮含有10%～15%淀粉、12%～18%蛋白質(zhì)、4%～6%灰分以及一些次要的組分[2]。除此之外，麩皮還含有46%的非淀粉多糖（Non-starch polysaccharides，NSP）[3]，但非淀粉多糖的存在會導(dǎo)致畜禽對飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率降低，原因是畜禽內(nèi)源性消化酶不能分解或是不能徹底分解其中的化學(xué)鍵，被細胞壁中各種化學(xué)鍵束縛的營養(yǎng)物質(zhì)難以釋放出來，使消化酶難以充分接觸胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致飼料的利用消化率低，故長期以來非淀粉多糖被視為抗營養(yǎng)因子。隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)麥麩非淀粉多糖中的非纖維多糖具有諸多可貴的生物活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和益生作用等，因此，此類多糖又稱為麩皮活性多糖，簡稱麩皮多糖。

微生物發(fā)酵法制備多糖是近些年發(fā)展起來的一種生物方法，該方法是利用完整的微生物細胞作為生物催化劑，與酶轉(zhuǎn)化法相比而言，省去了酶的篩選、提取和純化等兩到三個步驟，節(jié)約了經(jīng)濟成本。同時，該方法制備出的多糖既包括菌體多糖、基質(zhì)多糖，又包括發(fā)酵工程中轉(zhuǎn)化的多糖，故稱為復(fù)合多糖[4]。微生物發(fā)酵法制備多糖常用菌種主要有食用菌、霉菌等，鮮有利用細菌和酵母菌發(fā)酵制備復(fù)合多糖。本研究利用酵母菌、枯草芽孢桿菌等菌株固態(tài)發(fā)酵麩皮制備復(fù)合多糖飼料添加劑，篩選出合適的發(fā)酵菌株和營養(yǎng)鹽組成，為發(fā)酵麩皮多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母CGMCC 2.119(Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.119)、枯草芽孢桿菌CGMCC 1.0892(Bacillus subtilisCGMCC 1.0892)購買于中國微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌P8（Lactobacillus plantarumP8）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物飼料工程實驗室提供。

1.1.2 原料

麩皮、豆粕粉、玉米粉均購于市場。

1.1.3 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的種子液培養(yǎng)基均為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；釀酒酵母菌種子液培養(yǎng)基為麥芽汁液體培養(yǎng)基；植物乳桿菌種子液培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)固態(tài)培養(yǎng)基：麩皮80%、豆粕粉10%、玉米粉10%、料水比1∶1。

1.2 主要試驗儀器

手提式壓力蒸汽滅菌器[上海申安醫(yī)療器械廠（中國）]、SW-CJ超凈工作臺[上海新苗醫(yī)療器械（中國）]、GX2型智力光照培養(yǎng)箱[寧波東南儀器有限公司（中國）]、SH2-82旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器[金壇市岸頭中旺實驗儀器廠（中國）]、酶標儀[BioO-Rad公司（美國）]、TG16-WS臺式高速離心機[湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司（中國）]、電熱恒溫水浴鍋[上海醫(yī)療器械有限公司（中國）]。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液的制備

釀酒酵母菌種子液的制備：將保藏的釀酒酵母接種于滅菌（121℃、0.1 MPa）的麥芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃、120 r/min），使菌體濃度達到108cfu/ml。

枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保藏的枯草芽孢桿菌接種于滅菌（121℃、0.1 MPa）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃、120 r/min），使菌體濃度達到108cfu/ml。

植物乳桿菌種子液的制備：將保藏的植物乳桿菌接種于滅菌（121℃、0.1 MPa）的MRS培養(yǎng)基中，靜置于35℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，此時菌體濃度達到108cfu/ml。

地衣芽孢桿菌種子液的制備：將保藏的地衣芽孢桿菌接種于滅菌（121℃、0.1 MPa）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃、120 r/min），此時菌體濃度達到108cfu/ml。

1.3.2 試驗設(shè)計

1.3.2.1 菌種優(yōu)化

① 菌種篩選。將釀酒酵母（Sc）、枯草芽孢桿菌（Bs）、植物乳桿菌（Lp）和地衣芽孢桿菌（Bl）4種菌以單菌、雙菌、三菌和四菌組成方式攪拌均勻，分別接種至滅菌后的基礎(chǔ)發(fā)酵底物中，接種量10%，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h，測定發(fā)酵產(chǎn)物中復(fù)合多糖含量。

②菌種比例。將上述最佳組合菌按不同比例接種至滅菌后的基礎(chǔ)發(fā)酵底物中，接種量10%，攪拌均勻，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h，測定發(fā)酵產(chǎn)物中復(fù)合多糖含量。

1.3.2.2 營養(yǎng)鹽優(yōu)化

① Plackett-Burman（PB）試驗。發(fā)酵總體系為100%，總接種量10%，釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌=7∶3接種于基礎(chǔ)固態(tài)培養(yǎng)基，攪拌均勻，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。選用試驗次數(shù)為20次（N=20）的Plackett-Burman試驗設(shè)計，對MgSO4、虛擬項1、Mn-SO4、CaCl2、虛擬項2、K2HPO4、尿素、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、腐植酸鈉10個因素進行篩選，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為發(fā)酵產(chǎn)物中的復(fù)合多糖產(chǎn)量。Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman design試驗因素水平

②單因素試驗。根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，對差異顯著的因子進一步通過單因素試驗，以發(fā)酵底物中復(fù)合多糖含量為指標，確定最適添加量。

1.3.3 多糖的提取

將發(fā)酵產(chǎn)物和未發(fā)酵原料于45℃烘箱中烘干（24 h）后粉碎，10 g干燥發(fā)酵麩皮加入200 ml水中，80 ℃水浴30 min，離心(常溫，5 000 r/min、10 min)取上清，上清液加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜，離心收集沉淀物，沉淀用蒸餾水復(fù)溶后即得多糖溶液。

1.3.4 多糖的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖得率[5]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Minitab17軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果分析；SAS 8.1統(tǒng)計軟件ANOVA模型對確定尿素添加量的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan's檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種優(yōu)化結(jié)果

不同菌株對發(fā)酵麩皮中多糖含量的影響結(jié)果見圖1。由圖1a可以看出，經(jīng)過單菌種發(fā)酵，發(fā)酵麩皮中多糖含量由高到低依次為地衣芽孢桿菌＞釀酒酵母菌＞枯草芽孢桿菌＞植物乳桿菌。其中，地衣芽孢桿菌發(fā)酵麩皮后多糖含量顯著高于其他菌種(P＜0.05)。由圖1b可以看出，經(jīng)過混菌發(fā)酵，發(fā)酵麩皮多糖產(chǎn)量由高到低依次為枯草芽孢桿菌+釀酒酵母菌＞地衣芽孢桿菌+釀酒酵母菌＞枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+釀酒酵母菌＞植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+釀酒酵母菌＞其他菌種組合。其中，枯草芽孢桿菌+釀酒酵母菌雙菌組合的發(fā)酵麩皮中多糖含量顯著高于其他菌種組合(P＜0.05)，且高于單菌地衣芽孢桿菌發(fā)酵麩皮中多糖含量。因此，本試驗選擇枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌雙菌混合發(fā)酵麩皮制備復(fù)合多糖飼料添加。

圖1 不同菌種發(fā)酵對多糖含量的影響

枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌不同比例發(fā)酵麩皮中多糖含量的變化見圖1c，由圖1c可見，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌以3∶7比例發(fā)酵麩皮中多糖含量最高，可達53.67 mg/g，因此，本試驗選擇枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌以3∶7比例混合固態(tài)發(fā)酵麩皮制備復(fù)合多糖飼料添加。

2.2 Plackett-Burman優(yōu)化營養(yǎng)鹽結(jié)果

2.2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果(見表2～表3)

由表3的Plackett-Burman的試驗方差分析結(jié)果可知，8種因素對于麩皮多糖產(chǎn)量影響的重要性順序為：尿素＞MnSO4＞K2HPO4＞MgSO4＞酒石酸鉀鈉＞腐植酸鈉＞CaCl2＞檸檬酸鈉，其中尿素顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖含量（P＜0.05），且具有正效應(yīng)（T＞0），其他因素對發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖含量無顯著影響（P＞0.05）。由此，進一步通過單因素試驗確定尿素最適添加量。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗方差分析結(jié)果

2.2.2 尿素最適添加量的確定(見表4)

由表4可以看出，在試驗因素水平選取范圍內(nèi)，隨著尿素添加量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)尿素添加量為0.10%時麩皮多糖產(chǎn)量達到最大值，顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此，將尿素最適添加量確定為0.10%。

表4 尿素對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

3 討論

近幾年，發(fā)酵方式逐漸由單菌發(fā)酵發(fā)展為混菌發(fā)酵，其原因在于多菌種之間存在協(xié)同作用，可降低單菌發(fā)酵的劣勢[6]。吳學(xué)鳳等(2012)[7]和陳洪偉等(2011)[8]分別以不同指標發(fā)酵麩皮，都發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌種發(fā)酵。但是這種菌種之間的配伍不是盲目性的，在選擇和應(yīng)用上要注重不同微生物之間的協(xié)同性和互補性，因為不同微生物之間也許存在頡頏作用。就本試驗而言，單菌發(fā)酵產(chǎn)糖量最多的是地衣芽孢桿菌，但該菌與其他菌種共同發(fā)酵時，產(chǎn)糖量卻沒有其單菌發(fā)酵量高，可能是該菌種在多菌共生的環(huán)境里，自身生長或是酶的活性受到了抑制；植物乳桿菌自身的酶系統(tǒng)較其他菌種來說不發(fā)達，故其單菌發(fā)酵麩皮生產(chǎn)多糖的能力也較弱，再加上其在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸不斷降低發(fā)酵底物pH值，會影響其他菌種的生長代謝[9]，因此，有植物乳桿菌參與的多菌種發(fā)酵，其產(chǎn)多糖的能力也普遍低于其他混菌組合?？莶菅挎邨U菌和釀酒酵母菌的單菌發(fā)酵麩皮生產(chǎn)多糖能力不是最強的，但是二者共同發(fā)酵的多糖含量卻是最高，二者之間可能存在共生作用，代謝產(chǎn)物發(fā)生互補效應(yīng)，增加了麩皮多糖的含量。

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計，將可能影響發(fā)酵產(chǎn)物中多糖產(chǎn)量的8種增效劑（MgSO4、MnSO4、Ca-Cl2、K2HPO4、尿素、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉和腐植酸鈉）進行了兩水平的篩選優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該8種增效劑中只有尿素對發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量具有顯著影響(P＜0.05)。尿素作為一種速效氮源，能夠被微生物直接吸收利用[10-11]，有利于微生物的生長代謝，提高了發(fā)酵菌種所分泌酶的產(chǎn)量，使得更多的酶與發(fā)酵底物作用，進而提高多糖產(chǎn)量；同時，由向云等(1990)[12]、楊游（2004）[13]和閆貴龍（2005）[14]等學(xué)者的研究結(jié)果推斷，可能是尿素對發(fā)酵原料產(chǎn)生了氨化作用，麩皮經(jīng)氨化處理后孔隙率增多，以致其吸附酶的表面積增大，從而有助于酶作用的進行。試驗同樣發(fā)現(xiàn)發(fā)酵底物中添加無機鹽或有機鹽對麩皮多糖產(chǎn)量無顯著影響，這可能是發(fā)酵底物中含有的無機、有機鹽足以滿足發(fā)酵微生物的生長代謝，不需要額外添加。腐植酸鈉作為多功能高分子復(fù)合物，含有多種活性基團，可以為微生物生長代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時也可以通過其自身強大吸附作用，吸附其代謝產(chǎn)生的代謝廢物，實現(xiàn)促進了其生長的作用。劉娜等（2013）[15]研究發(fā)現(xiàn)腐植酸鈉會提高枯草芽孢桿菌活菌數(shù)量及發(fā)酵產(chǎn)物中多肽的產(chǎn)量，作者通過研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸鈉會對酵母菌的活菌數(shù)和發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性糖、可溶性蛋白和真蛋白質(zhì)等產(chǎn)生影響[16]。但在本試驗中腐植酸鈉的添加未促進多糖產(chǎn)量，可能是由于高水平添加的腐植酸鈉會形成膠體，增加發(fā)酵底物黏度，降低空氣進入發(fā)酵底物的機會，出現(xiàn)抑制菌體生長現(xiàn)象[17]。

4 小結(jié)

經(jīng)過篩選，確定出固態(tài)發(fā)酵麩皮制備復(fù)合多糖的發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母菌為3∶7。MgSO4、MnSO4、CaCl2、K2HPO4、尿素、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉和腐植酸鈉等8種營養(yǎng)鹽中僅有尿素能夠顯著提高發(fā)酵麩皮中多糖含量（P＜0.05），其最適添加量為0.10%。