• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子篩選與代謝產(chǎn)物分析

    2017-01-06 03:19:50許楚旋任浩章婷馮青青吳巧玉蔣冬花
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:色價紅曲發(fā)酵罐

    許楚旋,任浩,章婷,馮青青,吳巧玉,蔣冬花

    (浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華321004)

    高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子篩選與代謝產(chǎn)物分析

    許楚旋,任浩,章婷,馮青青,吳巧玉,蔣冬花

    (浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華321004)

    以紅曲米中篩選到的紫色紅曲霉Mp-41菌株為出發(fā)菌株,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入轉(zhuǎn)化技術(shù),構(gòu)建了含有983株紅曲霉轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫。用紫外-可見光掃描方法等從轉(zhuǎn)化子庫中篩選出10株紅曲色素色價穩(wěn)定高于原始Mp-41菌株的轉(zhuǎn)化子,薄層層析結(jié)合高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分析了10株轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中桔霉素的含量;其中,轉(zhuǎn)化子62的紅曲色素色價較高,為95.4 U/mL,是原始Mp-41菌株(色素色價50.7 U/mL)的1.88倍,桔霉素含量穩(wěn)定低于原始Mp-41菌株。以原始Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子62為試驗材料,進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵并定時取樣,HPLC等方法分析生長量和發(fā)酵液中各種代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子62生長速度稍快于原始Mp-41菌株,紅曲色素色價和莫納可林K的含量分別為120.76 U/mL,63.72 mg/L,是原始Mp-41菌株的1.5倍和1.21倍;而桔霉素含量為1.172 4 mg/L,是原始Mp-41菌株的35.08%。因此,利用T-DNA插入的方法對紅曲霉進行育種,能產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳變化,在紅曲霉資源的利用上有一定潛力。

    紅曲霉;紅曲色素;桔霉素;發(fā)酵;T-DNA

    紅曲霉(Monascus spp.)是我國釀造微生物中的一個重要的屬,至今已有數(shù)百年的歷史[1]。近幾年,紅曲霉的許多功效相繼被證實,其發(fā)酵產(chǎn)物紅曲色素、Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)[2]、莫納可林K(Monacolin K)[3]等已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品加工及相關(guān)領(lǐng)域中[4-5]。

    紅曲色素是紅曲霉生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,2個最大吸收波峰分別在410,510 nm附近,即黃色光波和紅色光波區(qū);作為一種優(yōu)良的食品天然色素,其被廣泛應(yīng)用于糕點、罐頭、糖果等行業(yè)[6-9]。1995年法國學(xué)者首先在紅曲中發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)——桔霉素,使紅曲產(chǎn)品在國內(nèi)外銷售受到了一定限制[10-11]。因此,提高紅曲霉有益代謝產(chǎn)物、降低桔霉素含量,對于保護和利用我國傳統(tǒng)微生物資源有重要意義[12-13]。

    目前的研究熱點是從分子水平探討紅曲色素、桔霉素、Monacolin K等代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系[14-15],但進展比較緩慢,大多數(shù)研究成果還不能應(yīng)用于生產(chǎn)。工業(yè)微生物菌種的培育,也不失為一種有效發(fā)展紅曲霉應(yīng)用的方式,我國科學(xué)家利用紫外、微波、超聲波、氯化鋁等誘變方法對紅曲霉進行育種,取得了一些進展[16-18]。

    本研究試圖利用實驗室構(gòu)建的紅曲霉T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫[19-20],經(jīng)過篩選、發(fā)酵、代謝產(chǎn)物檢測等,掌握T-DNA轉(zhuǎn)化子與原始菌株發(fā)酵產(chǎn)物的動態(tài)變化特征,探討這種紅曲霉菌種培育方式在實際生產(chǎn)中的可行性,對開發(fā)利用紅曲霉這一寶貴資源有一定的理論及現(xiàn)實意義。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 菌株、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子紫色紅曲霉(Monascus purpureus)Mp-41菌株(簡稱Mp-41菌株),為浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室前期從紅曲米中篩選到的高產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)良菌株,作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫構(gòu)建的出發(fā)菌株;T-DNA質(zhì)粒,為含有TrpC高效啟動子的pATMT1質(zhì)粒(圖1),具有卡那霉素和潮霉素抗性基因序列[19];T-DNA插入Mp-41菌株的紅曲霉轉(zhuǎn)化子983株,作為高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選材料。

    1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH值6.0~6.5(用于Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子的常規(guī)培養(yǎng)、活化和保存)。改良PD液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,牛肉膏5 g,水1 000 mL,pH值6.0~6.5(用于轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)和篩選)。PD液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH值6.0~6.5(用于Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子的一級種子、二級種子培養(yǎng)和5 L發(fā)酵罐發(fā)酵)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選以Mp-41菌株為出發(fā)菌株,利用實驗室建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)(ATMT)紅曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù),構(gòu)建了含有983株轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫[19-20]。

    1.2.1.1 菌株的培養(yǎng)將Mp-41菌株和983株轉(zhuǎn)化子分別接種于PDA培養(yǎng)基上活化5 d,用打孔器(孔徑0.8 cm)取3個菌餅接入裝有40 mL改良PD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)發(fā)酵72 h。

    1.2.1.2 紅曲色素提取和色價檢測[20]吸取1 mL的發(fā)酵液于5 mL的離心管中,加入2 mL 70%的乙醇,混勻后,調(diào)節(jié)pH值至6.0~7.0。靜置20 min后,5 000 r/min離心10 min,取上清液檢測。以70%乙醇溶液做參比,測定其在505 nm處的OD值。按公式計算:色價(U/mL)=稀釋倍數(shù)×吸光值。

    1.2.1.3 桔霉素含量檢測[11-12]吸取1 mL的發(fā)酵液于5 mL的離心管中,加入2 mL甲醇,混勻后用封口膜封好管口,與磁力攪拌子綁一起,放在60℃的集熱式磁力攪拌器內(nèi)攪拌1h,取出,4℃,3 000 r/min離心15 min;用毛細吸管取上清液點于制好的硅膠板上,用展開劑(甲苯、乙酸乙酯、甲酸的體積比為6∶3∶1)展開,紫外燈下觀察Rf值在0.7~0.8之間的黃綠色條帶即為桔霉素顯色條帶。刮取桔霉素條帶的硅膠加入甲醇溶解,用HPLC定量檢測。

    配制梯度濃度的桔霉素標準品用下述色譜條件測定含量并制作標準曲線。Agilent TC-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20,熒光檢測器(檢測波長λex=331nm,λem=500nm),流速為1mL/min,柱溫28℃。得出相關(guān)系數(shù)高的標準曲線后,發(fā)酵上清液用相同的色譜條件測定。

    1.2.2 T-DNA插入轉(zhuǎn)化子的檢測按試劑盒說明書操作,提取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的紅曲霉菌絲基因組DNA。設(shè)計潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase gene,hph基因)的上下游引物:hph1:5′-ATGCCTGAACTCACCGCGAC-3′;hph2:5′-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3′。引物由上海生工公司合成。常規(guī)PCR的體系和方法擴增hph基因片段,如擴增條帶大小在1 000 bp左右,則證明T-DNA成功插入。

    1.2.3 轉(zhuǎn)化子的5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物分析將轉(zhuǎn)化子和Mp-41菌株活化后接入裝有150 mL PD種子培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中,30℃,200 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d,用作一級種子;再取20 mL菌液接種到新的PD種子培養(yǎng)液中相同條件培養(yǎng)3 d,用作二級種子;取150 mL二級種發(fā)酵液接入5L發(fā)酵罐中,30℃,pH值5.0,轉(zhuǎn)速200 r/min條件下進行發(fā)酵。

    1.2.3.1 生長曲線的繪制發(fā)酵過程中每隔3 h取樣,測定不同時間點Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子菌絲干質(zhì)量,繪制生長曲線。

    菌絲干質(zhì)量的測定:將所得發(fā)酵液過0.177 mm篩網(wǎng),蒸餾水沖洗菌絲3次,于60℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量后進行稱量。

    1.2.3.2 紅曲色素色價的檢測其檢測方法同

    1.2.1。

    1.2.3.3 桔霉素含量檢測其檢測方法同1.2.1。

    1.2.3.4 莫納可林K含量的檢測吸取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL的離心管中,用保鮮膜包緊管口,煮沸10 min,在4℃,8 000 r/min條件下離心10 min,取上清液用高效液相檢測。

    色譜條件:AgilentTC-C18液相色譜柱(250mm× 4.6 mm,5 μm),A溶液為乙腈(0.45 μm有機相濾膜過濾),B溶液為pH值2.5的磷酸溶液(0.45 μm水相濾膜過濾)。檢測波長為237nm;流速0.6mL/min;柱溫50℃。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選

    2.1.1 高產(chǎn)紅曲色素轉(zhuǎn)化子的篩選用分光光度計檢測Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液紅曲色素色價,篩選獲得了10株紅曲色素高于Mp-41菌株的轉(zhuǎn)化子,其中,轉(zhuǎn)化子35,62,552等紅曲色素色價顯著高于Mp-41菌株,62號轉(zhuǎn)化子紅曲色素色價達95.4 U/mL,是Mp-41菌株的1.88倍(表1)。

    2.1.2 低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選利用甲醇浸提紅曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液(包括菌絲)中桔霉素,通過薄板層析法,在254 nm紫外光下觀察桔霉素條帶的明暗程度(圖2),初步判別各轉(zhuǎn)化子桔霉素含量的高低;再將桔霉素?zé)晒鈼l帶刮下用甲醇溶解,用HPLC精確檢測桔霉素含量(表1、圖2)。

    表1 10株紅曲色素色價提高的轉(zhuǎn)化子與桔霉素含量

    結(jié)果表明,上述10株轉(zhuǎn)化子中35,62,346桔霉素含量相對較低,分別是原始Mp-41菌株的0.61,0.28,0.65倍;97,552桔霉素含量相對較高。綜合各轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中紅曲色素色價和桔霉素含量,最終選定轉(zhuǎn)化子62作為目的菌株進行5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物分析。

    2.2 轉(zhuǎn)化子62潮霉素抗性基因PCR驗證

    將Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子62基因組DNA用引物hph1和hph2進行PCR擴增,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化子62在1 106 bp處有清晰條帶,片段大小與預(yù)期的hph基因片段長度吻合,而Mp-41菌株沒有擴增出相應(yīng)的條帶,表明T-DNA已經(jīng)成功插入到轉(zhuǎn)化子62基因組DNA中(圖3)。

    2.3 轉(zhuǎn)化子62發(fā)酵罐(5 L)發(fā)酵特征和產(chǎn)物的檢測

    2.3.1 生長曲線每隔4 h取樣一次,測定不同發(fā)酵時間點Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62菌絲干質(zhì)量,繪制生長曲線如圖4所示。Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62的生長曲線變化規(guī)律基本類似。在0~24 h為延滯期;28~68 h為對數(shù)生長期;64~100 h處于穩(wěn)定生長期;100 h以后進入衰亡期。轉(zhuǎn)化子62生長速度相對較快,菌絲最大干質(zhì)量為81.7 g/L,Mp-41菌株為64.4 g/L,轉(zhuǎn)化子62菌絲量為Mp-41菌株的127%。

    2.3.2 紅曲色素色價隨發(fā)酵時間的變化每隔4 h取樣一次,浸提發(fā)酵液中的紅曲色素,分光光度法測定吸光值,計算相應(yīng)紅曲色素色價,Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62色素色價隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律基本相似(圖5)。0~36 h這2個菌株紅曲色素色價均較低,但在40 h后轉(zhuǎn)化子62紅曲色素色價開始高于Mp-41菌株;40~80 h這2個菌株的紅曲色素均快速增長,100 h左右,色素含量增長趨于平緩。轉(zhuǎn)化子62最高色價達120.76 U/mL,是Mp-41菌株(最高色價為80.61 U/mL)的149.81%(約1.5倍)。

    2.3.3 桔霉素含量隨發(fā)酵時間的變化桔霉素含量隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖6所示。轉(zhuǎn)化子62桔霉素最高含量為1.172 4 mg/L,僅為Mp-41菌株(最高含量為3.342 2 mg/L)的35.08%。

    2.3.4 莫納可林K含量隨發(fā)酵時間的變化莫納可林K的產(chǎn)生隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖7所示。轉(zhuǎn)化子62發(fā)酵液中莫納可林K的最大含量為63.72 mg/L,是Mp-41菌株(最大含量為52.59 mg/L)的121.16%。

    3 討論與結(jié)論

    通過篩選實驗室構(gòu)建的983株的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫,獲得1株編號為62紅曲霉轉(zhuǎn)化子,從搖瓶、發(fā)酵罐發(fā)酵的生長及代謝產(chǎn)物動態(tài)變化可以看出,轉(zhuǎn)化子62紅曲色素產(chǎn)量穩(wěn)定高于原始Mp-41菌株,而桔霉素穩(wěn)定低于原始Mp-41菌株。

    轉(zhuǎn)化子62搖瓶中紅曲色素色價為95.4 U/mL,5 L發(fā)酵罐中紅曲色素色價和桔霉素含量分別為120.76 U/mL,1.172 4 mg/L;紅曲色素色價是原始Mp-41菌株的1.5倍,桔霉素僅為原始Mp-41菌株的35.08%;轉(zhuǎn)化子62的其他有益代謝產(chǎn)物如莫納可林K也高于原始Mp-41菌株,為63.72 mg/L,是原始Mp-41菌株的121.16%;生長速度相對較快,菌絲生長量高于原始Mp-41菌株。表明利用ATMT法培育的轉(zhuǎn)化子62性狀優(yōu)于原始Mp-41菌株,并能穩(wěn)定遺傳,用T-DNA插入突變的方法對紅曲霉進行育種是可行的。

    [1]施安輝.紅曲霉、紅曲、培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵,2013(1):29-33.

    [2]秦江輝,周禮紅,胡開成,等.高產(chǎn)γ-氨基丁酸的紅曲霉菌株選育[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(3):320-322.

    [3]劉穎,林風(fēng),鄭軍榮,等.低桔霉素且產(chǎn)Monacolin K紅曲菌株的篩選與鑒定[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,44(5):456-461.

    [4]Chen G,Shi K,Song D,et al.The pigment characteristics and productivity shifting in high cell density culture of Monascus anka mycelia[J].BMCBiotechnology,2015,15:72-76.

    [5]Hardeep S,Tuli P C,Vikas B,et al.Microbial pigments as natural color sources:current trends and future perspectives[J].Journal of Food Science and Technology,2015,52(8):4669-4678.

    [6]FengY,ShaoY,Chen F.Monascus pigments[J].Applied Microbiologyand Biotechnology,2012,96:1421-1440.

    [7]侯敏,王艷新,唐帥,等.不同碳源、氮源對紅曲發(fā)酵產(chǎn)色素的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)2015,43(9):1119-1122.

    [8]付榮霞,崔艷,楊樹成,等.紅曲霉液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(7):130-133.

    [9]李慧,蘭時樂.紅曲霉液體深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(19):6360-6363.

    [10]Blanc P J,Loret M O,Gomam G.Production of citrinin by various species of Monascus[J].Biotechnology Letters,1995,17(3):291-294.

    [11]吉小鳳,周育,徐俊鋒,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定固態(tài)紅曲米(粉)中橘青霉素[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,27(5):841-847.

    [12]楊建,胡川,陳瑤,等.采用響應(yīng)面優(yōu)化紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)高色價低桔霉素培養(yǎng)基的研究[J].中國調(diào)味品,2015,40(8):39-42.

    [13]Feng Y L,Shao Y C,Zhou Y X,et al.Effects of glycerol on pigments and monacolin K production by the high monacolin K producing but citrinin free strain Monascus pilosus MS-1[J].European Food Research and Technology,2015,240:635-643.

    [14]付桂明,許楊,李燕萍,等.產(chǎn)毒紅曲菌中生物合成桔霉素基因-pksCT基因的保守性分析[J].食品科學(xué),2008,29(3):359-363.

    [15]邵彥春,李利,楊莎,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的定點敲除技術(shù)在紅色紅曲菌中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報,2009,36(2):231-237.

    [16]胡偉蓮,戴德慧.紅曲霉MY9原生質(zhì)體誘變育種及遺傳穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(18):78-81.

    [17]Kalaivani M,Rajasekaran A.Improvement of monacolin K/citrinin production ratio in Monascus purpureus using UV mutagenesis[J]. Nutrafoods,2014,13(2):79-84.

    [18]Balakrishnan B,Karki S,Chiu S H,et al.Genetic localization and in vivo characterization of a Monascus azaphilone pigment biosynthetic gene cluster[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(14):6337-6345.

    [19]蔡琪敏,蔣冬花,嵇豪,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫色紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志,2010,30(5):68-73.

    [20]曹麗凌,齊育平,梁帥帥,等.兩株紫色紅曲菌根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,36(2):217-223.

    Screening Monascus Ttransformant of Higher Yield Monascus Pigment with Lower Citrinin and Its Fermented Products Analysis

    XUChu-xuan,RENHao,ZHANGTing,F(xiàn)ENGQing-qing,WUQiao-yu,JIANGDong-hua
    (College ofChemistryand Life Science,ZhejiangNormal University,Jinhua 321004,China)

    The Monascus purpureus strain Mp-41 isolated from red yeast rice was used as the original strain for transformation. T-DNA insertion mutation library of M.purpureus strain Mp-41 which contained 983 transformants was established by Agrobacterium fumefaciens-mediated transformation(ATMT)technology.When all transformants incubated in improved PD broths,the fermentation broths were analyzed for production of Monascus pigment and citrinin by using UV visible spectrophotometer and HPLC.10 transformants were found the yield ofMonascus pigment significant higher than that oforiginal strain Mp-41.The production ofMonascus pigment by transformant strain 62(95.4 U/mL)was 1.88 higher than that of the original strain Mp-41(50.7 U/mL),and the yield of citrinin was lower than that of strain Mp-41 stably.Timing sampling and analysis by HPLC for fermentation broth by original strain Mp-41 and transformant 62 in 5 L fermenter,it indicated that the growth rate of transformant 62 was faster than original strain Mp-41, the production ofMonascus pigment,Monacolin Kwere 120.76 U/mL,63.72 mg/L,higher(1.5 and 1.21 times)than that oforiginal strain Mp-41,the yield of citrinin was 1.172 4 mg/L,lower(only 35.08%)than original strain Mp-41 respectively.As a result,breeding Monascus strain by the way of ATMT could generate into stably heredity,the protection and application of Monascus resource had a certain potential.

    Monascus purpureus;Monascus pigment;citrinin;fermentation;T-DNA

    Q785

    A

    1002-2481(2016)03-0318-05

    10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.12

    2015-11-19

    國家自然科學(xué)基金項目(31270061;31570013)

    許楚旋(1996-),女,浙江金華人,在校學(xué)生,研究方向:應(yīng)用微生物。蔣冬花為通信作者。

    猜你喜歡
    色價紅曲發(fā)酵罐
    餐廚廢水和固渣厭氧發(fā)酵試驗研究
    紅曲黃色素的研究進展
    發(fā)酵罐不銹鋼換熱盤管泄漏失效分析
    藥食兩用話紅曲
    中老年保健(2020年5期)2020-12-11 01:16:06
    高色價紅曲米液態(tài)制種的培養(yǎng)條件優(yōu)化
    梔子黃色素提取工藝及品質(zhì)評價
    紅曲黃色素的多樣性及產(chǎn)品標準的討論
    果膠酶法提取紫甘藍花青素工藝條件研究
    利用計算流體力學(xué)技術(shù)分析啤酒發(fā)酵罐構(gòu)型對溫度和流動的影響
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    麻豆av噜噜一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av福利一区| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩强制内射视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 中文字幕制服av| 黄色欧美视频在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 不卡视频在线观看欧美| 精品熟女少妇av免费看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 国产老妇女一区| 日韩国内少妇激情av| 中文字幕久久专区| 精品久久久噜噜| 99热这里只有是精品50| 国产成人a区在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 变态另类丝袜制服| 97热精品久久久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产免费男女视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 波野结衣二区三区在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 九色成人免费人妻av| av国产免费在线观看| 男人舔奶头视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久国产乱子免费精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品国产三级国产专区5o | 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久久久久成人| 美女大奶头视频| 国产视频首页在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 爱豆传媒免费全集在线观看| 我的老师免费观看完整版| 人人妻人人看人人澡| 日本黄色片子视频| 国产亚洲最大av| 91久久精品电影网| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国内精品宾馆在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女国产视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 成人美女网站在线观看视频| 身体一侧抽搐| 99在线人妻在线中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲美女视频黄频| 久久久久九九精品影院| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 身体一侧抽搐| 长腿黑丝高跟| 免费搜索国产男女视频| 亚洲高清免费不卡视频| 日本五十路高清| 亚洲国产精品合色在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 毛片女人毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91狼人影院| 亚洲在久久综合| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久a久久爽久久v久久| 看黄色毛片网站| 午夜福利在线在线| 视频中文字幕在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 三级经典国产精品| 色吧在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 99热精品在线国产| 亚洲av中文av极速乱| 91久久精品国产一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 内射极品少妇av片p| 色噜噜av男人的天堂激情| 男女视频在线观看网站免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产免费福利视频在线观看| 精品久久国产蜜桃| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美清纯卡通| 丰满乱子伦码专区| 深夜a级毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩强制内射视频| 国产亚洲最大av| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av一区综合| 欧美成人a在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清毛片免费看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 丝袜美腿在线中文| 99热这里只有是精品50| 2022亚洲国产成人精品| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲第一区二区三区不卡| 99在线人妻在线中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 女人久久www免费人成看片 | 九九爱精品视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 日韩成人av中文字幕在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日韩欧美精品免费久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 丝袜喷水一区| 人体艺术视频欧美日本| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产男人的电影天堂91| 嫩草影院精品99| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产av一区在线观看免费| 久久精品91蜜桃| 国产黄a三级三级三级人| 国产视频内射| 在线a可以看的网站| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久性生活片| 波野结衣二区三区在线| 色哟哟·www| 日本黄色片子视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久精品影院6| 桃色一区二区三区在线观看| 波野结衣二区三区在线| 高清av免费在线| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 成年av动漫网址| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩高清综合在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 少妇丰满av| 春色校园在线视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品,欧美在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 成人毛片a级毛片在线播放| 成人漫画全彩无遮挡| 成年av动漫网址| 1000部很黄的大片| 日日摸夜夜添夜夜爱| av在线老鸭窝| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 一区二区三区乱码不卡18| 国产淫语在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲四区av| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产熟女欧美一区二区| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品永久免费网站| 国产极品天堂在线| 97热精品久久久久久| 波多野结衣巨乳人妻| 少妇丰满av| 亚洲国产色片| 日本熟妇午夜| 国产成年人精品一区二区| 三级国产精品片| 色网站视频免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 1000部很黄的大片| 69人妻影院| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久99蜜桃精品久久| 一区二区三区乱码不卡18| 在线播放无遮挡| 亚洲av.av天堂| 三级国产精品片| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产精品久久久久久av不卡| 看黄色毛片网站| www.色视频.com| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 天天躁日日操中文字幕| 赤兔流量卡办理| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品国产露脸久久av麻豆 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 18+在线观看网站| 99久久精品热视频| 干丝袜人妻中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 美女内射精品一级片tv| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 嘟嘟电影网在线观看| 1000部很黄的大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 97超碰精品成人国产| 久久99热这里只有精品18| 久久人人爽人人片av| 国产老妇女一区| 久久综合国产亚洲精品| 秋霞伦理黄片| 国产精品,欧美在线| 免费看av在线观看网站| 在线观看av片永久免费下载| 一区二区三区乱码不卡18| 赤兔流量卡办理| 村上凉子中文字幕在线| 五月玫瑰六月丁香| 成人亚洲欧美一区二区av| 91久久精品电影网| 国产av不卡久久| 午夜福利在线观看吧| 99久久成人亚洲精品观看| 成年女人看的毛片在线观看| 有码 亚洲区| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久欧美国产精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文欧美无线码| 亚洲国产精品专区欧美| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产av在哪里看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产毛片a区久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 老女人水多毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 久99久视频精品免费| 一个人看的www免费观看视频| 中国国产av一级| 国产色爽女视频免费观看| 日韩中字成人| 国产精品一二三区在线看| 一级黄色大片毛片| 视频中文字幕在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人二区视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | av国产久精品久网站免费入址| 亚洲,欧美,日韩| 国产黄a三级三级三级人| 在线播放国产精品三级| 3wmmmm亚洲av在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 日本免费一区二区三区高清不卡| videossex国产| 麻豆成人av视频| 少妇的逼好多水| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人av在线播放网站| 99视频精品全部免费 在线| 国产高清有码在线观看视频| 特级一级黄色大片| 舔av片在线| 联通29元200g的流量卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美极品一区二区三区四区| 日本色播在线视频| 女人被狂操c到高潮| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久九九精品影院| 老司机影院毛片| 亚洲av一区综合| 中文字幕av在线有码专区| 欧美精品国产亚洲| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久久久久黄片| 乱码一卡2卡4卡精品| 深夜a级毛片| 一级黄片播放器| 91久久精品电影网| 亚洲国产色片| 国产探花在线观看一区二区| 久久久成人免费电影| 亚洲av不卡在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人性生交大片免费视频hd| 国产免费福利视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久久久久久免费av| 久久99热这里只频精品6学生 | 亚洲18禁久久av| 亚洲国产精品国产精品| 少妇丰满av| 久热久热在线精品观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇熟女欧美另类| 神马国产精品三级电影在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 成人毛片a级毛片在线播放| 禁无遮挡网站| 大话2 男鬼变身卡| 97热精品久久久久久| 久久这里有精品视频免费| 日本黄大片高清| 高清视频免费观看一区二区 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧美精品专区久久| 一个人免费在线观看电影| 免费看av在线观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久国产成人免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美日韩在线观看h| 精品久久久久久久末码| 国产淫语在线视频| 免费观看a级毛片全部| 大香蕉97超碰在线| 国产免费男女视频| 少妇的逼好多水| av黄色大香蕉| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲国产色片| 在线观看66精品国产| 精品午夜福利在线看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产三级在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品,欧美在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 看免费成人av毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 狠狠狠狠99中文字幕| av黄色大香蕉| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av成人av| 成人av在线播放网站| 国产伦在线观看视频一区| 国产高清视频在线观看网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲美女视频黄频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 日本五十路高清| 国产成人aa在线观看| 欧美三级亚洲精品| 99久久精品国产国产毛片| 免费av不卡在线播放| 欧美激情在线99| 欧美人与善性xxx| 淫秽高清视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| av在线天堂中文字幕| 赤兔流量卡办理| 变态另类丝袜制服| 国产探花在线观看一区二区| 国产av不卡久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av成人av| 联通29元200g的流量卡| 国国产精品蜜臀av免费| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品青青久久久久久| 69av精品久久久久久| 日韩欧美国产在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 高清在线视频一区二区三区 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲性久久影院| 男女国产视频网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩精品有码人妻一区| 1024手机看黄色片| 久久久欧美国产精品| 国产精品国产三级专区第一集| 校园人妻丝袜中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美精品一区二区大全| 嫩草影院新地址| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 69av精品久久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 美女黄网站色视频| 国产69精品久久久久777片| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久久伊人网av| 日韩亚洲欧美综合| 麻豆成人av视频| 国产高清国产精品国产三级 | 18+在线观看网站| 午夜日本视频在线| 国产男人的电影天堂91| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 免费看光身美女| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| АⅤ资源中文在线天堂| 中文字幕亚洲精品专区| 在线天堂最新版资源| 深爱激情五月婷婷| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人91sexporn| 国产在视频线在精品| 高清日韩中文字幕在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲,欧美,日韩| 国产成人a∨麻豆精品| 国产熟女欧美一区二区| 简卡轻食公司| 国产av在哪里看| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲国产精品专区欧美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人福利小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 熟女电影av网| 51国产日韩欧美| 国产精品福利在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 午夜视频国产福利| 日日干狠狠操夜夜爽| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久国内精品自在自线图片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久国产成人精品二区| 日韩精品有码人妻一区| 欧美97在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 内射极品少妇av片p| 两个人视频免费观看高清| 最近中文字幕2019免费版| 精品人妻熟女av久视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产av一区在线观看免费| 床上黄色一级片| 内射极品少妇av片p| 午夜老司机福利剧场| 精品人妻偷拍中文字幕| 少妇熟女欧美另类| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av福利一区| 国产午夜精品论理片| 美女内射精品一级片tv| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品一及| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人a∨麻豆精品| 插逼视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| 特级一级黄色大片| 亚洲欧美日韩东京热| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产久久久一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 国内精品宾馆在线| 两个人的视频大全免费| 丰满少妇做爰视频| 亚洲成av人片在线播放无| 有码 亚洲区| 中文字幕av在线有码专区| 久久亚洲精品不卡| 99热这里只有是精品在线观看| 免费看a级黄色片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 网址你懂的国产日韩在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美精品免费久久| 欧美三级亚洲精品| 国产精华一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 能在线免费观看的黄片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品国产亚洲网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产黄色视频一区二区在线观看 | 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线免费观看不下载黄p国产| 22中文网久久字幕| 午夜激情福利司机影院| 2021天堂中文幕一二区在线观| 干丝袜人妻中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲精品一区蜜桃| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇的逼好多水| 午夜免费男女啪啪视频观看| 激情 狠狠 欧美| 一个人看视频在线观看www免费| 免费观看性生交大片5| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜免费激情av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜福利成人在线免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产伦在线观看视频一区| 一区二区三区四区激情视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 水蜜桃什么品种好| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 久久99热这里只有精品18| 天堂网av新在线| 淫秽高清视频在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 九九热线精品视视频播放| 欧美高清成人免费视频www| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 综合色丁香网| av线在线观看网站| 老司机影院毛片| 久久午夜福利片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久色成人| 日韩av不卡免费在线播放| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲av.av天堂| 精品国内亚洲2022精品成人| 色哟哟·www| 免费人成在线观看视频色| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美日本视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 天天躁日日操中文字幕| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 精品人妻视频免费看| 久久久久久久久久久丰满| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 看片在线看免费视频| 免费看美女性在线毛片视频| 国产免费一级a男人的天堂| 内地一区二区视频在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99久久人妻综合| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 我的老师免费观看完整版| 国产精品永久免费网站| 观看美女的网站| 日韩人妻高清精品专区| 最近最新中文字幕大全电影3| 一区二区三区四区激情视频| 波多野结衣高清无吗| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美zozozo另类| 免费看a级黄色片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 69av精品久久久久久| 国产精品国产三级专区第一集| 午夜精品一区二区三区免费看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美潮喷喷水| 男插女下体视频免费在线播放|