5-氟尿嘧啶與腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍制劑的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)抗腫瘤活性

劉廣宣，趙茜，隋月，關(guān)丁越，孫博，朱丹彤，齊先福

(遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng)110042)

5-氟尿嘧啶與腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍制劑的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)抗腫瘤活性

劉廣宣，趙茜，隋月，關(guān)丁越，孫博，朱丹彤，齊先福

(遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng)110042)

目的 觀察5-氟尿嘧啶(5-Fu)與腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍制劑(簡(jiǎn)稱(chēng)5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液)的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)抗腫瘤活性，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 配制空白腸外營(yíng)養(yǎng)液及5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液，室溫條件下觀察配制24 h內(nèi)兩種營(yíng)養(yǎng)液的外觀、脂肪乳微粒的平均粒徑及變異系數(shù)、pH值、滲透壓，采用高效液相色譜分析法分析5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液中5-Fu含量的穩(wěn)定性。將小鼠肝癌細(xì)胞H22瘤株接種于小鼠，制備移植性實(shí)體瘤模型。接種第3天將小鼠隨機(jī)分為5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及對(duì)照組，每組10只。前三組分別腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液，后三組分別腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理鹽水注射液及等量的空白腸外營(yíng)養(yǎng)液、生理鹽水，均隔天給藥1次，共給藥5次。末次給藥結(jié)束第2天處死小鼠，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液與空白腸外營(yíng)養(yǎng)液配制24 h內(nèi)外觀、脂肪乳微粒的平均粒徑及變異系數(shù)、pH值、滲透壓和含量均無(wú)明顯變化(P均>0.05)。5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN組抑瘤率分別為24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，組間比較P均<0.01；5-FU-TPN-H組藥物毒性較大，給藥過(guò)程中死亡6只，未統(tǒng)計(jì)抑瘤率。結(jié)論 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液配制24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，抗腫瘤活性較單獨(dú)給予5-Fu提高。

5-氟尿嘧啶；腸外營(yíng)養(yǎng)液；配伍；抑瘤率；小鼠

研究顯示，約52%的惡性腫瘤患者伴有中度或重度營(yíng)養(yǎng)不良[1]，90%以上的患者需要改善營(yíng)養(yǎng)狀況。全胃腸外營(yíng)養(yǎng)(TPN)是從靜脈內(nèi)供給患者營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是手術(shù)前后及危重患者營(yíng)養(yǎng)支持的主要手段。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是消化系統(tǒng)腫瘤的首選化療藥物之一，通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期、干擾細(xì)胞基本生物合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。癌癥患者尤其是晚期癌癥患者常需要同時(shí)通過(guò)靜脈輸液給予化療藥物及腸外營(yíng)養(yǎng)液，但二者是否可以配伍及配伍后的抗腫瘤效果報(bào)道較少。2015年12月～2016年3月，我們觀察了5-Fu與腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍制劑(簡(jiǎn)稱(chēng)5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液)的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)抗腫瘤活性，旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1 材料與方法

1.1 材料 ①儀器：9110高效液相色譜儀，TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)，CPA124S電子天平，PHS-25C精密酸度計(jì)，Nicomp 380粒度測(cè)定儀，L-119A試管恒溫加熱儀，L-128氮吹濃縮儀。②試劑：5-Fu復(fù)方氨基酸注射液(15-HBC)，脂肪乳注射液，N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液，注射用水溶性維生素，注射用脂溶性維生素(Ⅱ)，注射用脂溶性維生素(Ⅱ)專(zhuān)用溶媒，多種微量元素注射液(Ⅱ)，硫酸鎂注射液，葡萄糖酸鈣注射液，葡糖糖注射液，復(fù)合磷酸氫鉀注射液，胰島素注射液。③動(dòng)物：昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄不限，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK2015-0001。細(xì)胞株：小鼠肝癌H22細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液制備 先制備空白腸外營(yíng)養(yǎng)液：將生理鹽水1 000 mL充入營(yíng)養(yǎng)袋；將硫酸鎂注射液、氯化鉀注射液、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液、多種微量元素注射液(Ⅱ)、葡萄糖酸鈣注射液依次加入復(fù)方氨基酸注射液中混勻，一并充入營(yíng)養(yǎng)袋；將50%葡萄糖注射液、胰島素注射液、復(fù)合磷酸氫鉀注射液依次加入10%葡萄糖注射液中，混勻，一并充入營(yíng)養(yǎng)袋；取注射用水溶解1支注射用脂溶性維生素(Ⅱ)，再將此溶液打入注射用水溶性維生素(1支)的安瓿中，最后抽取全部混合藥液加入脂肪乳中，混勻，一并充入營(yíng)養(yǎng)袋，再次混勻，即得空白營(yíng)養(yǎng)液。按此法平行配制空白營(yíng)養(yǎng)液6份。制備5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液：采用空白腸外營(yíng)養(yǎng)液將規(guī)格為250 mg/10 mL的5-Fu注射液進(jìn)行12.5倍稀釋?zhuān)玫胶?0 mg/mL 5-Fu的腸外營(yíng)養(yǎng)液。按此法平行配制6份。

1.3 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 理化性質(zhì) 室溫條件下觀察空白腸外營(yíng)養(yǎng)液及5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液的外觀；分別于配制0、2、4、6、8、10、12、16、24 h時(shí)對(duì)兩種營(yíng)養(yǎng)液采樣，采用Nicomp 380粒度檢測(cè)儀測(cè)定脂肪乳微粒的平均粒徑(MD)及粒徑變異系數(shù)(CV)，采用pH計(jì)測(cè)定pH值，采用滲透壓測(cè)定儀測(cè)量滲透壓。

1.3.2 5-Fu含量的穩(wěn)定性及回收率 采用高效液相色譜分析法。色譜柱：Venusil ASB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)-甲醇(95∶5)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。取5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液6份，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖，計(jì)算5-Fu含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；取5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液3份，分別精密加入120.00 μg/mL甲硝唑?qū)φ找?.8、2.2、2.6 mL，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖，計(jì)算樣品平均回收率。1.3.3 抗腫瘤作用 液氮中取出保種的小鼠肝癌H22細(xì)胞凍存管，迅速置于37 ℃溫水中復(fù)蘇。將復(fù)蘇的H22細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔內(nèi)，接種7天后無(wú)菌條件下抽取乳白色黏稠腹水，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，腫瘤細(xì)胞活度>95%時(shí)調(diào)整瘤細(xì)胞密度為2.0×107個(gè)/mL。將腫瘤細(xì)胞混懸液接種于60只昆明種小鼠右前腋下皮下組織(0.2 mL/只)，建立腫瘤模型。于接種第3天將小鼠隨機(jī)分為5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及對(duì)照組，每組10只，前三組分別腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液，后三組分別腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理鹽水注射液及等量的空白腸外營(yíng)養(yǎng)液、生理鹽水，均隔天給藥1次，共給藥5次。末次給藥結(jié)束第2天處死小鼠，完整剝離皮下瘤結(jié)節(jié)，稱(chēng)取質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液的理化性質(zhì) 配制24h內(nèi)，5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液及空白腸外營(yíng)養(yǎng)液外觀均為乳白色液體，未見(jiàn)分層、渾濁和沉淀等變化。配制0、2、4、6、8、10、12、16、24h時(shí)兩種液體脂肪乳微粒的MD、CV及pH值、滲透壓均無(wú)明顯變化(P均>0.05)，且CV均<0.5，pH值均為5.0～6.6，滲透壓均<900mOsm/L。見(jiàn)表1。

表1 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液及空白腸外營(yíng)養(yǎng)液配制各時(shí)間點(diǎn)MD、CV、pH值及滲透壓

2.2 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液中5-Fu的穩(wěn)定性及回收率 6份5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液中5-Fu含量分別為99.33%、100.80%、100.25%、100.34%、99.67%、98.91%，RSD為0.71%(<2%)，說(shuō)明樣品制備方法重復(fù)性好。3份5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液平均回收率分別為102.68%、99.45%、101.12%，回收率較好。

2.3 5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液的抗腫瘤作用 5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN組抑瘤率分別為24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，組間比較P均<0.01；5-FU-TPN-H組毒性較大，給藥過(guò)程中死亡6只，未統(tǒng)計(jì)抑瘤率。見(jiàn)表2。

表2 各組腫瘤質(zhì)量及抑瘤率

3 討論

TPN是指由胃腸外途徑(通常是靜脈)供給機(jī)體足夠的蛋白質(zhì)(氨基酸)、脂肪、糖類(lèi)、維生素、微量元素、電解質(zhì)和水分等，因其所含組分較多，通常單獨(dú)輸注，理論上不宜與其他藥物混合使用，但為方便臨床和減少對(duì)患者的損傷，已有西咪替丁、法莫替丁和甲硝唑等藥物與腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍的報(bào)道[2～6]。本研究結(jié)果顯示，5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液配制24 h內(nèi)其外觀、脂肪乳粒徑大小及分布、pH值、滲透壓、含量均無(wú)顯著性變化，與空白腸外營(yíng)養(yǎng)液5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液性質(zhì)較穩(wěn)定，5-Fu未對(duì)腸外營(yíng)養(yǎng)液理化性質(zhì)造成明顯影響。

本研究選取小鼠肝癌H22細(xì)胞進(jìn)行抑瘤效果觀察，因H22細(xì)胞便于小鼠接種，易于造模，且H22對(duì)5-Fu相對(duì)敏感。結(jié)果顯示， 5-FU-TPN-M、5-FU-NS組抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN組，且5-FU-TPN-M組高于5-FU-NS組，含65 mg/kg 5-Fu的5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液抑瘤率高于5-Fu單獨(dú)給藥組。上述結(jié)果產(chǎn)生原因可能為：①5-Fu主要針對(duì)增殖期腫瘤細(xì)胞，難以對(duì)休止期(G0期)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，而化療過(guò)程中大部分腫瘤細(xì)胞處于G0期(G0期細(xì)胞對(duì)潛在的致死損傷有較強(qiáng)的修復(fù)能力，往往是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源)。有研究認(rèn)為，營(yíng)養(yǎng)支持能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和發(fā)展，促進(jìn)G0期腫瘤細(xì)胞進(jìn)入增殖期，從而提高化療敏感性，達(dá)到提高化療療效的目的[7]。Wang等[8]建立了裸鼠食管癌模型，發(fā)現(xiàn)胰島素與化療藥聯(lián)用能達(dá)到增效、不增加毒性的目的。腸外營(yíng)養(yǎng)液中所含胰島素可能是5-Fu抗腫瘤活性增加的原因。②另有觀點(diǎn)認(rèn)為，腸外營(yíng)養(yǎng)液通過(guò)提高機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。腸外營(yíng)養(yǎng)液中含有的精氨酸組分具有組織特異性免疫刺激作用，藥理劑量的精氨酸可明顯改善機(jī)體的免疫功能，其作用機(jī)制主要為增加T淋巴細(xì)胞對(duì)刀豆素A(ConA)和植物血球凝集素(PHA)的反應(yīng)性，增加CD4+細(xì)胞數(shù)量；提高外周血NK細(xì)胞數(shù)量、NK細(xì)胞活性及LAK細(xì)胞活性，促進(jìn)IL-2產(chǎn)生，增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)IL-2R表達(dá)[10]。此外，谷氨酰胺亦是腸外營(yíng)養(yǎng)液中的常見(jiàn)成分，在各種組織中其均為重要的氮源和能量來(lái)源，可直接供能于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生及吞噬細(xì)胞等的殺傷作用而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。谷氨酰胺能促進(jìn)谷胱甘肽的合成，通過(guò)維持抗氧化系統(tǒng)功能而參與對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)[11,12]。③腸外營(yíng)養(yǎng)液中含有鉻、銅、鐵、錳、鉬、硒、鋅等多種微量元素，其中鋅可通過(guò)激活p53及caspase通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]；硒可調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，修飾p53的氨基酸殘基位點(diǎn)；通過(guò)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的連接蛋白如絲裂原蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[14～16]。此外，藥理學(xué)研究表明，金屬離子與具有生物活性的有機(jī)配體結(jié)合后，通過(guò)配體與金屬離子之間的協(xié)同作用使藥效得到增強(qiáng)。5-Fu可能與銅、鐵、鋅等金屬離子形成配合物，生成Cu(5-Fu)2Cl2、Cu(5-Fu)2(NO3)2、Zn(5-Fu)2Cl2和Fe(5-Fu)3SO4等配合物，進(jìn)而增強(qiáng)其療效[17,18]。

綜上所述，5-Fu腸外營(yíng)養(yǎng)液配伍24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，且抗腫瘤活性增強(qiáng)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-Fu mixed with parenteral nutrition solution

LIUGuangxuan,ZHAOQian,SUIYue,GUANDingyue,SUNBo,ZHUDantong,QIXianfu

(LiaoningCancerHospital,Shenyang110042,China)

Objective To observe the compatible stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-fluorouracil (5-Fu) mixed with total parenteral nutrition (TPN) solution (5-Fu and TPN solution) and to provide the basis for its clinical application. Methods The blank parenteral nutrition solution and 5-Fu and TPN solution were mixed at room temperature for 24 h. The appearances were observed and the mean diameter (MD) and coefficient of variation (CV) of fat particles, pH value and osmotic pressure was evaluated. The stability of 5-Fu in the 5-Fu and TPN solution was determined by HPLC. The H22 transplanted models of mice were established. Sixty mice were divided into six groups: 5-FU-TPN-L (30 mg/kg), 5-FU-TPN-M (65 mg/kg), 5-FU-TPN-H (130 mg/kg), 5-FU-NS (65 mg/kg), TPN and the control group, each group had 10 mice. On the day 3 after being inoculated with H22 tumor cells, the mice in the six groups were intraperitoneally injected with the above six kinds of liquids, separately, once every other day for 5 times. On day 2 after the last administration, mice were killed and antitumor rate was calculated. Results Compared with the blank parenteral nutrition solution, there were no significant changes in the appearances, MD, CV, pH value, osmotic pressure and the contents of 5-Fu within 24 h of 5-Fu and TPN solution (allP>0.05). The antitumor rates of the 5-FU-TPN-L, 5-FU-TPN-M, 5-FU-NS, and TPN groups were 24.3%, 91.8%, 78.7% and 14.6%, the antitumor rate of the 5-FU-TPN-M and 5-FU-NS groups were higher than those of the 5-FU-TPN-L and TPN groups, and the antitumor rate of 5-FU-TPN-M group was higher than that of the 5-FU-NS group, significant difference was found between every two groups (allP<0.01). The toxicity of 5-FU-TPN-H was strong, and 6 mice died, so no statistics were carried out. Conclusion 5-Fu in TPN solution is stable within 24 h and the antitumor effect of 5-Fu at 65 mg/mL is better than single administration of 5-Fu.

5-fluorouracil; parenteral nutrition solutions; compatibility; antitumor rate; mice

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2103020186)。

劉廣宣(1963-)，男，主任藥師，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。E-mail: guangxuan2004@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.003

R979.1

A

1002-266X(2016)44-0008-04

2016-03-12)