2型糖尿病患者骨骼肌乙酰CoA羧化酶的表達(dá)及活性研究

胡淑國(guó)，王麗慧，宋光耀，楊 洋，宋國(guó)橋，常 湛

(1.河北省石家莊市第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 050051；2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科/河北省內(nèi)分泌代謝病研究所，石家莊 050000；3.河北省石家莊市第二醫(yī)院骨科 050051)

2型糖尿病患者骨骼肌乙酰CoA羧化酶的表達(dá)及活性研究

胡淑國(guó)1，王麗慧1，宋光耀2，楊 洋1，宋國(guó)橋3，常 湛1

(1.河北省石家莊市第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 050051；2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科/河北省內(nèi)分泌代謝病研究所，石家莊 050000；3.河北省石家莊市第二醫(yī)院骨科 050051)

目的 觀察2型糖尿病患者骨骼肌乙酰CoA羧化酶(ACC)的表達(dá)和活性的變化，探討其在骨骼肌脂質(zhì)堆積和胰島素抵抗中的作用。方法 于2012年6月至2013年6月在石家莊市第二醫(yī)院骨科住院擇期行髖關(guān)節(jié)及下肢手術(shù)患者中，選取2型糖尿病病程5年之內(nèi)的患者10例為糖尿病組(DM組)，另選取10例非糖尿病者為對(duì)照組(NC組)。采集靜脈血檢測(cè)空腹血糖(FBG)、血脂、游離脂肪酸(FFA)等,計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)(ISI)。骨科手術(shù)中留取骨骼肌標(biāo)本，測(cè)定骨骼肌三酰甘油(TG)、總的長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A(LCACoA)水平。骨骼肌ACC、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(P-ACC)蛋白表達(dá)用蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)測(cè)定。結(jié)果DM組FBG、空腹胰島素(FINS)、FFA及血清TG水平高于NC組(P<0.05)，而ISI低于NC組(P<0.01)。DM組骨骼肌TG及LCACoA水平高于NC組(P<0.05)。兩組骨骼肌ACC蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DM組骨骼肌P-ACC蛋白水平低于NC組(P<0.05)。結(jié)論ACC活性的改變可能在2型糖尿病患者骨骼肌脂質(zhì)堆積和胰島素抵抗發(fā)生中起了一定作用。

糖尿病，2型；胰島素抗藥性；肌，骨骼；脂肪酸類；乙酰CoA羧化酶

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制之一。骨骼肌是胰島素的主要靶組織，是機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)攝取和利用的重要器官。一些動(dòng)物研究表明，骨骼肌脂肪酸代謝異常導(dǎo)致脂質(zhì)堆積與IR密切相關(guān)，而骨骼肌丙二酰CoA(malonyl-CoA,MCA)是脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。MCA水平通過乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的合成及丙二酰CoA脫羧酶(malonyl-CoA decarboxylase,MCD)的降解而調(diào)節(jié)[1]。因此，ACC在骨骼肌脂肪酸代謝方面起了非常重要的作用。2型糖尿病患者IR的發(fā)生是否與骨骼肌ACC表達(dá)及活性的改變導(dǎo)致組織脂質(zhì)堆積有關(guān)，尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究選取以IR為發(fā)病機(jī)制之一的2型糖尿病患者為研究對(duì)象，觀察2型糖尿病患者骨骼肌脂肪酸代謝及ACC表達(dá)及活性的變化，探討ACC在骨骼肌脂質(zhì)堆積和IR中的作用。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者血漿代謝參數(shù)及胰島素敏感性的比較

1 資料與方法

1．1 一般資料 于2012年6月至2013年6月在石家莊市第二醫(yī)院骨科住院擇期行髖關(guān)節(jié)及下肢手術(shù)患者中，選取2型糖尿病病程5年之內(nèi)的患者10例為糖尿病組(DM組)，其中男6例，女4例，年齡40～68歲。另選取10例非糖尿病者為對(duì)照組(NC組)，男7例，女3例，年齡40～70歲。研究獲石家莊市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)口服二甲雙胍或(和)噻唑烷二酮類降糖藥物者；(2)糖尿病合并急性并發(fā)癥，所有受試者除外感染、發(fā)熱、外傷及其他內(nèi)分泌疾??；(3)高血壓、腦血管病、冠心病、慢性心功能不全及高尿酸血癥、乳糜血患者等；(4)近1周內(nèi)劇烈運(yùn)動(dòng)者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本留取 所有受試者經(jīng)過10 h過夜空腹，并休息20 min后由專人測(cè)量血壓，測(cè)量身高、體質(zhì)量并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。抽靜脈血測(cè)空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，并分離血清于-70 ℃保存，同批測(cè)定胰島素、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)和游離脂肪酸(FFA)等。骨科手術(shù)中留取骨骼肌標(biāo)本，迅速放入液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱保存待測(cè)，肌肉中TG、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A(long chain acyl-CoA,LCACoA)和骨骼肌ACC、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(P-ACC)的蛋白表達(dá)水平，ACC活性通過測(cè)定P-ACC蛋白表達(dá)水平來評(píng)價(jià)。

1.2.2 血液生化指標(biāo)、骨骼肌TG及LCACoAs水平測(cè)定 FBG用葡萄糖氧化酶法，HbA1c用高效液相色譜法，胰島素用放射免疫法，血清TG 和TC采用氧化酶法在Beckman X20全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定，F(xiàn)FA采用銅顯色法測(cè)定(南京建成生物試劑公司試劑盒)。胰島素敏感性指數(shù)(ISI)以FBG與胰島素乘積的倒數(shù)表示。骨骼肌TG經(jīng)氯仿/甲醇抽提后用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定骨骼肌總的LCACoAs水平，以每克肌肉組織所含的物質(zhì)的量表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)測(cè)定骨骼肌ACC和P-ACC蛋白表達(dá) 冷凍的骨骼肌標(biāo)本稱質(zhì)量，加入組織裂解液提取蛋白并定量。取30 μg進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%分離膠)分離蛋白后，用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后加入ACC和P-ACC多克隆抗體(購(gòu)于Santa Cruz公司及Cell signaling公司)4 ℃搖床過夜，洗膜后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(購(gòu)于北京中杉金橋生物公司)，室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。將顯色的PVDF膜在凝膠成像儀上照相，機(jī)載Labworks軟件分析。同樣的方法測(cè)定了GAPDH的蛋白表達(dá)。ACC和P-ACC蛋白表達(dá)結(jié)果用樣品中二者的積分吸光度值(IA值)與GAPDH的IA值的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床資料及血液生化指標(biāo)的比較 兩組患者年齡、BMI、血壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DM組HbA1c、FBG、空腹胰島素(FINS)、血清TG和FFA高于NC組(P<0.05)，兩組TC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而DM組ISI低于NC組(P<0.05)，見表1、2。

2.2 兩組患者骨骼肌TG、LCACoAs水平及骨骼肌ACC、P-ACC蛋白表達(dá)的比較DM組骨骼肌TG、LCACoAs水平均高于NC組(P<0.05)，見表3。骨骼肌ACC蛋白表達(dá)在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DM組骨骼肌P-ACC蛋白表達(dá)低于NC組(P<0.05)，見圖1、表4。

表3 兩組患者骨骼肌TG和LCACoAs水平比較

表4 兩組患者骨骼肌ACC和P-ACC的蛋白表達(dá)的比較

圖1 兩組患者骨骼肌ACC和P-ACC的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

IR是指肝臟、肌肉和脂肪等組織對(duì)胰島素生物效應(yīng)的反應(yīng)性下降,以葡萄糖和脂肪酸代謝異常為特征。有很多證據(jù)支持脂質(zhì)過度供應(yīng)和脂質(zhì)異位堆積是導(dǎo)致這些組織功能異常的常見原因。2型糖尿病是以IR為主要病理機(jī)制的疾病之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者和非糖尿病患者相比存在明顯的IR，除FBG、FINS升高之外，還存在血漿和骨骼肌脂肪酸代謝異常，如TG和FFA水平高于NC組。骨骼肌是葡萄糖代謝的重要組織及胰島素發(fā)揮作用的主要靶器官，本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者除血液中脂質(zhì)增高外，骨骼肌TG及LCACoAs水平也是增加的。脂質(zhì)貯存最安全的地方是白色脂肪組織，但是當(dāng)其貯存能力達(dá)到飽和后，過多的脂質(zhì)則堆積到骨骼肌、肝臟等非脂肪組織，引起細(xì)胞慢性功能失調(diào)和損傷，被稱為“脂毒性”[2]。 近年，脂毒性在IR發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。骨骼肌脂肪酸水平與IR的相關(guān)性在嚙齒動(dòng)物和人類都得到證實(shí)，但是骨骼肌脂質(zhì)堆積的具體機(jī)制還未完全闡明，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌脂肪酸氧化能力的降低和由此引起的脂質(zhì)堆積是IR的可能機(jī)制[3]。因此，2型糖尿病患者骨骼肌脂質(zhì)水平的增加也可能與骨骼肌細(xì)胞脂肪酸代謝的某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常有關(guān)。

近年研究認(rèn)為，ACC與脂肪酸代謝和IR有著密切的關(guān)系[4-6]。在骨骼肌表達(dá)的ACC通過其包含20個(gè)疏水氨基酸的獨(dú)特N末端附著于線粒體外膜表面，通過催化乙酰CoA羧化生成MCA。在線粒體表面合成的MCA作用于肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitinepalmitoyltransferase1,CPT-1)相應(yīng)結(jié)合區(qū)域并抑制CPT-1 的活性，從而抑制脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化[7]。因此，ACC通過調(diào)節(jié)細(xì)胞脂肪酸氧化可能影響骨骼肌脂質(zhì)水平，但這方面的研究多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究以2型糖尿病及非糖尿病個(gè)體為研究對(duì)象，探討糖尿病患者骨骼肌脂質(zhì)堆積的可能機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨骼肌ACC蛋白表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但P-ACC蛋白表達(dá)在DM組低于NC組。P-ACC代表ACC的非活性形式，說明2型糖尿病患者骨骼肌ACC活性升高，并且隨著ACC活性的增高，骨骼肌TG和LCACoAs水平明顯增加。由此推測(cè)，2型糖尿病患者骨骼肌ACC活性的增高可能通過增加其產(chǎn)物MCA水平而抑制了脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，導(dǎo)致組織脂質(zhì)堆積。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACC可能在2型糖尿病患者骨骼肌脂肪酸代謝方面起調(diào)節(jié)作用，為IR的治療提供了重要靶點(diǎn)。ACC基因敲除小鼠模型可進(jìn)一步驗(yàn)證ACC在脂肪酸代謝中的重要性。有研究發(fā)現(xiàn)，ACC2基因敲除小鼠表現(xiàn)出組織MCA水平的降低及骨骼肌脂肪酸氧化的增加[8]。此結(jié)果提示，如果能用某些藥物抑制ACC的活性可能增加骨骼肌脂肪酸氧化，減少骨骼肌脂質(zhì)堆積，降低脂毒性。作者前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮干預(yù)增加了IR大鼠骨骼肌P-ACC表達(dá),并且伴隨P-ACC表達(dá)增加(也就是ACC活性的下降)骨骼肌脂質(zhì)水平下降，胰島素敏感性提高。還需要在IR的患者中進(jìn)一步證實(shí)這些降糖藥的作用機(jī)制，進(jìn)而尋找新的ACC活性抑制劑，以達(dá)到減少骨骼肌脂質(zhì)堆積，改善IR的目的。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者骨骼肌TG和LCACoAs升高，存在著骨骼肌脂質(zhì)堆積和IR。ACC活性的增高可能通過增加其下游產(chǎn)物MCA水平影響了脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，在這些組織脂質(zhì)異位堆積的病理生理中起了一定作用。如果在2型糖尿病患者的治療中,以ACC為切入點(diǎn)，進(jìn)一步尋找ACC的抑制劑可能減少脂質(zhì)異位堆積，改善IR。還需擴(kuò)大病例數(shù)及在各種類型IR患者中進(jìn)一步研究證實(shí)ACC對(duì)脂肪酸代謝的影響。

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Study on the expression and activity of acetyl-coenzyme A carboxylase in skeletal muscle of patients with type 2 diabetes mellitus*

HuShuguo1,WangLihui1,SongGuangyao2,YangYang1,SongGuoqiao3,ChangZhan1

(1.DepartmentofEndocrinology,theSecondHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang,Hebei050051,China; 2.DepartmentofEndocrinology,HebeiPeople′sHospital/HebeiInstituteofEndocrineandMetabolicDiseases,Shijiazhuang,Hebei050000,China;3.DepartmentofOrthopedics,theSecondHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang,Hebei050051,China;)

Objective To observe the expression and activity of acetyl-COA carboxylase(ACC) in skeletal muscle and investigate its role in lipid accumulation in skeletal muscle and insulin resistance in type 2 diabetes.Methods A total of 20 cases with or without T2DM who received selective surgery between June 2013 and June 2014 were enrolled from department of orthopaedics.These patients were divided into two groups:DM group and NC group.Blood pressure was calculated and blood samples were drawn from an antecubial vein for measurement of plasma glucose,insulin,lipid and FFA.Insulin sensitivity index(ISI) was calculated.Skeletal muscle was frozen in liquid nitrogen during orthopaedics surgery and was kept at -70 ℃ until assay.The skeletal muscle samples were taken during surgery,and levels of triglyceride(TG) and LCACoAs in skeletal muscle tissues were detected.The expression of P-ACC(P-ACC,the phosphorylation state of ACC,which represented non-activity form of ACC) was used to assess ACC activity.The expression levels of ACC and P-ACC in skeletal muscle were measured by using SDS-PAGE and Western blotting techniques.The data of the two groups were compared witht-test.Results (1)Fasting blood glucose,fasting insulin(FINS),free fatty acid and TG were higher in the DM group than those in the NC group(allP<0.05).However,ISI was lower in the DM group than that in the NC group(-4.89±0.62vs. -3.67±049,P<0.01).(2)Skeletal muscle TG and LCACoAs were higher in DM group than those in NC group[(6.03±1.62) μmol/gvs.(4.49±1.63) μmol/g,(3.12±1.12 ) μmol/gvs.(2.13±0.96)μmol/g,allP<0.05].(3)No significant difference in protein level of ACC in skeletal muscle was detected between DM group and NC group(P>0.05).Protein level of P-ACC in skeletal muscle was decreased in DM group compared with NC group(0.49±0.10vs. 0.58±0.09,P<0.05).Conclusion Changes in ACC activity may play a role in the development of skeletal muscle lipid accumulation and insulin resistance in patients with type 2 diabetes mellitus.

diabetes mellitus,type 2;insulin resistance;muscle,skeletal;fatty acids;acetyl-CoA carboxylase

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(122777138)。 作者簡(jiǎn)介：胡淑國(guó)(1967-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事糖尿病及其慢性并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制及治療研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.015

R

A

1671-8348(2016)35-4945-03

2016-07-21

2016-09-16)