重慶地區(qū)腦卒中患者Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性研究

范 超，陳 鳴，鄧少麗，唱 凱

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科，重慶 400042)

重慶地區(qū)腦卒中患者Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性研究

范 超，陳 鳴，鄧少麗△，唱 凱

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科，重慶 400042)

目的 研究重慶地區(qū)腦卒中患者血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因多態(tài)性的分布。方法 選取2015年4～11月在該院神經(jīng)內(nèi)科住院并診斷為腦卒中的患者共292例，其中排除52例未檢測Hcy水平的患者，選取剩余的240例(男116例，女124例)作為本次研究對象。采用酶循環(huán)法檢測患者Hcy水平。提取患者全血DNA，采用基因芯片技術(shù)檢測其MTHFR C677T基因的多態(tài)性。結(jié)果 共檢測出3種不同的MTHFR基因型：C677C型、C677T型、T677T型，頻率分別為42.9%、44.2%、12.9%，其中C等位基因頻率為65%，T等位基因頻率為35%。CC基因型在男女之間的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，C等位基因在男性患者中的頻率明顯高于女性患者(P<0.05)。重慶地區(qū)與河南豫北地區(qū)腦卒中患者MTHFR C677C基因型與T677T基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TT型的Hcy水平與CC、CT型比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 重慶地區(qū)腦卒中患者MTHFR C677T基因存在多態(tài)性分布，且與河南豫北地區(qū)存在差異；MTHFR C677T基因多態(tài)性與Hcy水平相關(guān)，TT基因型的Hcy水平明顯高于CC、CT基因型。

卒中；同型半胱氨酸；亞甲基四氫葉酸還原酶；多態(tài)性，單核苷酸

腦卒中又叫腦血管意外，是指腦血管疾病的患者因各種誘發(fā)因素引起的腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性的腦功能障礙，具有高發(fā)病率、高病殘率、高病死率和高并發(fā)癥發(fā)生率等特點，嚴重危害人類健康。據(jù)文獻報道，我國每年新發(fā)腦卒中(1.50～2.00)×106例，病死率為(58～142)/10萬，是全國城鄉(xiāng)居民首要死亡原因，也是全球第二大死亡原因[1]。因此，近年來關(guān)于腦卒中病因、治療和預后等方面的研究一直是醫(yī)學領(lǐng)域的重點。

目前,高同型半胱氨酸血癥已被確認為是腦卒中的獨立危險因子[2]。同型半胱氨酸(Hcy)屬于含硫氨基酸,是蛋氨酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物。蛋氨酸代謝過程中所涉及的酶及因子缺乏發(fā)生缺陷時,均可導致高同型半胱氨酸血癥。N5,N10-亞甲四氫葉酸還原酶(MTHFR)為蛋氨酸代謝中的一個關(guān)鍵酶。MTHFR 基因突變是引起此酶缺乏或活性降低的主要機制,其中C677T 位堿基突變最常見[3]。目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于此研究的文獻報導，本文就重慶地區(qū)腦卒中患者Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性的分布進行如下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4～11月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院并診斷為腦卒中的患者共292例，腦卒中患者經(jīng)過頭顱磁共振成像(MRI)和(或)CT掃描明確診斷，符合1995年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準，并排除腦出血和占位性病變。排除其中52例沒有檢測Hcy水平的患者，選擇剩余的240例患者作為本次研究對象，其中男116例，女124例，年齡28～93歲。所有患者為無血緣關(guān)系的重慶漢族人。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 Hcy檢測儀器與試劑 美國貝克曼DXC800全自動生化分析儀，Hcy診斷試劑盒(循環(huán)酶法)。

1.2.2 MTHFR C677T基因檢測儀器與試劑 全血基因組DNA提取試劑盒、MTHFR C677T基因檢測試劑盒、e-Hyb全自動雜交儀、BE 2.0生物芯片識讀儀均為上海百傲科技有限公司產(chǎn)品，PCR儀，干式恒溫器，離心機，渦旋振蕩器等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 用紫頭管[乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝]采集患者清晨空腹靜脈血各2 mL，充分混勻，1 h內(nèi)送本院檢驗科生化室和分子生物室進行檢測。

1.3.2 血漿Hcy檢測 血漿Hcy采用循環(huán)酶法，其檢測原理為氧化型Hcy被轉(zhuǎn)化成游離Hcy，游離Hcy在胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化下和絲氨酸反應(yīng)生成L-胱硫醚。L-胱硫醚在胱硫醚-β-裂解酶(CBL)催化下又生成Hcy、丙酮酸和NH3。該循環(huán)反應(yīng)生成的丙酮酸可以用乳酸脫氫酶LDH和還原型輔酶Ⅰ(NADH)檢測到，NADH轉(zhuǎn)變成氧化型輔酶Ⅱ(NAD)的速率與樣品中Hcy水平成正比。

1.3.3 DNA提取 將紫頭管采集好的靜脈血2 mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。DNA樣品-20 ℃保存，凍融不超過3 次。

1.3.4 PCR擴增 將MTHFR擴增液分裝到0.2 mL PCR反應(yīng)管中，擴增反應(yīng)體系為25 μL，包括：MTHFR擴增液19 μL、反應(yīng)液1 μL、DNA模板5 μL。擴增條件：94 ℃預變性10 min;然后95 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。將擴增產(chǎn)物置于2～8 ℃保存。

1.3.5 雜交顯色 取出雜交顯色試劑盒，吸取10 μL加入雜交緩沖液瓶中混勻。臨用前取出1支抗體，低速離心，加入1 mL抗體稀釋液，振蕩混勻，制成抗體使用液。取出基因芯片，做好標記，將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，旋緊雜交艙蓋。將各試劑按要求分裝到2 mL離心管中，插入試管架中。取180 μL雜交緩沖液于離心管中，再分別加入10 μL擴增產(chǎn)物，混勻，放入試管架中。將試管架放入雜交儀中，運行雜交程序。取出芯片，放入生物芯片識讀儀中，用百傲基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，輸出檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 MTHFR C677T基因型檢測結(jié)果 MTHFR擴增產(chǎn)物經(jīng)基因芯片分析后各種基因型生物芯片識別圖，見圖1。

A：C677C基因型檢測結(jié)果圖；B：T677T基因型檢測結(jié)果圖;C：C677T基因型檢測結(jié)果圖。

圖1 MTHFR C677T基因型檢測結(jié)果

2.2 各基因型頻率及等位基因頻率 CC型(C677C)103例(42.9%)，CT型(C677T)106例(44.2%)，TT型(T677T)31例(12.9%)。其中C等位基因頻率為65%，T等位基因頻率為35%。CC基因型在男性患者與女性患者之間的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而CT型與TT型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C等位基因在男性患者的頻率明顯高于女性患者(P<0.05)。見表1。

表1 腦卒中患者MTHFR C677T基因

2.3 不同地區(qū)腦卒中患者MTHFR C677T基因多態(tài)性的比較 重慶地區(qū)與河南豫北地區(qū)腦卒中患者C677C基因型與T677T基因型的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而C677T基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 不同地區(qū)腦卒中患者MTHFR C677T基因多態(tài)性的比較[n(%)]

2.4 MTHFR C677T基因型與血漿Hcy水平的關(guān)系 TT型的Hcy水平與CC、CT型比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 3種不同MTHFR C677T基因型的血漿Hcy水平比較

3 討 論

腦血管疾病以其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率嚴重危害著人類的健康，是目前人類最常見的死因之一[5-6]。因此，探求腦血管病的病因及針對病因的治療預防措施是國內(nèi)外研究的重要課題。而基因突變是腦血管病的危險因素之一，因此腦血管疾病基因方面的研究對控制腦血管病的發(fā)病水平，探討基因診斷、治療及預防的措施都有非常重要的意義[7-8]。

近年來,高同型半胱氨酸血癥作為一種新的腦卒中獨立危險因素逐漸引起人們的重視。MTHFR是Hcy在人體內(nèi)代謝途徑中的關(guān)鍵酶,其水平不足或活性下降將直接導致Hcy在體內(nèi)的蓄積,引起高同型半胱氨酸血癥。有研究表明，C677T多態(tài)性引起的高同型半胱氨酸血癥可損傷內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，誘導內(nèi)皮細胞激活促凝因子，促進纖溶酶原激活物抑制劑的表達，從而促進血小板黏附聚集功能和組織因子活性，激活凝血酶Ⅴ、Ⅶ等，使機體處于高凝狀態(tài)，從而促進血栓形成[9-10]。本次研究共檢測出3種不同的MTHFR基因型別：C677C型、C677T型、T677T型，頻率分別為42.9%、44.2%、12.9%，其中C等位基因頻率為65%，T等位基因頻率為35%，與其他文獻報道結(jié)果大體一致。統(tǒng)計結(jié)果可見，CC型在男女之間的分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，男性患者明顯多于女性患者，但其余兩種基因型并無明顯差異。本文將重慶地區(qū)與豫北地區(qū)腦卒中患者MTHFR基因型的多態(tài)性分布做了簡單的比較，結(jié)果表明C677C與T677T兩種基因型的分布存在明顯差異(P<0.05)。本次研究中TT型的Hcy水平明顯高于CC、CT型，這說明MTHFR C677T基因多態(tài)性與Hcy水平相關(guān)。

作者建議腦卒中患者，尤其是男性患者，在條件允許的情況下都能同時檢測自身MTHFR C677T基因類型及Hcy水平，以利于醫(yī)生更早、更好地采取預防及治療措施，制訂良好的個體化用藥方案，從而降低疾病帶來的不良后果。

[1]蔡高宇，盧鐘嬌，傅毅．基因多態(tài)性與腦卒中相關(guān)性研究進展[J]．中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2015，15(2)：92-97．

[2]楊立平，金霖，包同新，等．MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系[J]．中國航天醫(yī)藥雜志，2003，5(1)：22-24．

[3]周憲梁，胡愛華，惠汝太，等．MTHFR基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸水平與腦卒中的關(guān)系[J]．中華心血管病雜志，1999，27(2)：40-42．

[4]張海洋，張金華，張會敏．MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性[J]．中國老年學雜志，2012，32(4)：690-691．

[5]李忠，陳曉虹，魏艷花，等．青年與老年缺血性卒中危險因素的比較[J]．中國腦血管病雜志，2010，7(3)：150-151．

[6]Welch GN, Loscalzo J. Homocysteine and atherothrombosis[J]．N Eng J Med, 1998, 338(15): 1042-1050.

[7]高國棟，林凱，黎映蘭．高同型半胱氨酸血癥與缺血性腦卒中的關(guān)系及成因分析[J]．南方醫(yī)科大學學報，2007，27(11)：1769-1770．

[8]Hong YS,Lee MJ,Kim KH,et al.The C677 mutation in methylene tetrahydrofolate reductase gene:correlation with uric acid and cardiovascular risk factors in elderly Korean men[J].J Korean Med Sci,2004,19(2):209-213.

[9]Zuo M,Nishio H,Lee MJ,et al.The C677T mutation in the methylene tetrahydrofolate reductase gene increases serum uric acid in elderly men[J].J Hum Genet,2000,45(4):257-262.

[10]黃一寧，趙宇嵐，李舜偉．同型半胱氨酸和MTHFR基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的關(guān)系[J]．中華醫(yī)學雜志，2002，82(2)：50-53．

The plasma homocysteine levels and polymorphisms of MTHFR gene in brain stroke patients*

FanChao,ChenMing,DengShaoLi△,ChangKai

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapingHospital,ResearchInstituteofFieldSurgery,theThirdMilitaryUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To study the plasma homocysteine(Hcy) levels and polymorphisms of MTHFR gene in stroke patients of Chongqing area,then compare the result of its polymorphisms with another area.Methods Totally 240 brain stroke patients were included in the study.Their polymorphisms of MTHFR gene were analyzed by gene chip method,and their plasma total Hcy levels were measured by using enzymatic cycling method.SPSS19.0 system was used to analyse the data.Results There were three kinds of MTHFR genotypes:C677C genotype,C677T genotype,T677T genotype,the frequencies of the three genotypes were as follows:C677C 42.9%,C677T 44.2%,T677T 12.9%.The frequency of C alleles was 65%,while the frequency of T alleles was 35%.According to the statistical analysis,the distribution of CC genotype in male and female was significant(P=0.003).The frequency of C allele in male patients was significantly higher than that in female patients(P<0.05).There were significant differences in MTHFR C677C genotype and T677T genotype distribution between stroke patients in Chongqing and Yubei area in Henan province(P<0.01).The plasma Hcy levels of the three genotypes were as follows:C677C(13.53±6.45)μmol/L,C677T(14.26±5.75) μmol/L,T677T(19.37±12.01)μmol/L.Conclusion MTHFR polymorphism indeed exists in stroke patients in Chongqing are,and the polymorphism is different with that of other area,for instance,Yubei area in Henan province.MTHFR C677T polymorphisms and plasma Hcy levels are closely related,the T677T genotype is associated with a higher plasma Hcy level than the other two genotypes.

stroke;homocysteine;MTHFR;polymorphism,single nucleotide

國家自然科學基金資助項目(81101199)；國家傳染病重大專項資助項目(2013ZX10003006-003-002)。 作者簡介：范超(1989-)，初級檢驗師，本科，主要從事分子診斷和其他臨床檢驗研究。△

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.011

R34

A

1671-8348(2016)35-4932-02

2016-07-12

2016-10-15)