尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)鑒定肺癌的差異性磷脂研究

溫 華，魏益平，張興磊，朱騰高，陳立如，徐建軍△

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,南昌 330006；2.東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室,南昌330013)

尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)鑒定肺癌的差異性磷脂研究

溫 華1，魏益平1，張興磊2，朱騰高2，陳立如1，徐建軍1△

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,南昌 330006；2.東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室,南昌330013)

目的 運用尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)鑒定肺癌差異性磷脂。方法 在不對肺組織進行任何預(yù)處理的前提下，采用自制的甲醇萃取輔助的尖端放電噴霧離子源對14例肺癌患者的肺癌組織和癌旁組織的差異性磷脂[質(zhì)荷比(m/z)756.7]及標準品[二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)+Na+]進行多級質(zhì)譜檢測，萃取劑甲醇的流速為4μL/min，設(shè)置離子源為正離子模式，一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z750～850，多級譜圖掃描范圍為m/z200～800，離子傳輸管溫度150 ℃，噴霧電壓3.5kV，透鏡電壓65.0V，選定離子的隔離寬度為1.6Da，碰撞能量為13%。結(jié)果m/z756.7的多級質(zhì)譜圖與標準品[DPPC+Na+]完全相符，即肺癌的差異性物質(zhì)為DPPC。結(jié)論 尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)利用多級質(zhì)譜分析可以很好地對肺癌和癌旁組織的差異性磷脂進行定性，DPPC可能成為新的肺癌分子標志物，為肺癌的診斷提供新的方法。

肺腫瘤；二棕櫚酰磷脂酰膽堿；尖端放電質(zhì)譜分析；鑒定

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一[1]，極大地危害了人們的生命健康。由于對肺癌的發(fā)病機制尚不清楚，因而缺乏針對性治療手段，外科手術(shù)仍是目前治療肺癌最直接、有效的方法，臨床研究表明，早期診斷是改善肺癌預(yù)后的關(guān)鍵[2-4]。目前仍以影像學(xué)檢查為診斷肺癌的主要手段，患者確診時往往已發(fā)展為肺癌中晚期；同時影像學(xué)檢查無法反映肺癌的發(fā)病機制，不能為治療及藥物開發(fā)提供靶點。因此，對肺癌患者發(fā)病機制及生物標志物的研究有利于其早期診斷，具有非常重要的臨床價值。

質(zhì)譜分析是通過檢測待測物離子的特異質(zhì)荷比來分析被測物質(zhì)的分析方法，具有靈敏度高、特異性好、檢測方式靈活多樣等優(yōu)點[5]。2004年有學(xué)者提出了在無需樣品預(yù)處理的條件下直接分析固體表面痕量待測物的電噴霧解吸電離技術(shù)[6]，隨即掀起了直接離子化技術(shù)的研究熱潮。近幾年來，質(zhì)譜技術(shù)不斷地被應(yīng)用于腎結(jié)石、前列腺癌等疾病的檢測及診斷[7-8]。尖端放電噴霧電離質(zhì)譜分析是基于紙噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)原理發(fā)展的一種基于樣品中分子組成或含量的不同而實現(xiàn)樣品檢測的一種對復(fù)雜樣品中不同類型化合物的快速分析檢測方法[9]，可在無需樣品預(yù)處理的情況下對各種臨床組織樣品進行分析[10]。多級質(zhì)譜分析是對目標母離子進行多級碰撞誘導(dǎo)解離實驗，通過施加能量使其運動加劇，并按照分子結(jié)構(gòu)的本質(zhì)規(guī)律進行裂解，從而獲得具有分子結(jié)構(gòu)特征的碎片離子，獲得相關(guān)的串聯(lián)質(zhì)譜譜圖，總結(jié)其裂解規(guī)律、推導(dǎo)出其分子結(jié)構(gòu)式[11-13]。本研究采用自制的甲醇萃取輔助的針尖電噴霧離子源，在無需復(fù)雜樣品預(yù)處理的情況下檢測肺癌組織及癌旁組織，運用多級質(zhì)譜分析方法鑒定肺癌差異性磷脂的效果及應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 組織來源 本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床委員會批準，所有患者知情同意。 病例入選標準：2013年1～10月入院的肺癌患者；術(shù)前未經(jīng)化學(xué)治療等藥物干預(yù)，術(shù)中留取肺癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣5 cm以上，視為正常肺組織)標本，所留取樣品置于-80 ℃保存。入選患者14例，手術(shù)后病理診斷均為非小細胞肺癌，其中男10例，女4例，年齡40～71歲，腺癌7例，鱗癌7例。

1.2 儀器與試劑 甲醇萃取輔助的針尖電噴霧離子源(自制)；LTQ-XL增強型線性離子阱質(zhì)譜儀，配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Finnigan公司)；KQ3200型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。標準品二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；5%碳酸氫鈉注射液(羅欣醫(yī)藥集團有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；實驗用水為2次去離子水。

1.3 方法 離子源(自制)由兩部分構(gòu)成，即尖端刺有微量組織樣品的針灸針(0.35 mm×75 mm)和樣品上方的萃取劑甲醇，電噴霧電壓連接于針灸針針柄上，樣品與萃取劑及質(zhì)譜入口的距離均約5 mm；組織樣品未經(jīng)任何處理，解凍后取大小約1 mm3的組織用于質(zhì)譜分析。設(shè)置離子源為正離子模式，一級譜圖掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)750～850，多級譜圖掃描范圍m/z 200～800,離子傳輸管溫度150 ℃，噴霧電壓3.5 kV，透鏡電壓65.0 V，選定離子的隔離寬度為1.6 Da，碰撞能量為13%，其他條件系統(tǒng)自動優(yōu)化。根據(jù)前期得到的主成分分析(PCA)結(jié)果[14]及此次的PCA結(jié)果，選定具有差異性的物質(zhì)m/z 756.7為母離子進行多級質(zhì)譜分析，通過對比該物質(zhì)的標準品的多級質(zhì)譜圖，從而達到定性。

2 結(jié) 果

2.1 m/z 757的多級質(zhì)譜圖 按擬定實驗方法對14例肺癌患者的癌組織和癌旁組織共計28份組織樣品進行質(zhì)譜檢測，在一級譜圖發(fā)現(xiàn)了質(zhì)子化的卵磷脂(m/z 756.7)，見圖1；其二級質(zhì)譜中存在特征離子m/z 698、m/z 574等，見圖2，符合文獻[15]上卵磷脂的裂解規(guī)律，表明該物質(zhì)為卵磷脂；其三級質(zhì)譜中存在特征離子m/z 574、m/z 552等。依據(jù)其丟失的相對分子質(zhì)量、碎裂規(guī)律及相關(guān)文獻[16]上報道的DPPC是肺表面活性物質(zhì)最主要的脂質(zhì)成分，在維持肺組織正常結(jié)構(gòu)及功能起著重要作用，作者推導(dǎo)m/z 756.7為DPPC與一個鈉離子的結(jié)合物。

A：肺癌組織一級質(zhì)譜圖；B：癌旁組織一級質(zhì)譜圖。

圖1 肺組織一級質(zhì)譜圖

圖2 m/z 756.7的多級質(zhì)譜圖

2.2 m/z 757的定性鑒定 與標準品DPPC配置的鈉鹽溶液的多級質(zhì)譜譜圖(圖3)比較，m/z 756.7的二級譜圖、三級譜圖與標準品[DPPC+Na+]完全符合，表明m/z 756.7為物質(zhì)[DPPC+Na+]；質(zhì)譜分析能夠較好地對未知物質(zhì)進行定性分析。

圖3 標準品[DPPC+Na+]的多級質(zhì)譜圖

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率高居榜首，其肺部表現(xiàn)可出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、肺不張、喘鳴、肺部炎癥等。目前對肺癌的發(fā)病機制仍不清楚，缺乏針對性的藥物。尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)是近年來發(fā)展起來的直接質(zhì)譜分析方法，可在無需復(fù)雜樣品預(yù)處理的情況下對臨床組織、血液等機體復(fù)雜的樣品進行快速分析，一般在數(shù)秒內(nèi)即可獲得樣品的質(zhì)譜信息。碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation，CID)在質(zhì)譜中用來證明帶電物質(zhì)[M+H]+的特定分子式和檢測其碎片離子[17]；有研究應(yīng)用多級質(zhì)譜分析方法對煙草中的煙堿進行多級碰撞誘導(dǎo)解離實驗，得到了煙堿的特征碎片離子[11]。由此可見，尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)多級質(zhì)譜分析可用于物質(zhì)的定性分析，在發(fā)現(xiàn)肺癌生物標記物的定性中具有重要價值。

本研究結(jié)果顯示：在正離子模式下，通過多級質(zhì)譜檢測能對癌旁組織中高于肺癌組織的差異性磷脂m/z 756.7定性分析，確定其為[DPPC+Na+]。DPPC是肺表面活性物質(zhì)(pulmonary srfactant，PS)最主要的脂質(zhì)成分，PS的主要成分為磷脂含量高達90%，在肺泡Ⅱ型上皮細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，通過高爾基體運送到泡體，最后在分泌前被板層小體包裹，板層小體通過細胞外分泌作用，使PS分泌到肺泡表面，形成復(fù)雜的格子樣排列，叫管狀髓磷脂(管鞘)，使肺泡表面氣液間形成單分子層。PS具有參與宿主防御及免疫調(diào)節(jié)等功能，維持肺的穩(wěn)定及抗炎作用[16]。肺癌患者中的腫瘤壞死因子顯著增多[18]，腫瘤壞死因子可能使表面活性物質(zhì)的合成酶降解，導(dǎo)致表面活性物質(zhì)合成降低，引起肺不張、肺部炎癥等；即肺癌組織中的DPPC含量低于癌旁組織。有研究報導(dǎo)，肺泡干細胞可以分化成肺泡Ⅰ型上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞，均與肺癌的發(fā)生有重要的關(guān)系[19]；損傷的肺泡Ⅰ型上皮細胞產(chǎn)生信號1替代EGFR-KRAS激活肺泡Ⅱ型上皮細胞自我修復(fù)的功能，而另一種重組的肺泡Ⅰ型上皮細胞產(chǎn)生信號2活化EGFR-KRAS激活肺泡Ⅱ型上皮細胞的癌變，形成類似肺泡Ⅱ型上皮細胞的腫瘤；與本研究的結(jié)果相符。

綜上所述，本研究利用了尖端放電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)了對肺癌差異性磷脂的鑒定，可能成為新的肺癌分子標志物。但本研究中的DPPC還需要進一步確定其在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中不同時期及癌旁組織中的含量，這可為肺癌的診斷及臨床分期提供新的方法。

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Identification of differential phospholipids in lung cancer by tip-spray ionization mass spectrometry*

WenHua1,WeiYiping1,ZhangXinglei2,ZhuTenggao2,ChenLiru1,XuJianjun1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China;2.JiangxiKeyLaboratoryofMassSpectrometry,DonghuaUniversityofScience&Technology,Nanchang,Jiangxi330013,China)

Objective To identify the differential phospholipid in lung cancer by using tip-spray ionization mass spectrometry(TSI-MS).Methods Under the premise of no pretreatment of lung tissues,the differential phospholipid m/z 756.7 in lung carcinoma tissues and adjacent normal tissues of 14 cases of patients with lung cancer and the standard [DPPC+Na+] were detected by multistage mass spectrometry using a self-made methanol extraction assisted tip discharge ionization source.The flow rate of methanol was 4 uL/min,the ion source was positive ion mode,the the scanning range of single-stage mass spectrometry was m/z 750-850,the scanning range of multistage mass spectrometry was m/z 200-800,the ion transport tube temperature was 150 ℃,the spray voltage was 3.5 kV,the lens voltage was 65 V,the selected ion isolation width was 1.6 Da,and the collision energy was 13%.Results The mass spectrum of m/ z 756.7 detected by multistage mass spectrometry was consistent with the standard [DPPC+Na+],that was,DPPC was the differential material of lung cancer.Conclusion TSI-MS can be used to characterize the differential phospholipids in lung cancer tissues and adjacent tissues,DPPC may become a new molecular marker of lung cancer,providing a new method for the diagnosis of lung cancer.

lung neoplasms；DPPC；tip-spray mass spectrometry；identification

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項基金資助項目(2011YQ170067)；國家自然科學(xué)基金資助項目(81160293，21365001)；2013年江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目(YC2013-S005)。 作者簡介：溫華(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肺癌的臨床基礎(chǔ)研究。△

Tel：13907913526；E-mail：942091371@qq.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.010

R

A

1671-8348(2016)35-4929-03

2016-07-22

2016-09-17)