胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞動物模型的構(gòu)建

周 洲，賴 兵，高采平，王 璞，王 晗，李良平

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610072；2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術(shù)研究室，成都 610041)

胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞動物模型的構(gòu)建

周 洲1，賴 兵2，高采平1，王 璞1，王 晗1，李良平1

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610072；2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術(shù)研究室，成都 610041)

目的 構(gòu)建胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)動物模型，為CTC運用于臨床提供依據(jù)。方法 構(gòu)建4種裸鼠胃癌腫瘤模型，分別為皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤，檢測各組腫瘤生長、轉(zhuǎn)移水平，比較各組循環(huán)血中CTC數(shù)目，并進(jìn)一步行單細(xì)胞實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-QPCR)分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在CTC與原細(xì)胞中的表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中血管的生成情況。結(jié)果 胃癌細(xì)胞原位移植模型是研究胃癌CTC的理想模型，裸鼠死亡率低，腫瘤轉(zhuǎn)移明顯，CTC數(shù)量較其他造模方法明顯升高。結(jié)論 成功構(gòu)建了CTC裸鼠模型，為CTC應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。

胃腫瘤；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；腫瘤復(fù)發(fā)；腫瘤轉(zhuǎn)移

胃癌是最常見的嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)每年約有100萬的新發(fā)病例及50萬的死亡病例[1]。在惡性腫瘤中，腫瘤轉(zhuǎn)移是重要的預(yù)后因素，是導(dǎo)致病死的主要原因[2]。目前，腫瘤的發(fā)現(xiàn)和診斷臨床上仍依賴于影像學(xué)檢查及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志的監(jiān)測，難以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，也難以及時反映療效。選擇最佳的治療策略，有效地限制轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)依然是目前臨床上的主要挑戰(zhàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是指因自發(fā)或診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。侵入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，大部分由于機體的免疫識別、機械殺傷及自身凋亡在短期內(nèi)死亡，只有極少數(shù)存活下來，在適于自身存活和增殖的器官或組織形成轉(zhuǎn)移灶。而有些早期播散的腫瘤細(xì)胞或微小轉(zhuǎn)移灶在切除原發(fā)灶后可以保持休眠狀態(tài)并在若干年后形成轉(zhuǎn)移灶[3]。因此，在外周血中檢測到CTC對解決復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測、腫瘤細(xì)胞分子特征等臨床問題有重要的應(yīng)用價值。動物模型能夠模擬腫瘤在體內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)行為，在腫瘤的研究中有重要作用。目前文獻(xiàn)報道的胃癌造模方式主要有皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤4種[4]，但是這4種方式形成的CTC少見報道。本實驗檢測各組腫瘤生長、轉(zhuǎn)移水平，比較各組CTC數(shù)目，并進(jìn)一步行單細(xì)胞實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-QPCR)分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在CTC與原細(xì)胞中的表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)法了解腫瘤組織中血管生成情況，為進(jìn)一步臨床監(jiān)控胃癌轉(zhuǎn)移提供良好的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用的BALB/c裸鼠均為雌性，4～6周齡，體質(zhì)量17～20 g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，全程飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)級動物實驗房空氣層流架內(nèi)(室溫恒定于20～22 ℃，空氣濕度30%～50%)，予以動物的飼料為60鈷輻射滅菌過的小鼠專用顆粒飼料，約每2～3天更換清潔籠子。本實驗動物的使用嚴(yán)格遵守實驗動物管理條例，實驗設(shè)計符合四川省實驗動物倫理委員會要求。

1.2 儀器與試劑 分離CTC的免疫磁珠為CELLection Epithelial Enrich(美國Invitrogen公司)；單細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Single Cell-to-CT qRT-PCR Kit(美國Ambion公司)；QPCR試劑盒為SsoAdvanced SYBR Green Supermix(美國Bio-Rad公司)；RPMI1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)及胎牛血清(美國Life Technologies公司)；免疫組織化學(xué)試劑盒及兔抗人CD34 單克隆抗體(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗細(xì)胞的培養(yǎng) SGC-7901胃癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱內(nèi)通氣培養(yǎng)，隔天換液。

1.3.2 動物模型的構(gòu)建

1.3.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側(cè)肩胛部皮下注射細(xì)胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。每組10只裸鼠。將裸鼠重新放回籠中觀察約1周，右側(cè)肩胛部皮下出現(xiàn)米粒大小質(zhì)硬結(jié)節(jié)為模型建立成功。

1.3.2.2 裸鼠原位瘤模型的構(gòu)建 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側(cè)肩胛部皮下注射細(xì)胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。將裸鼠重新放回籠中觀察，右側(cè)肩胛部皮下出現(xiàn)米粒大小質(zhì)硬結(jié)節(jié)為模型建立成功。2周后，以頸椎脫臼法處死，小心剝?nèi)∫浦擦?，在培養(yǎng)液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊。接下來用裸鼠建立原位胃癌移植模型(10只)。用濃度為2.5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，待小鼠痛覺消失后，用手術(shù)剪在小鼠左上腹部做一約1 cm的橫切口，暴露腹腔組織，小心分離將胃暴露出腹腔，用生物膠將1塊胃癌組織粘在小鼠胃組織上。然后用6.0不可吸收外科縫線關(guān)閉腹腔。整個操作過程在超凈工作臺中完成。之后每天觀察小鼠狀態(tài)，測量小鼠體質(zhì)量。

1.3.2.3 小鼠腹腔注射腫瘤細(xì)胞模型組 待SGC-7901細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS液洗滌后，調(diào)節(jié)成相應(yīng)的細(xì)胞濃度為5×107/mL的細(xì)胞懸液。于每只裸鼠左下腹進(jìn)針，回抽無血腹腔注入0.2 mL細(xì)胞懸液。

1.3.2.4 小鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞模型組 將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞濃度調(diào)整至5×107/mL,取0.1 mL細(xì)胞尾靜脈注射入裸鼠，觀察小鼠生長活動狀況。

1.3.3 血標(biāo)本采集 嚴(yán)格消毒后，應(yīng)用真空采血針采集眼眶靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，并在采集后的2 h內(nèi)富集CTC。

1.3.4 免疫磁珠法篩選CTC 將250 μL免疫磁珠加入2 mL全血中，在2～8 °C溫度中輕柔旋轉(zhuǎn)，孵育30 min，然后將管子在磁場中放置2 min后輕柔地倒出上清液。將管子從磁場中移除，加入5 mL 緩沖液1(Buffer 1)，混懸均勻2～3次后繼續(xù)將試管放入磁場中2 min。再次將試管置于磁場中，移除上清液，將管子從磁場中移除，加入5 mL Buffer 1，混懸均勻2～3次后繼續(xù)將試管放入磁場中2 min。最后加入200 μL緩沖液3(Buffer 3)，將細(xì)胞充分混懸均勻后復(fù)熱至37 ℃。加入4 μL Release Buffer，在室溫中孵育15 min，同時輕柔混勻液體，然后用100～200 μL吸液管將液體充分混懸均勻5～10次。將試管放入磁場中2 min，然后將上清液移入新的試管中進(jìn)行單細(xì)胞挑選。

1.3.5 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)及挑取 將富集的細(xì)胞液在顯微鏡下再次進(jìn)行形態(tài)學(xué)篩選。顯微操作平臺：Leica DM IL LED熒光顯微鏡搭配Eppendorf TransferMan NK 2顯微操作儀。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑大于10 μm；(2)光鏡下可見完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核；(3)核質(zhì)比失常。將選定的CTC在單細(xì)胞挑取臺上細(xì)針挑取收集。

1.3.6 單細(xì)胞RT-QPCR 將選取的細(xì)胞加入按說明配好的10 μL單細(xì)胞溶解液Ⅰ，室溫下孵育5 min，然后加入1 μL終止液(總體積約11 μL)，室溫孵育2 min后加入4.5 μL RT Mix(總體積約15 μL)，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min。將得到的逆轉(zhuǎn)錄cDNA均分為每份2 μL，分別加入0.6 μL Single Cell PreAmp Mix，和0.8 μL 按說明稀釋好的引物，95 ℃孵育10 min后95 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min，進(jìn)行14個循環(huán)后取1 μL預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋后用于PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，6 ℃退火30 s，60個循環(huán)。RT-PCR結(jié)果以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照計算基因mRNA相對表達(dá)水平。每次反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔。

1.3.7 小鼠胃癌組織免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)SP染色法，常規(guī)脫蠟、水化，以0.01 mol/L檸檬酸高壓修復(fù)5 min，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育5～10 min，正常山羊血清封閉10 min后，滴加一抗，孵育過夜，其余步驟嚴(yán)格遵照即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。 陽性對照由試劑公司提供，用PBS代替一抗作為陰性對照。以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學(xué)染色陽性，綜合染色強度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 4組CTC數(shù)目比較 4組小鼠均接種成功，在觀察期間，皮下組的死亡率為0，原位組為30%，腹腔組為20%，尾靜脈組為50%。分別在接種成功后2、3、4周采集裸鼠眼眶靜脈血(第2周處死2只，第3周處死2只，第4周處死6只)，計數(shù)外周血中CTC數(shù)目。結(jié)果顯示，皮下組在整個實驗過程中未發(fā)生血中轉(zhuǎn)移，原位組隨著時間推移循環(huán)血中CTC數(shù)目逐漸增加，并且裸鼠死亡率低，是一種可行的構(gòu)建CTC動物模型的方法，見圖1。腹腔組雖然發(fā)生轉(zhuǎn)移，但實驗過程中，CTC數(shù)目較少。尾靜脈組雖然CTC數(shù)目較腹腔組高，但裸鼠死亡率高，可能與操作技術(shù)復(fù)雜，裸鼠對尾靜脈注射耐受力低有關(guān)。

圖1 CTC計數(shù)比較

2.2 4種接種方法轉(zhuǎn)移情況比較 為了進(jìn)一步闡明4種造模方式轉(zhuǎn)移情況的比較，對裸鼠轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行分析。由于腫瘤的迅速增殖，小鼠出現(xiàn)明顯的惡病質(zhì)表現(xiàn)(消瘦、精神萎靡不振、食欲下降、腹水)，小鼠處死后剖腹觀察。4組裸鼠移植瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，見圖2。皮下組未發(fā)生任何轉(zhuǎn)移，原位組發(fā)現(xiàn)了肝臟(80%)、肺臟(30%)、腸系膜(100%)轉(zhuǎn)移，并且出現(xiàn)了腹水(40%)，腹腔組腸系膜轉(zhuǎn)移率高(100%)，腹水(80%)出現(xiàn)率高，但肝臟(40%)、肺臟(10%)轉(zhuǎn)移率低。尾靜脈注射組發(fā)生轉(zhuǎn)移率較原位組、腹腔組均低(肝臟轉(zhuǎn)移30%、肺臟轉(zhuǎn)移10%、腸系膜轉(zhuǎn)移50%、腹水20%)?？赡芘c裸鼠生存期短，在實驗過程中死亡率高相關(guān)。

圖2 裸鼠模型轉(zhuǎn)移部位的比較

2.3 單細(xì)胞RT-QPCR檢測原位組CTC及SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)差異 由于原位腫瘤移植裸鼠組動物死亡率低，轉(zhuǎn)移率高，是一種較好的反映腫瘤轉(zhuǎn)移的動物模型。采用免疫磁珠法提取原位組外周血中CTC行單細(xì)胞RT-QPCR，與接種細(xì)胞SGC7901行轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)變化比較。結(jié)果表明，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)mRNA在SGC7901細(xì)胞表達(dá)水平為(0.038±0.007)，在CTC表達(dá)水平為(0.077±0.009)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.27，P<0.05)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA在SGC7901細(xì)胞的表達(dá)水平為(0.027±0.013)，在CTC的表達(dá)水平為(0.082±0.002)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.52，P<0.05)；鈣粘素E(E-cadherin)mRNA在SGC7901細(xì)胞的表達(dá)水平為(0.075±0.005)，在CTC的表達(dá)水平為(0.023±0.009)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.10，P<0.05)，見圖3。

A：CELLectionTM富集CTC；B：單細(xì)胞挑取CTC；C：CTC與SGC7901細(xì)胞代謝相關(guān)基因比較；*：P<0.05,與CTC中表達(dá)水平比較。

圖3 單細(xì)胞RT-QPCR

2.4 免疫組織化學(xué)檢測原位瘤與皮下瘤中血管數(shù)目改變 采用內(nèi)皮細(xì)胞特異性CD34染色和微血管計數(shù)檢測皮下移植瘤與原位胃癌血管生長水平。皮下移植瘤組血管數(shù)量明顯低于原位移植腫瘤[(2.17±1.47)vs.(28.33±3.93)，P<0.01]，見圖4。

*：P<0.01,與原位組比較。

圖4 皮下移植瘤及原位移植瘤血管數(shù)目比較(SP染色×200)

3 討 論

胃癌是全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發(fā)病率及病死率均較高。胃癌早期診斷率低，缺乏特異性早期表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已屬中晚期，失去手術(shù)根治機會，預(yù)后極差，中位生存期僅為6～10個月[1]。目前，大部分胃癌相關(guān)死亡事件是由腫瘤的轉(zhuǎn)移行為所引起的[5]。早期發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是提高胃癌治愈率、改善患者預(yù)后的有效及關(guān)鍵途徑。

腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤是一個復(fù)雜的過程，腫瘤細(xì)胞從原位癌中脫離，隨血液分散至身體各部，形成新的癌灶。早在19世紀(jì)中葉，人們已經(jīng)在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種“異質(zhì)”細(xì)胞，并且認(rèn)識到血液是傳播它的主要途徑，但由于條件所限，一直沒有進(jìn)行深入研究[6]。直到最近，由于技術(shù)手段的發(fā)展，才有機會認(rèn)識它，更重要的是，將CTC用于臨床腫瘤的診斷、監(jiān)測及治療[7]。因此，在外周血中檢測到CTC對解決復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測、腫瘤分子特征等臨床問題有重要的應(yīng)用價值。CTC是腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，提供了原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的聯(lián)系。如何利用CTC控制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲，是一個迫切需要被深入發(fā)掘及研究的重要問題。

CTC與其他有創(chuàng)手段獲取腫瘤標(biāo)本有不可比擬的優(yōu)勢，血液來源的CTC，標(biāo)本采集容易、創(chuàng)傷性小、患者依從性較好，是臨床上較為理想的標(biāo)本來源。目前CTC在臨床中的應(yīng)用主要包括以下幾個方面。(1)腫瘤的診斷：對于一些隱匿部位的腫瘤，雖然臨床高度懷疑，但在沒有病理診斷的情況下，臨床的診斷及治療相當(dāng)棘手。所以，如果能在外周血獲得CTC，并進(jìn)行相關(guān)的病理學(xué)、分子生物學(xué)分析，對臨床腫瘤的診斷治療有極大的幫助，故CTC作為無創(chuàng)的實時液體活檢標(biāo)本有重要的意義[8]。(2)指導(dǎo)個體化治療：在腫瘤靶向治療中，臨床策略的決定主要根據(jù)患者原發(fā)腫瘤的基因表型，但在治療過程中，腫瘤的基因表型很可能發(fā)生改變，CTC為整個療程中的腫瘤基因表型提供實時監(jiān)測，為精準(zhǔn)的個體化治療提供了可能[9]。(3)治療效果及預(yù)后的評估：外周血中CTC的數(shù)目是評估預(yù)后的良好指標(biāo)，研究表明，在多種腫瘤中，CTC的計數(shù)是腫瘤預(yù)后的獨立影響因素[10]。

目前，CTC在臨床的運用越來越多。Sastre等[11]采用CellSearch系統(tǒng)監(jiān)測結(jié)腸癌患者，證實CTCs陽性率與原發(fā)腫瘤部位、腫瘤分化程度及癌胚抗原(CEA)水平升高無關(guān)，但與結(jié)腸癌的臨床分期相關(guān)，且CTCs在結(jié)腸癌的早期階段即可檢測到，表明CTCs檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。Cristofanilli等[12]在一個多中心、前瞻性和雙盲臨床試驗中，檢測177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者7.5mL外周血中CTCs的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)治療前外周血中CTCs≥5的患者與CTCs<5的患者相比，預(yù)后較差，因此CTCs可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后評估的獨立預(yù)測因素。有研究者運用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，38%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者原發(fā)腫瘤組織呈人表皮生長因子受體-2(HER-2)陰性，而分離并富集的外周血CTCs能夠擴增到HER-2基因，根據(jù)CTCs的HER-2擴增情況適時調(diào)整治療方案，能夠獲得更好的治療效果[13]。監(jiān)控CTCs的HER-2基因表達(dá)，進(jìn)行有針對性的個體化治療是對乳腺癌患者傳統(tǒng)治療觀念的改進(jìn)。Smerage等[14]在595例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血中檢測CTCs，結(jié)果表明，CTCs是強烈的預(yù)后因子。因此，CTCs檢測對早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移、評估預(yù)后及腫瘤的個體化治療等具有重要意義，而且由于檢測標(biāo)本是外周血，侵襲性小，可重復(fù)進(jìn)行，所以CTCs檢測技術(shù)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前，CTCs在胃癌領(lǐng)域的研究較少，尚需通過更多大規(guī)模、多中心的隨訪研究深入探討其在評估患者療效、預(yù)后和監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用價值，從而為腫瘤的合理化及個體化治療奠定基礎(chǔ)。動物模型是探討CTC臨床運用的前提，目前迫切需要找到一個經(jīng)濟、好用，能夠反應(yīng)CTC臨床特征的動物模型，但目前還缺乏這方的研究。

在本研究中，作者采用了4種常用的胃癌造模手段，包括皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾靜脈移植瘤4種。采用免疫磁珠法分離外周血中CTC，它是目前比較常用的CTC分離和富集技術(shù)[15]。其原理是基于CTCs主要表達(dá)上皮源性表面標(biāo)志，利用抗原抗體方法分離和富集CTCs，通過磁珠偶聯(lián)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule,Ep-CAM)和細(xì)胞角蛋白(cytokeratins,CKs)等標(biāo)志直接富集外周血中上皮來源的細(xì)胞。對于富集的CTC，作者采用單細(xì)胞RT-QPCR進(jìn)一步分析原細(xì)胞與CTC基因表達(dá)差異。RT-QPCR不僅高度敏感，而且具有高度特異性。它相比于RT-PCR的主要優(yōu)勢是通過Cq值的形式，設(shè)置截斷水平，以減少基于錯誤轉(zhuǎn)錄的假陽性結(jié)果[16]。目前，已有部分研究采用RT-QPCR技術(shù)分析CTC腫瘤預(yù)后標(biāo)志物表達(dá)水平，包括HER-2[17]、TWIST1[18]、CD133[19]、表皮生長因子受體(EGFR)[20]、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)[21]和血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)[22]。但是，目前大部分研究采用全血細(xì)胞進(jìn)行RT-QPCR，其主要缺陷是不能排除白細(xì)胞的污染，假陽性概率增高，并且不能區(qū)分1份樣品中多個循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)差異。由于這個缺點，作者采用單細(xì)胞RT-QPCR技術(shù)進(jìn)行CTC基因表達(dá)分析。將單細(xì)胞平臺篩選出的CTC行CD45初篩，對于CD45-的細(xì)胞進(jìn)一步行轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)檢測。CD45在白細(xì)胞中有高表達(dá)，而在其他各種來源的細(xì)胞中無表達(dá)，這樣可以有效去除血液中其他細(xì)胞的污染。

本研究結(jié)果表明，皮下移植瘤不能形成CTC，尾靜脈注射法雖然在前2周CTC數(shù)目多，在接種第4周，已有一半裸鼠死亡，可能與尾靜脈注射法技術(shù)難度大，操作困難有關(guān)。而腹腔注射組CTC數(shù)目較少，轉(zhuǎn)移部位較局限，不是構(gòu)建CTC的理想方案。原位接種裸鼠死亡率低，CTC數(shù)目多，且轉(zhuǎn)移范圍較廣，是一種比較成功的構(gòu)建CTC模型的方法。 進(jìn)一步單細(xì)胞mRNA研究表明，與SGC7901相比，體內(nèi)單細(xì)胞CTCMMP2、VEGFmRNA表達(dá)明顯增加，而E-cadherinmRNA表達(dá)明顯減少。原位胃癌的血管數(shù)目明顯多于皮下移植瘤，可見在體內(nèi)環(huán)境下，CTC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)增強，抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)減弱，腫瘤血管生成增多，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力明顯增強。

綜上所述，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成腫瘤致死的主要原因，早期準(zhǔn)確檢測CTC對腫瘤患者的綜合治療至關(guān)重要，并且可能作為胃癌治療監(jiān)測、評估預(yù)后、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測的評估指標(biāo)，有助于選擇個體化治療方案，從而降低腫瘤復(fù)發(fā)率，延長患者生存期。本實驗探索性的采用了免疫磁珠法聯(lián)合單細(xì)胞收集法收集CTC，并采用單細(xì)胞RT-QPCR檢測CTC相關(guān)基因表達(dá)，為CTC應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of gastric cancer animal model for circulating tumor cells′ research*

ZhouZhou1，LaiBing2，GaoCaiping1，WangPu1，WangHan1，LiLiangping1

(1.DepartmentofGastroenterology,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chendu,Sichuan610072,China;2.DepartmentofFrontierBiotechnology,DiaoJiuhongPhamaceuticals,Chendu,Sichuan610041,China)

Objective To construct gastric cancer circulating tumor cell(CTC) animal models,in order to provide references for utilization of CTC in clinical practice.Methods Four kinds of gastric tumor models in nude mice were constructed,which were subcutaneously transplanted tumor,orthotopic xenograft,abdominal tumor and tail vein tumor.The tumor growth and metastatic capability were detected,and the number of CTCs in each group was compared.Furthermore,the metastasis-related gene expression changes in CTC and the original cells were detected at single cell level with RT-QPCR analysis.Immunohistochemical staining was used to determinate tumor angiogenesis.Results The orthotopic xenograft tumor model was the best model for CTC research.Nude mice death ratio,tumor metastasis and CTC number in orthotopic xenograft tumor model were all better than those of other models.Conclusion The gastric cancer CTC animal model is successfully constructed,which might lay foundation for clinical use of CTC.

gastric neoplasms；circulating tumor cells；neoplasm recurrence；neoplasm metastasis

四川省科技廳支持項目資助項目(2014TD0028)。 作者簡介：周洲(1983-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)臨床研究。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.007

R

A

1671-8348(2016)35-4917-05

2016-05-21

2016-08-09)