MicroRNA-199a通過缺氧誘導因子1α抑制胃癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

鄭 桁，張 偉，王 康

(四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072)

MicroRNA-199a通過缺氧誘導因子1α抑制胃癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

鄭 桁，張 偉，王 康

(四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072)

目的 探討微小RNA-199a(miR-199a)調(diào)節(jié)缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達對缺氧狀態(tài)下胃癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及可能的機制。方法 低氧處理胃癌細胞24h，通過轉(zhuǎn)染si-HIF-1α和miR-199amimic，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測miR-199a的表達水平，蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)檢測HIF-1α及相關EMT蛋白的變化，鏡下觀察胃癌細胞形態(tài)。結果 低氧處理后，能下調(diào)miR-199amRNA表達，上調(diào)HIF-1α和間葉細胞標志蛋白表達，下調(diào)E-鈣黏素(E-cadherin)蛋白表達。轉(zhuǎn)染miR-199amimic后能抑制HIF-1α的蛋白表達，轉(zhuǎn)染si-HIF-1α和miR-199amimic后能部分逆轉(zhuǎn)低氧的作用，抑制EMT過程的發(fā)展。結論miR-199a可能通過降低HIF-1α的表達抑制缺氧狀態(tài)下胃癌細胞的EMT過程的發(fā)生。

微小RNA-199a；缺氧誘導因子-1α；缺氧；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

缺氧是所有實體腫瘤的共同特征，在腫瘤的起始和發(fā)展中起重要作用。缺氧時細胞內(nèi)高表達的缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)可誘導腫瘤發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transiton,EMT)，促進腫瘤細胞異質(zhì)化和腫瘤血管形成，從而參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。HIF-1α在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且HIF-1α的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期有關，HIF-1α可促進EMT的發(fā)生，從而促進胃癌的轉(zhuǎn)移[1]。EMT是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，主要特征有細胞黏附分子表達減少、間質(zhì)表型細胞標志物表達增加和轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)。微小RNA(microRNA,miR)作為一種非編碼單鏈RNA在EMT的發(fā)生中也發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌中miR-199a-5p的下調(diào)可以活化EMT相關信號，促進結腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[2]。本研究用1%氧氣(O2)處理胃癌細胞AGS，模擬缺氧環(huán)境，觀察缺氧對胃癌細胞EMT的影響，并以miR-199a mimic和si-HIF-1α轉(zhuǎn)染胃癌細胞，分析EMT標志蛋白的表達情況及細胞形態(tài)的變化，探討miR-199a調(diào)控HIF-1α表達參與缺氧狀態(tài)下胃癌細胞EMT的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及細胞培養(yǎng) 胃癌AGS細胞購自中國科學院上海生科院細胞中心(來源于ATCC細胞庫)。細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，加入100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素雙抗，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 低氧培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。胎牛血清購自天津灝洋有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，lipofectAMINE2000購自美國Invitrogen公司，miR-199a和U6引物、miR-199a mimics、control mimics和si-HIF-1α由廣州銳博合成，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SyberGreen試劑盒均購自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、一抗二抗稀釋液、超敏蛋白顯影液、β-actin一抗、羊抗兔二抗購自碧云天生物技術所，兔抗人HIF-1α、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、SNAIL抗體購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 寡核苷酸和siRNA轉(zhuǎn)染 按LipofectAMINE2000說明書操作，將miR-199a mimics(50 nmol/L)、mimic對照和si-HIF-1α(100 nmol/L)、si對照分別轉(zhuǎn)染至融合度為50%的胃癌AGS細胞中，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染后細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 AGS細胞中miR-199a mRNA表達的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測AGS細胞中miR-199a mRNA的表達。收集不同分組的AGS細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，按Trizol試劑盒說明抽提細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA水平和260與280 nm處的吸光度(A)值比值(A260/A280)，取100 ng總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板加入miR-199a或U6上下游引物(由廣州銳博合成)，和SybrGreen進行PCR擴增。條件：第1步，95 ℃ 30 s；第2步，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-△△CT值計算各樣本中miR-199a的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.3 HIF-1α及EMT相關標志蛋白的表達 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測HIF-1α及EMT相關標志蛋白的表達。收集不同分組的AGS細胞，提取總蛋白，BCA檢測蛋白水平，按40 g計算蛋白質(zhì)上樣體積，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(HIF-1α稀釋比例為1∶500，其余稀釋比例為1∶1 000)，Tris緩沖生理鹽水-吐溫溶液(TBST)洗膜3次，二抗(抗兔1∶5 000，β-actin為抗鼠二抗1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，化學發(fā)光法顯影。

1.3.4 倒置光學顯微鏡下觀察AGS細胞形態(tài) 收集轉(zhuǎn)染control、1% O2、+miR-199a mimics、+control mimics處理后的AGS細胞，在倒置光學顯微鏡下隨機選擇3個視野(×200)，觀察細胞的形態(tài)變化，并進行拍照。

2 結 果

2.1 低氧上調(diào)HIF-1α的表達 1%O2處理胃癌細胞24h后，與常氧組比較，低氧可以誘導HIF-1α表達，而si-HIF-1α轉(zhuǎn)染后能明顯抑制HIF-1α的表達，si陰性對照組對HIF-1α表達無明顯影響，見圖1。

圖1 Western blotting檢測HIF-1α表達

2.2si-HIF-1α抑制胃癌EMT為了研究HIF-1α對胃癌細胞EMT的影響，將si-HIF-1α轉(zhuǎn)染入AGS細胞內(nèi)48h后低氧處理24h，WesternBlotting檢測胃癌細胞株AGS中上皮細胞標志物E-鈣黏素(E-cadherin)和間葉細胞標志物纖維連接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和SNAIL蛋白的表達。結果顯示：與常氧組比較，低氧可誘導胃癌細胞間葉細胞標志物表達上調(diào)，而轉(zhuǎn)染si-HIF-1α后，間葉細胞標志物表達明顯降低，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，見圖2。

2.3 低氧下調(diào)miR-199a的表達 1%O2處理胃癌細胞24h后，與常氧組比較，低氧可以下調(diào)miR-199amRNA的表達，而轉(zhuǎn)染miR-199amimic后能明顯上調(diào)miR-199a的表達，mimic對照組對miR-199a表達無明顯影響，見圖3。

圖2 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

*：P<0.01，與常氧組比較；#：P<0.01，與低氧組比較；n=3。

圖3miR-199amRNA表達

圖4 Western blotting檢測HIF-1α表達

圖5 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

2.4 過表達miR-199a通過HIF-1α抑制胃癌EMT實驗證明，轉(zhuǎn)染miR-199amimic后能明顯抑制HIF-1α的表達，見圖4，并上調(diào)上皮細胞標志物E-cadherin蛋白水平，抑制間葉細胞標志物的表達。mimiccontrol組對上述蛋白表達無明顯影響，見圖5。

2.5 過表達miR-199a對胃癌細胞形態(tài)變化的影響 在倒置光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低氧24h胃癌細胞中長梭形細胞明顯增加，而轉(zhuǎn)染miR-199amimics后細胞由長梭形變?yōu)槎嘟切位蚵褕A形，見圖6。

A:常氧組;B:低氧組;C:+miR-199amimics組;D:mimic對照組。

圖6 倒置顯微鏡下觀察miR-199amimics轉(zhuǎn)染對低氧處理后胃癌細胞的形態(tài)影響(×200)

3 討 論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們的健康安全。胃癌轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者療效和獲得長期生存的關鍵問題。近年來多項研究證實，多種miRNA在胃癌中的表達異常，導致癌基因的激活和抑癌基因缺失，從而調(diào)控癌細胞的增殖和生長。

本研究探討了低氧對胃癌細胞EMT的影響，1%O2處理后，上皮相關指標E-cadherin表達水平明顯下調(diào)，而vimentin、N-cadherin和SNAIL蛋白表達水平明顯升高，提示EMT的發(fā)生，同時細胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達上調(diào)，這一結果說明缺氧環(huán)境下HIF-1α蛋白表達上調(diào)可導致EMT的發(fā)生。miRNA能與癌基因或抑癌基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslatedregion，3′-UTR)特異性結合，通過對靶基因mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制基因的表達，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。生物信息學預測分析HIF-1α可能為miR-199a的靶基因，目前已有研究通過Westernblotting和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實HIF-1α為miR-199a的靶基因[3-4]，本實驗也證明了miR-199amimic可以下調(diào)HIF-1α的蛋白表達。在難治性癲癇患者的癲癇組織[5]、酒精性肝病肝竇內(nèi)皮細胞[6]和多發(fā)性骨髓瘤細胞[7]中，miR-199a表達下調(diào)，HIF-1α表達上調(diào)，過表達miR-199a后可下調(diào)HIF-1α。接下來作者檢測了在缺氧條件下胃癌細胞中miR-199a的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)miR-199a在缺氧狀態(tài)下表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-199amimics可部分逆轉(zhuǎn)缺氧導致的EMT相關蛋白的變化，倒置光學顯微鏡下觀察也可見細胞由缺氧狀態(tài)時的長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位蚵褕A形，說明胃癌細胞EMT減少。這一結果進一步證實，miR-199a能抑制胃癌細胞的EMT過程。

低氧可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路、刺猬信號通路、肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體信號通路及多種轉(zhuǎn)錄因子等途徑參與腫瘤EMT調(diào)控[8]。在缺氧狀態(tài)下，腫瘤細胞中TGF-β表達增加，低氧可通過直接提高SMAD3mRNA水平影響TGF-β信號通路[9]；反之，TGF-β通過SMAD信號通路特異性減少脯氨酰羥化酶的表達，從而間接增強HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性[10]。在腫瘤缺氧微環(huán)境中，HIF-1α與Notch信號通路細胞內(nèi)結構域功能性結合，增強轉(zhuǎn)錄活性，提高轉(zhuǎn)錄因子SNAIL表達水平，從而導致EMT[11-12]，而HIF-1α與Notch信號通路可能是通過HES1依賴的SRC/轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)通路發(fā)揮作用[13]。腫瘤低氧環(huán)境中，HIF-1α通過N端區(qū)域?qū)ⅵ?catenin從T細胞因子-4(TCF-4)移除，結合N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因hARD1使β-catenin失活，雖然HIF-1α可抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，但低氧環(huán)境對β-catenin誘發(fā)的EMT是必要的[14]。Wnt/β-catenin信號能通過增加EMT相關的HIF-1α蛋白活性和抑制腫瘤死亡，加速缺氧誘導的EMT進展[15]。

綜上所述，本研究表明在缺氧狀態(tài)下，胃癌細胞內(nèi)上調(diào)的HIF-1α可誘導EMT的發(fā)生，過表達miR-199a可通過抑制HIF-1α從而抑制EMT過程，為胃癌細胞的靶向治療提供新的線索。

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MicroRNA-199a inhibits EMT process in AGS cell by regulating HIF-1α gene expression

ZhengHeng，ZhangWei，WangKang

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

Objective To investigate the effect of microRNA-199a(miR-199a) on hypoxia epithelial-mesenchymal transition(EMT) of gastric carcinoma by regulating hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) gene expression and its probable mechanism.Methods After hypoxia for 24 h,si-HIF-1α and miR-199a mimic were transfected to gastric cancer cells.The expression levels of miR-199 was detected by using quantitative real-time PCR.The levels of HIF-1α and related protein in EMT were examined by Western blotting.Gastric cancer cell morphology were observed with an inverted microscope.Results After hypoxia,the expression levels of miR-199a mRNA and E-cadherin protein were decreased,and the expression levels of HIF-1α and mesenchymal cell marker protein were increased.After transfection of miR-199a mimic,the expression of HIF-1α was inhibited.Then,the transfection of si-HIF-1α and miR-199a mimic could partially reverse the effect of hypoxia and inhibit the development of EMT process.Conclusion miR-199a could suppress the transition process and EMT process under hypoxia,it is may be achieved by down-regulating HIF-1α gene expression.

miR-199a；hypoxia inducible factor-1α；hypoxia；epithelial-mesenchymal transiton

鄭桁(1974-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸外科及胃腸腫瘤方面的研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.006

R

A

1671-8348(2016)35-4914-03

2016-05-18

2016-08-06)