右美托咪定抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡

李建立，尹德云，王蘊(yùn)欣，吳紅海，侯艷寧

(1.河北省人民醫(yī)院麻醉科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科，石家莊 050051；3.白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科，石家莊 050082)

右美托咪定抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡

李建立1，尹德云2，王蘊(yùn)欣1，吳紅海3，侯艷寧3

(1.河北省人民醫(yī)院麻醉科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科，石家莊 050051；3.白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科，石家莊 050082)

目的 探討右美托咪定抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。方法 體外原代培養(yǎng)7d的大鼠皮層神經(jīng)元，給予500μmol/L丙泊酚和(或)不同濃度右美托咪定處理12h后，分為丙泊酚組、右美托咪定+丙泊酚組，對(duì)照組給予同溶劑的20%脂肪乳，用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組神經(jīng)元存活率的變化，Hoechst33258核染色法檢測(cè)神經(jīng)元調(diào)亡，蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)測(cè)定神經(jīng)元磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)和細(xì)胞色素C(Cyt-C)蛋白水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率明顯下降，神經(jīng)元凋亡率明顯增加，pCREB蛋白水平明顯降低，Cyt-C蛋白水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組神經(jīng)元存活率明顯增加，神經(jīng)元凋亡率明顯下降，pCREB蛋白水平明顯增加，Cyt-C蛋白水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 右美托咪定可對(duì)抗丙泊酚引起的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與增加pCREB蛋白水平，降低Cyt-C蛋白水平有關(guān)。

丙泊酚；右美托咪定；原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元；凋亡；磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；細(xì)胞色素C

丙泊酚通過激動(dòng)γ氨基丁酸A型受體(gamma amino acid type A receptor，GABAR)和抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)發(fā)揮麻醉作用，被廣泛用于麻醉誘導(dǎo)和維持。藥典顯示3歲以下患兒慎用丙泊酚，但在臨床工作中丙泊酚被廣泛用于嬰幼兒麻醉。丙泊酚是否對(duì)發(fā)育期大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷目前觀點(diǎn)不一。最近研究表明，丙泊酚可引起發(fā)育期動(dòng)物大腦廣泛腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和原代培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡[1-4]。因此，尋找藥物抑制丙泊酚發(fā)育期神經(jīng)毒性已成為嬰幼兒麻醉的重要研究?jī)?nèi)容。右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和拮抗交感神經(jīng)活性的作用，可對(duì)抗丙泊酚引起的原代培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡和發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)損傷，但具體機(jī)制還不清楚[5-6]。本文利用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元研究右美托咪定對(duì)抗丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丙泊酚(Diprivan，意大利AstraZeneca公司，批號(hào)：KW814)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)14102132)；20%脂肪乳購自廣州百特公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)液、B27促生長(zhǎng)劑購自美國Gibco公司，LY294002、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司，Hoechst33258熒光染料和胰蛋白酶購自北京索來寶公司，磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP response-element binding protein，pCREB)和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)抗體購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)。體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 觀察右美托咪定對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用時(shí)，分為對(duì)照組(給予同溶劑的20%脂肪乳)、丙泊酚組(丙泊酚終濃度為500 μmol/L)、右美托咪定+丙泊酚組(右美托咪定終濃度分別為0.001、0.010、0.100、1.000 μmol/L，丙泊酚終濃度為500 μmol/L)。檢測(cè)各種處理對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響時(shí)，分為對(duì)照組(給予同溶劑的20%脂肪乳)、丙泊酚組(終濃度為500 μmol/L)、右美托咪定+丙泊酚組(右美托咪定終濃度為0.1 μmol/L，丙泊酚終濃度為500 μmol/L)。

1.2.3 四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)神經(jīng)元存活率 將細(xì)胞接種于96孔板，體外培養(yǎng)至第7天分別給予不同的藥物處理12 h后，按文獻(xiàn)[7]應(yīng)用MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率。

1.2.4 Hoechst33258核染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 將神經(jīng)元接種于6孔培養(yǎng)板中，按上述方法培養(yǎng)，分別給予不同藥物處理后，按文獻(xiàn)[7]應(yīng)用Hoechst33258核染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)測(cè)定pCREB和Cyt-C蛋白水平 細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法檢測(cè)樣品蛋白水平。取待測(cè)蛋白質(zhì)50 μg加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳l.5 h，轉(zhuǎn)膜1 h，加入pCREB和Cyt-C抗體(1∶2 000)，4 ℃過夜，常規(guī)洗滌，加羊抗鼠二抗(1∶5 000)37 ℃孵育60 min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光、顯影、掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)β-actin蛋白為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元存活率的影響 與對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丙泊酚組比較，右美托咪定可濃度依賴性提高神經(jīng)元存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與丙泊酚組比較。

圖1 不同處理對(duì)神經(jīng)元存活率的影響

2.2 不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響 與對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組皮層神經(jīng)元凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元pCREB蛋白水平的影響 與對(duì)照組比較，丙泊酚組pCREB蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組pCREB蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

A：Hoechst33258核染色法(×200)；a：對(duì)照組；b：丙泊酚組；c：右美托嘧喧+丙泊酚組；*：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與丙泊酚組比較。

圖2 不同處理對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響

*：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與丙泊酚組比較。

圖3 不同處理對(duì)神經(jīng)元pCREB蛋白水平的影響

*：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與丙泊酚組比較。

圖4 不同處理對(duì)神經(jīng)元Cyt-C蛋白水平的影響

2.4 不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元Cyt-C蛋白水平的影響 與對(duì)照組比較，丙泊酚組Cyt-C蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組Cyt-C蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

3 討 論

全世界每年有眾多患兒因各種原因接受全身麻醉。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道丙泊酚具有發(fā)育期神經(jīng)毒性，可對(duì)發(fā)育期動(dòng)物大腦和原代培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷[1-4]，因此，丙泊酚的發(fā)育期神經(jīng)毒性引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，同時(shí)尋找安全有效防治丙泊酚發(fā)育期神經(jīng)毒性的藥物具有十分重要的臨床意義。

右美托咪定是臨床上常用的高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)藥，具有抑制交感神經(jīng)，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛和減少麻醉藥用量等作用，作為麻醉輔助藥物被廣泛用于臨床麻醉中。目前研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可對(duì)多種神經(jīng)損傷模型產(chǎn)生保護(hù)作用，如對(duì)抗缺血再灌注損傷[8]，高氧誘導(dǎo)的發(fā)育期大腦損傷[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可抑制丙泊酚引起的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率的下降，其機(jī)制尚不清楚[6]。另有研究表明，右美托咪定不會(huì)對(duì)發(fā)育期大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷[10]。本文利用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元研究右美托咪定對(duì)抗丙泊酚引起原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷的機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率明顯降低，右美托咪定可濃度依賴性地提高神經(jīng)元的存活率。Hoechst33258核染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率明顯增加，與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率明顯降低。

CREB為神經(jīng)保護(hù)的中樞調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)，其磷酸化在調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，另外磷酸化CREBser-133位點(diǎn)可介導(dǎo)神經(jīng)元存活及突觸的形成，通過調(diào)控大量促神經(jīng)元存活基因如Bcl-2和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚通過抑制CREB的磷酸化水平引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[12-13]，右美托咪定可通過提高原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元pCREB蛋白水平，進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元凋亡[14]。本文Westernblotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組pCREB蛋白水平明顯降低，與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組pCREB蛋白水平明顯增加，提示丙泊酚通過降低皮層神經(jīng)元pCREB蛋白水平引起皮層神經(jīng)元凋亡，而右美托咪定可通過提高pCREB蛋白水平對(duì)抗丙泊酚誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡。Cyt-C在線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用，Cyt-C釋放入細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟。Cyt-C是線粒體呼吸鏈上的重要組成成分，生理狀態(tài)下Cyt-C存在于線粒體內(nèi)，當(dāng)刺激因子作用于細(xì)胞后線粒體通過多種離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，導(dǎo)致內(nèi)膜兩側(cè)離子濃度差的變化，引起線粒體膜電位的下降，使線粒體膜電位通透性增加，Cyt-C釋放入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3),引起細(xì)胞凋亡。本文Westernblotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組Cyt-C蛋白水平明顯增加，與丙泊酚組比較，右美托咪定+丙泊酚組Cyt-C蛋白水平明顯下降，提示丙泊酚通過增加皮層神經(jīng)元Cyt-C蛋白水平引起皮層神經(jīng)元凋亡，而右美托咪定可通過降低Cyt-C蛋白水平對(duì)抗丙泊酚誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，右美托咪定通過抑制丙泊酚引起的神經(jīng)元pCREB蛋白水平的下降，降低Cyt-C蛋白水平，抑制丙泊酚誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡。本研究為圍術(shù)期應(yīng)用右美托咪定預(yù)防丙泊酚引起的發(fā)育期大腦損傷提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

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Dexmedetomidine inhibits propofol-induced apoptosis in primary cultured cortical neurons*

LiJianli1,YinDeyun2,WangYunxin1，WuHonghai3,HouYanning3

(1.DepartmentofAnesthesiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China; 2.DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China; 3.DepartmentofPharmacy,BethuneInternationalPeaceHospitalofChinesePLA,Shijiazhuang,Hebei050082,China)

Objective To investigate the mechanisms of the protective effects of dexmedetomidine against the propofol-induced neuroapoptosis in primary cultured cortical neurons．Methods The neurons were cultured for 7 days and treated with 500 μmol/L propofol and(or) different concentrations of dexmedetomidine,then were divided into the propofol treatment group,propofol+dexmedetomidine treatment group.The neurons in the control group were treated with 20% fat emulsion dissolved in the same solvent.12 hours after different treatments,neuron viability was measured by using MTT assay,neuroapoptosis was detected by using Hoechst33258 staining,and the levels of pCREB and Cyt-C protein were detected by using Western blotting.Results Compared with the control group,propofol inhibited neuron viability greatly,the neuroapoptosis increased greatly,the level of pCREB decreased greatly and the level of Cyt-C increased greatly,there were statistically significant differences(P<0.01).Compared with propofol treatment group,dexmedetomidine increased neuron viability greatly,the neuroapoptosis decreased greatly,the level of pCREB increased greatly and the level of Cyt-C decreased greatly,there were statistically significant differences.Conclusion Dexmedetomidine exerts the neuroprotective effects against propofol-induced neuroapoptosis,which may be associated with the increase of pCREB level and the decrease of Cyt-C level.

propofol；dexmedetomidine；primary cultured cortical neurons；apoptosis；phosphorylated cAMP response-element binding protein；cytochrome C

河北省衛(wèi)生廳指令性課題資助項(xiàng)目(ZL20140095)；2015年政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究項(xiàng)目(361003-6)。 作者簡(jiǎn)介：李建立(1976-)，副教授，博士，主要從事麻醉藥理學(xué)研究。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.005

R

A

1671-8348(2016)35-4911-03

2016-05-19

2016-08-07)