新生期大鼠反復驚厥后8-OH-dG和CytC的表達與細胞凋亡的關(guān)系研究

劉月影，王春紅，崔 盈，倪 宏

(1.江南大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇無錫 214062；2.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)病學研究室，江蘇蘇州 215003)

新生期大鼠反復驚厥后8-OH-dG和CytC的表達與細胞凋亡的關(guān)系研究

劉月影1，王春紅1，崔 盈1，倪 宏2

(1.江南大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇無錫 214062；2.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)病學研究室，江蘇蘇州 215003)

目的 探討新生期大鼠反復驚厥后8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)和細胞色素C(CytC)的表達與細胞凋亡的關(guān)系。方法 將24只日齡8d的大鼠分為驚厥組和對照組，驚厥組進一步分為驚厥后3h、24h、48h，每組6只。采用吸入三氟乙醚誘導新生期大鼠反復驚厥持續(xù)狀態(tài)模型，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清8-OH-dG水平，實時熒光定量PCR(RT-PCR)和原位末端標記法(TUNEL)分別檢測海馬CytC的表達和細胞凋亡。結(jié)果 與對照組相比，TUNEL顯示驚厥組海馬神經(jīng)元細胞凋亡明顯增多(P<0.01),呈棕黃色顆粒。血清8-OH-dG水平在末次驚厥后各時間點均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。與對照組相比，CytC在末次驚厥后3h、24h增高(P<0.01)，48h后下降至正常水平。8-OH-dG、CytC與細胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.662、0.565,P<0.05)。結(jié)論 線粒體損傷可能參與了發(fā)育期反復驚厥后腦損傷。

反復驚厥；8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷；細胞色素C；細胞凋亡；新生大鼠

線粒體途徑是細胞凋亡的重要途徑[1]。當有害物質(zhì)如活性氧自由基等作用于線粒體，一方面可以使線粒體內(nèi)膜通透性增高,線粒體腫脹，外膜破裂，線粒體凋亡標志物細胞色素C(CytC)釋放至胞質(zhì)，通過激活Caspase家族誘發(fā)細胞凋亡；另一方面可以通過線粒體DNA 鏈斷裂、位點突變、雙鏈畸變及DNA堿基的氧化損傷等形式造成 DNA 損傷，進一步導致細胞凋亡，8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)作為損傷DNA后形成的最常見產(chǎn)物，是DNA損傷的重要指標[2]。線粒體作為細胞內(nèi)的重要細胞器在癲癇發(fā)病中的作用已受到學者的廣泛關(guān)注[3]。本研究擬通過建立新生期反復驚厥大鼠模型，觀察反復驚厥發(fā)作后8-OH-dG 和CytC的表達及其與細胞凋亡的關(guān)系，探討線粒體損傷在發(fā)育期反復驚厥腦損傷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只日齡 8 d 的健康 SD 大鼠，體質(zhì)量 18.23～21.79 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[許可證號 SCXK(滬)2012-0002]。大鼠分為驚厥組和對照組，驚厥組進一步分為驚厥后3 h、24 h、48 h亞組，每組6只。

1.1.2 主要儀器與試劑 三氟乙醚 (Aldrich Chem．Co.PO．Box355，美國)密封避光保存；8-OH-dG試劑盒(Cayman Chemical Company，美國)；TUNEL試劑盒 (Boehringer Mannheim，德國)；Trizol(Invitrogen Life Technologies，美國)；逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核苷酸酶抑制劑(Invitrogen，美國)； Light Cycler 2.0 PCR儀(Roche，德國)；RT6000型酶標儀(霄杜生命科學有限公司，深圳)；引物根據(jù)Gene Bank核酸序列，Premier 3.0軟件設計，上海生工公司合成。Cyt-C：上游引物為5′-GGT GAT GTT GAA AAA GGC AAG AA-3′，下游引物為5′-TGC TTG CCT CCT TTT TCC A-3′；β-actin：上游引物為5′-GAC AGG ATG CAG AAG GAG ATT ACT-3′，下游引物為5′-TGA TCC ACA TCT GCT GGA AGG T-3′。

1.2 方法

1.2.1 新生期大鼠反復驚厥模型的建立 采用三氟乙醚按照田甜等[4]的方法致反復驚厥，使驚厥持續(xù)30 min；每天誘導1次，連續(xù)7 d(驚厥組)；對照組除不給予三氟乙醚外其他處理與驚厥組相同。

1.2.2 標本的制備和取材 取對照組和反復驚厥后3、24、48 h大鼠各6只，10%水合氯醛麻醉后心臟取血，并立即斷頭，冰上取一側(cè)海馬-80 ℃保存?zhèn)溆糜趯崟r熒光定量PCR(RT-PCR)檢測CytC表達水平；另一半腦組織立即置于10%的多聚甲醛中固定，用于制作石蠟標本進行蘇木精-伊紅(HE)、原位末端標記法(TUNEL)染色；取出的血液靜置1 h后4 ℃ 1 800 r/min離心10 min，取上清液，分裝于EP管中，立即置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫悦嘎?lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測8-OH-dG水平。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 取10%多聚甲醛溶液中固定1周以上的腦組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切片，脫蠟，TUNEL法檢測細胞凋亡。操作過程按凋亡試劑盒說明書進行，在高倍視野下(×400)選6個不同的視野，計算各個視野的陽性細胞數(shù)(胞核呈棕黃色顆粒)。

1.2.4 ELISA法檢測血清8-OH-dG水平 檢測前取出-80 ℃保存標本，常溫解凍，所有標本均為同批測定。各項操作嚴格按試劑盒說明進行，每份標本重復3次，取其均值。結(jié)果基于每次8-OH-dG標準溶液實驗的線形校正曲線計算，所得數(shù)據(jù)以每微克DNA所含的8-OH-dG的皮克數(shù)(pg/μg)表示。

1.2.5 RT-PCR法檢測CytC mRNA的表達 參照 Trizol試劑說明書，提取海馬的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR 擴增采用SYBR Premix ExTaq探針法。PCR 反應用β-actin 作為內(nèi)參，反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，循環(huán)45次。繪制擴增曲線，反應結(jié)束后得到各反應管的循環(huán)閾值(Ct)，將目的基因CytC的Ct值與內(nèi)參基因β-actin的Ct值相減得到校正的目的基因CytC的Ct值，即△Ct，CytC基因相對表達量以2-△Ct表示。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡細胞TUNEL染色及計數(shù)結(jié)果 海馬CA1區(qū)，對照組少見TUNEL陽性細胞，細胞核呈深染棕褐色(圖1A)，驚厥組末次驚厥后3h凋亡細胞開始明顯表達，高峰表達主要出現(xiàn)于末次驚厥后24h(圖1B),末次驚厥后48h可見陽性細胞開始衰減。驚厥組末次驚厥后3、24、48h凋亡細胞數(shù)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見表1。

A:對照組;B:驚厥組末次驚厥后24h。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色凋亡細胞表達(×400)

2.2 血清8-OH-dG水平的動態(tài)變化 與對照組相比，驚厥組血清8-OH-dG水平在末次驚厥發(fā)作后 3、24、48h均升高(P<0.05或P<0.01)；其中末次驚厥后24h增高最明顯，見表1。

2.3CytCmRNA表達水平的動態(tài)變化 與對照組相比，驚厥組大鼠CytC表達在末次驚厥后3h升高，持續(xù)至驚厥發(fā)作后24h(P<0.01)，在驚厥發(fā)作后48h下降至正常水平，見表1。

表1 新生期大鼠反復驚厥后不同時間點細胞凋亡情況及8-OH-dG、CytC的表達

*P<0.05，#P<0.01,與對照組比較。

2.4 相關(guān)性分析 血清8-OH-dG水平及CytCmRNA表達水平均與凋亡細胞數(shù)呈正相關(guān)(r值分別為0.662、0.565，P值分別為0.001、0.003)。

3 討 論

研究表明，細胞凋亡是反復驚厥發(fā)作后腦損傷的主要形式[5]。在細胞凋亡的死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號和線粒體信號3條途徑中，線粒體途徑是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病較重要的細胞凋亡途徑[6]。

線粒體既是能量代謝和細胞呼吸的重要場所，更是細胞凋亡的中心[7]。而CytC是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分，其既參與線粒體能量代謝，當其釋放到細胞質(zhì)中又直接參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)CytC從線粒體釋放到細胞質(zhì)是多種細胞凋亡的共同表現(xiàn)，在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，敲除CytC基因的細胞能對刺激因素誘導的凋亡具有明顯的耐受性[8]。已有研究表明，癲癇發(fā)作后N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體激活,鈣超載、活性氧等可引起線粒體的通透性轉(zhuǎn)運孔開放，CytC釋放至細胞質(zhì)[9]。CytC與凋亡蛋白活化因子-1(Apaf-1)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9形成CytC/Apaf-1/Caspase-9復合體，作用于下游的Caspase-3，從而誘發(fā)細胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CytC在反復驚厥發(fā)作后海馬組織中表達量明顯增加，并在3h時呈現(xiàn)出明顯表達，持續(xù)至驚厥發(fā)作后24h。結(jié)合本課題組前期對反復驚厥后Caspase-3表達變化在12h出現(xiàn)峰值的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[11]，CytC從線粒體中釋放后，可進一步激活下游的Caspase-3級聯(lián)反應誘導細胞凋亡；本研究TUNEL法亦顯示在驚厥發(fā)作后24h海馬CA1區(qū)細胞凋亡達到高峰，CytC和凋亡細胞數(shù)呈正相關(guān)，進一步說明CytC與細胞凋亡有關(guān)。但末次驚厥發(fā)作后48hCytC已經(jīng)回落到正常水平，而細胞凋亡仍有輕度升高，提示CytC增高后通過Caspase-3級聯(lián)反應等機制才能誘導細胞凋亡的發(fā)生，存在一定的后續(xù)效應，進一步支持上述觀點。

氧化應激是導致驚厥發(fā)作后腦損傷的重要途徑，在動物實驗及人體內(nèi)都證實，驚厥發(fā)作后氧化應激與驚厥發(fā)作后細胞凋亡有關(guān)[12-13]。在機體內(nèi)存在氧化和抗氧化兩大系統(tǒng)，大量的實驗證實，在驚厥發(fā)作后該系統(tǒng)失衡，氧化系統(tǒng)被激活，抗氧化物酶活性降低，腦防御氧自由基功能受損或降低，機體的總抗氧化能力下降，活性氧產(chǎn)生過多和聚集，進一步誘導細胞凋亡[14]。DNA損傷是氧化損傷的重要表現(xiàn)之一[2]，線粒體DNA是DNA的重要組成部分，在機體內(nèi)發(fā)揮重要功能。當機體受到外界刺激時，DNA鏈上鳥嘌呤G被氧化為8-OH-dG，可導致基因發(fā)生G→T突變,8-OH-dG的部位還易發(fā)生堿基脫落和DNA鏈斷裂。因此,檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物 8-OH-dG表達,將為探討DNA氧化損傷與反復驚厥后腦損傷發(fā)生的關(guān)系提供生物標志[15]。本實驗研究顯示，反復驚厥發(fā)作后8-OH-dG持續(xù)增高至驚厥發(fā)作后48h，提示在反復驚厥發(fā)作后存在DNA損傷。8-OH-dG與細胞凋亡的相關(guān)性分析顯示，二者之間呈正相關(guān)，但8-OH-dG先于細胞凋亡下降，提示DNA損傷后可能通過一系列的機制才能進一步導致細胞凋亡的發(fā)生，與Qiu等[16]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，新生期反復驚厥后存在細胞凋亡，線粒體途徑在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。線粒體損傷及可能的修復途徑是一個非常復雜的過程，涉及眾多因子的參與，還待更進一步的深入研究，從而為治療發(fā)育期驚厥性腦損傷提供新的思路和治療靶點。

[1]HiebertJB,ShenQ,ThimmeschAR,etal.Traumaticbraininjuryandmitochondrialdysfunction[J].AmJMedSci,2015,350(2):132-138.

[2]GürlerH,BilgiciB,AkarAK,etal.IncreasedDNAoxidation(8-OHdG)andproteinoxidation(AOPP)bylowlevelelectromagneticfield(2.45GHz)inratbrainandprotectiveeffectofgarlic[J].IntJRadiatBiol,2014,90(10):892-896.

[3]ZsurkaG,KunzWS.Mitochondrialdysfunctionandseizures:theneuronalenergycrisis[J].LancetNeurol,2015,14(9):956-966.

[4]田甜,孫奇,趙東敬,等.新生期大鼠反復驚厥后皮質(zhì)叢生蛋白的表達及生酮飲食的干預作用[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(9):694-697.

[5]LiLY,LiJL,ZhangHM,etal.TGFβ1treatmentreduceshippocampaldamage,spontaneousrecurrentseizures,andlearningmemorydeficitsinpilocarpine-treatedrats[J].JMolNeurosci,2013,50(1):109-123.

[6]StreckEL,Gon?alvesCL,FurlanettoCB,etal.Mitochondriaandthecentralnervoussystem:searchingforapathophysiologicalbasisofpsychiatricdisorders[J].RevBrasPsiquiatr,2014,36(2):156-167.

[7]王佺荃,張文麗,元小冬,等.線粒體在細胞凋亡中的作用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2015,12(6):143-146.

[8]GuaragnellaN,PassarellaS,MarraE,etal.Knock-outofmetacaspaseand/orcytochromecresultsintheactivationofaROS-independentaceticacid-inducedprogrammedcelldeathpathwayinyeast[J].FEBSLett,2010,584(16):3655-3660.

[9]BuddSL,TennetiL,LishnakT,etal.Mitochondrialandextramitochondrialapoptoticsignalingpathwaysincerebrocorticalneurons[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(11):6161-6166.

[10]WangQS,SongF,ZhaoX,etal.Expressionchangesofapoptotic-relatedproteinsinnervetissuesofratstreatedwithallylchloride[J].Toxicology,2007,231(1):58-67.

[11]NiH,FengX,XiaoZJ,etal.DynamicpatternofgeneexpressionofZnT-4,caspase-3,LC3,andPRG-3inratcerebralcortexfollowingflurothyl-inducedrecurrentneonatalseizures[J].BiolTraceElemRes,2011,143(3):1607-1615.

[12]PuttacharyS,SharmaS,StarkS,etal.Seizure-inducedoxidativestressintemporallobeepilepsy[J].BiomedResInt,2015(2015):745613.

[13]MorimotoM,SatomuraS,HashimotoT,etal.Oxidativestressmeasurementandpredictionofepilepticseizureinchildrenandadultswithseveremotorandintellectualdisabilities[J].JClinMedRes,2016,8(6):437-444.

[14]TsaiHL,ChangCN,ChangSJ.Theeffectsofpilocarpine-inducedstatusepilepticusonoxidativestress/damageindevelopinganimals[J].BrainDev,2010,32(1):25-31.

[15]OhkawaN,OkumuraA,MiyataR,etal.Cerebrospinalfluidoxidativestressmarkerlevelsandcytokineconcentrationsinaneonatewithincontinentiapigmenti[J].PediatrNeurol,2014,51(5):737-740.

[16]QiuX,CaoL,YangX,etal.Roleofmitochondrialfissioninneuronalinjuryinpilocarpine-inducedepilepticrats[J].Neuroscience,2013,245:157-165.

The relationship between the expression of 8-OH-dG，CytC and apoptosis in neonatal rats with recurrent seizures*

LiuYueying1，WangChunhong1，CuiYing1，NiHong2

(1.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofJiangnanUniversity,Wuxi，Jiangsu214062，China； 2.NeurologyLaboratory,Children′HospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215003，China)

Objective To investigate the relationship between the expression of 8-OH-dG,CytC and cell apoptosis in neonatal rats with recurrent seizures.Methods Totally 24 eight-day-old SD rats were randomly divided into two groups:the recurrent seizures group(RS group,30 minutes seizure induced of flurothyl once per day for 7 consecutive days) and control group(CON group,rats were treated without flurothyl).At designated time points(CON group,3,24,48 h after the last seizure in RS group),the hippocampus of six rats from each group were rapidly dissected out after blood drawn from heart.The 8-OH-dG was detected by ELISA method.The expression of CytC and apoptosis were detected by RT-PCR and TUNEL method respectively.Results Compared with the CON group,TUNEL showed that the apoptotic cell counts in RS group were rapidly increased，especially at 24 h after the last seizures[(54.83±7.16)cells/HPFvs. (15.16±2.48)cells/HPF，P<0.01]．In RS group，the serum levels of 8-OH-dG were significantly higher than that in CON group,particularly at 24 h after the last seizures[(1.263 83± 0.221 30)pg/μgvs.(0.822 16±0.039 380)pg/μg,P<0.01].The expression level of CytC mRNA significantly increased at 3 h after the last seizures(0.114 36±0.005 28vs. 0.093 01±0.009 79,P<0.01) and at 24 h after the last seizures(0.105 62±0.007 26vs. 0.093 01±0.009 79,P<0.01),then decreased to normal level.There were obviously positive correlation between 8-OH-dG,CytC and apoptosis(r=0.662,0.565;P<0.05).Conclusion The levels of 8-OH-dG and CytC were significantly up-regulated and had positive correlation with apoptosis,suggesting that mitochondrial damage might be involved in the brain injury after the recurrent seizures in neonatal rats.

recurrent seizures；8-OH-dG；CytC ；cell apoptosis；neonatal rats

國家自然科學基金資助項目(81471337)；無錫市衛(wèi)計委科研項目(MS201518)。 作者簡介：劉月影(1975-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.004

R

A

1671-8348(2016)35-4908-03

2016-07-12

2016-10-21)