丹芍化纖膠囊通過(guò)上調(diào)ALK2、p-Smad1/5/8改善四氯化碳所致大鼠肝纖維化

余 蕾，趙雪珂，穆 茂，李 宏，姚玉梅，祝娟娟，張寶芳，劉 洋，國(guó) 惠

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.產(chǎn)前診斷中心；2.感染科，貴陽(yáng) 550004)

丹芍化纖膠囊通過(guò)上調(diào)ALK2、p-Smad1/5/8改善四氯化碳所致大鼠肝纖維化

余 蕾1，趙雪珂2△，穆 茂2，李 宏2，姚玉梅2，祝娟娟2，張寶芳2，劉 洋2，國(guó) 惠2

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.產(chǎn)前診斷中心；2.感染科，貴陽(yáng) 550004)

目的 觀察丹芍化纖膠囊(DSHX)對(duì)四氯化碳(CCl4)所致肝纖維化大鼠肝臟骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅰ型受體(BMPR-Ⅰ)中的激活素受體樣激酶2(ALK2)、磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)與DNA結(jié)合(分化)抑制因子2(Id2)表達(dá)的影響，探討該藥治療肝纖維化的可能機(jī)制。方法 雄性Wistar大鼠50只分為對(duì)照組(A組)、肝纖維化模型組(B組)、自然恢復(fù)組(C組)、DSHX低劑量治療組(D組)、DSHX高劑量治療組(E)，每組10只。除A組外，其余各組用CCl4復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化模型，共8周。D、E組分別用0.5、1.0g/kgDSHX灌胃8周，1次/日。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定大鼠肝勻漿透明質(zhì)酸(HA)、羥脯氨酸(Hyp)水平，Masson染色法觀察肝組織內(nèi)膠原纖維沉積程度，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肝組織ALK2、Id2mRNA水平，蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)分析肝組織ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)。結(jié)果B組肝勻漿HA、Hyp水平高于A組(P<0.01)，肝組織ALK2、Id2mRNA和蛋白的表達(dá)及p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)均低于A組(P<0.01)；D、E組大鼠肝纖維化程度較B組和C組明顯改善，肝勻漿HA、Hyp水平均低于B組和C組(P<0.01)，肝組織ALK2mRNA和蛋白及p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)均高于B組和C組(P<0.01)，肝組織Id2mRNA的表達(dá)高于B組和C組(P<0.01)，但I(xiàn)d2蛋白表達(dá)與B組、C組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論DSHX對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用機(jī)制可能與上調(diào)ALK2、p-Smad1/5/8的表達(dá)有關(guān)。

肝纖維化；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；Smad1/5/8；DNA結(jié)合/分化抑制因子；丹芍化纖膠囊

肝纖維化是多種病因所致肝病慢性化的共同必經(jīng)歷程，嚴(yán)重威脅人類健康，增加國(guó)家醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。肝細(xì)胞在長(zhǎng)期反復(fù)損傷和修復(fù)的過(guò)程中，易出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡，表現(xiàn)為ECM生成增多及降解減少，逐漸形成肝纖維化，部分患者甚至進(jìn)展為肝硬化或肝癌[2]。醫(yī)學(xué)界對(duì)肝纖維化的發(fā)生機(jī)制仍然處于探索階段，目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(HSC)活化是其中心環(huán)節(jié)，多種細(xì)胞因子參與了HSC活化、增殖的過(guò)程[3]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及其所介導(dǎo)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與肝纖維化密切相關(guān)，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)是TGF-β1的天然拮抗因子，能負(fù)向調(diào)控TGF-β1的致纖維化作用[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹芍化纖膠囊(DSHX)可通過(guò)上調(diào)大鼠肝臟BMP-7表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)肝纖維化的改善[6]，但其對(duì)BMP-7通路肝纖維化相關(guān)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響仍然不盡詳實(shí)。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)以大鼠肝纖維化模型為研究對(duì)象，觀測(cè)DSHX對(duì)大鼠肝組織中BMP-7下游信號(hào)分子BMPⅠ型受體(BMPR-Ⅰ)中的主要效用分子激活素受體樣激酶2(ALK2)，p-Smad 1/5/8及DNA結(jié)合(分化)抑制因子2(Id2)表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討DSHX逆轉(zhuǎn)肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠50只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)SCXK(渝)2007-0003。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，自然采光，室溫15～25 ℃，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.1.2 主要試劑 丹芍化纖膠囊(由漢防己甲素、丹參、赤芍、黃芪、銀杏葉等組成)，貴陽(yáng)制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)20121128)，棕黃色細(xì)顆粒膠囊制劑，臨用前取膠囊內(nèi)容物研磨成粉末，蒸餾水稀釋至所需濃度。透明質(zhì)酸(HA)、羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)試劑盒(南京建成，批號(hào)20130212，20130215)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司，批號(hào)00086098)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司，批號(hào)KGP250)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)23235)；ALK2、Id2一抗(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab135633、ab154379)，p-Smad1/5/8一抗(美國(guó)Santa cruz公司，批號(hào)sc-12353)；ALK2上、下游引物序列分別為5′- TCC AGG TGG ATT GTT TCG ATT CTT A -3′和5′- CAC ATC GTA GAA CGG TGG CTT G-3′，引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度531 bp；Id2上、下游引物序列分別為5′- TGT CAG CGT CCT GCA TCA CCA GA -3′和5′- CCA CAC AGT GCT TTG CTG GCA -3′，987 bp；β-actin上、下游引物序列分別為5′-TCC TCC TGA GCG CAA GTA CTC T-3′和5′-GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG AA-3′，1 536 bp，上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 核酸定量?jī)x(美國(guó)Amersham Biosciences公司)，核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(DA7600型，中山大學(xué)達(dá)安基因公司)，752紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技公司)，Gel Doc EQ凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，顯微圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 大鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組(A組)、肝纖維化模型組(B組)、自然恢復(fù)組(C組)及DSHX低、高劑量治療組(D、E組)，每組10只。除對(duì)照組給予正常飲食外，其余各組用四氯化碳(CCl4)復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化模型，共8周[6]。造模結(jié)束后處死模型組大鼠，對(duì)照組及自然恢復(fù)組正常飼養(yǎng)，兩治療組分別予DSHX低劑量(0.5 g/kg)、高劑量(1.0 g/kg)灌胃8周，1次/日[6]。16周末麻醉后處死余下大鼠，常規(guī)留取血清，全自動(dòng)生化儀測(cè)量血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性。留取全部肝臟，稱量肝臟濕重，計(jì)算各組大鼠肝指數(shù)。制備肝組織勻漿，按試劑盒操作測(cè)定各組大鼠肝勻漿HA、Hyp水平。

1.2.2 肝臟纖維化程度分析 取相同部位肝臟，石蠟包埋，切片，行Masson染色觀察肝組織內(nèi)膠原纖維沉積程度，由本院病理科完成。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織切片圖像采集并輸入Biomias2001圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行單位(視場(chǎng))面積纖維組織面積測(cè)量。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視場(chǎng)，HSV顏色分割法測(cè)量單位面積內(nèi)纖維組織的面積，計(jì)算各組小鼠肝內(nèi)纖維組織面積的均值，比較各組大鼠肝組織纖維化程度。

1.2.3 肝組織ALK2及Id2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肝組織ALK2及Id2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。采用Trizol-酚-氯仿一步法提取總RNA并純化，測(cè)定RNA水平，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行RT-PCR。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以β-actin作內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換得到各樣品的拷貝數(shù)(Ct值)，以Ct值的均數(shù)反映目的基因的表達(dá)水平。

1.2.4 肝組織ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)肝組織ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)。提取蛋白并測(cè)定蛋白含量，取蛋白質(zhì)樣品40 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別用ALK2(1∶1 000)、Id2(1∶1 000)、p-Smad1/5/8抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5 000)室溫1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光顯影，Gel Doc EQ凝膠成像儀掃描，Quantity One軟件分析結(jié)果。以β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的相對(duì)比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況A組大鼠皮毛光澤，行動(dòng)靈活，食量及大便正常。B組大鼠皮毛無(wú)光澤，活動(dòng)、進(jìn)食及飲水量減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B組死亡3只，C組、D組各死亡2只，E組死亡1只。

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較；c：P<0.01，與C組比較。

圖1 各組大鼠血清ALT、AST、肝指數(shù)及肝勻漿HA和Hyp水平比較

2.2 各組大鼠血清ALT、AST、肝指數(shù)、肝勻漿HA及Hyp比較B～E各組血清ALT、AST均高于A組，C～E組均低于B組，D、E組低于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=423.864、151.273，均P<0.01)。B～E各組肝指數(shù)均高于A組，C～E組均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=388.373，P<0.01)。B～E各組肝勻漿HA、Hyp均高于A組，C～E組均低于B組，D、E組低于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3 120.282、377.657，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠肝組織Masson染色及纖維化半定量檢測(cè)結(jié)果A組大鼠肝組織可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原纖維，B組大鼠肝組織膠原纖維增生、寬大，肝小葉內(nèi)呈延伸分布，C～E組大鼠肝組織增生的膠原纖維較B組均減少、變細(xì)，部份向肝小葉延伸；B～E組纖維化面積均高于A組，C～E組纖維化面積均低于B組，D、E組纖維化面積均低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.912，P<0.01)，見(jiàn)圖2、3。

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組；E：E組；a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較；c：P<0.01，與C組比較。

圖2 各組大鼠肝組織Masson染色(×100)

圖3 各組大鼠肝纖維化面積比較

2.4 各組大鼠肝組織ALK2及Id2mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度B～E組ALK2與Id2的mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度均低于A組，C～E組均高于B組，而D、E組均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.348、199.016，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較；c：P<0.01，與C組比較。

圖4 各組大鼠肝組織ALK2和Id2的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 各組大鼠肝組織ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白質(zhì)表達(dá)情況B～E組ALK2與p-Smad1/5/8的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度均低于A組，C～E組均高于B組，D組、E組高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=306.770、133.840，P<0.01)；B～E組Id2蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.331，P<0.01)，但B、C、D、E各組間表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較；c：P<0.01，與C組比較。

圖5Westernblotting檢測(cè)各組大鼠肝組織ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

終末期慢性肝病如肝硬化、肝癌給人類帶來(lái)的是一個(gè)嚴(yán)峻而棘手的公共健康問(wèn)題，為減少慢性肝病所造成的健康威脅及醫(yī)療壓力，除了祛除病因外，及時(shí)控制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展顯得至關(guān)重要[2]。目前，積極探索肝纖維化的發(fā)生機(jī)制與疾病防治方法已成為醫(yī)務(wù)工作者的當(dāng)務(wù)之急。研究表明，肝纖維化的發(fā)生機(jī)制與TGF-β1/BMP-7的動(dòng)態(tài)失衡密切相關(guān)，TGF-β1可通過(guò)激活下游Smads分子如Smad2/3，活化的Smad2/3進(jìn)一步與Smad4形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，如與膠原和纖溶酶原活化抑制因子1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)其蛋白合成，誘導(dǎo)HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，ECM合成增加而降解減少[3，7]。BMP-7與TGF-β1同屬TGF-β超家族成員，二者的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖維化形成過(guò)程中相互拮抗，BMP-7能直接拮抗TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，對(duì)纖維化疾病進(jìn)展起著負(fù)向調(diào)控的作用[8-11]。BMP-7介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要與Ⅰ型及Ⅱ型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)形成復(fù)合體形式，BMP-7首先與BMPR-Ⅱ相結(jié)合，隨后誘導(dǎo)BMPR-Ⅰ發(fā)生磷酸化。BMPR-Ⅰ有3種，即ALK-2、ALK-3(BMPR-IA)和ALK-6(BMPR-IB)，BMP-7與其中的ALK-2親和力最強(qiáng)，而與ALK-3、ALK-6親和力較弱，提示BMP-7主要通過(guò)活化下游信號(hào)分子ALK-2而發(fā)揮其生物學(xué)效用[12]。ALK-2活化后，可作用于Smad1/5/8羧基端末端的2個(gè)絲氨酸并使之磷酸化，隨后Smad1/5/8再與Smad4結(jié)合成復(fù)合體，移位到細(xì)胞核內(nèi)，再作用于特定基因的啟動(dòng)子，引起許多生物學(xué)效應(yīng)，如使Smad6表達(dá)增加等。Smad6是TGF-β信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)與TGF-β激活的Ⅰ型受體結(jié)合，抑制Smad2/3的磷酸化而抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)活化狀態(tài)的ALK-2及p-Smad1/5/8。Id2是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋因子(bHLH)的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)節(jié)因子[15]，Id2位于TGF-β1和BMP-7的下游，與TGF-β超家族關(guān)系密切，受到TGF-β1的抑制，而BMP-7能誘導(dǎo)其表達(dá)[16]。Id2是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化的功能[17]，Id2還可通過(guò)干擾Ⅰ型膠原的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮類似于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的改善肝纖維化的作用[18]，Kinoshita等[19]研究還發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)BMP-7表達(dá)后，可以通過(guò)上調(diào)Id2水平從而減輕實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化。

目前，肝纖維化的藥物治療仍處于探索階段，在單一的特異性細(xì)胞因子阻斷劑難以實(shí)現(xiàn)滿意療效之時(shí)，對(duì)中藥復(fù)方制劑抗肝纖維化的研發(fā)具有一定的前景。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方DSHX可上調(diào)肝纖維化大鼠肝臟BMP-7的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯，抑制TGF-β1、Smad2/3的促纖維化作用，且具有抑制HSC增殖的功能[6，20-21]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)DSHX對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中BMP-7下游信號(hào)分子BMPR-I(ALK2)、p-Smad1/5/8及Id2表達(dá)的影響，深入探討DSHX改善肝纖維化的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，A組大鼠肝組織ALK2、Id2的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均低于A組，且肝組織p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)也低于A組，提示在大鼠肝纖維化進(jìn)程中，ALK2、p-Smad1/5/8及Id2表達(dá)受抑制，從而削弱了其對(duì)TGF-β1信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控功能，可能是CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的發(fā)病機(jī)制之一。

肝纖維化大鼠在DSHX治療8周后，血清ALT、AST、肝臟指數(shù)及肝勻漿HA、Hyp均低于模型組，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其肝纖維化程度明顯減輕，表明DSHX可改善肝功能，減輕肝纖維化程度，對(duì)CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化具有一定療效。對(duì)大鼠肝組織ALK2與p-Smad1/5/8的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療組ALK2mRNA及蛋白表達(dá)、p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)均明顯高于B組和C組；而對(duì)大鼠肝組織Id2的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雖然治療組存在優(yōu)于B組和C組的明顯上升的Id2mRNA水平，但I(xiàn)d2在蛋白水平的表達(dá)與B組和C組均無(wú)明顯差異。同時(shí)，上述3項(xiàng)指標(biāo)在D組與E組之間無(wú)明顯差異，提示低、高劑量DSHX對(duì)大鼠ALK2、p-Smad1/5/8與Id2表達(dá)的影響無(wú)明顯量效關(guān)系。本課題組的前期動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)曾發(fā)現(xiàn)，DSHX可提高大鼠肝組織及體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞系中BMP-7蛋白表達(dá)水平[6，21]，作者從本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果中推測(cè)，DSHX刺激大鼠肝組織BMP-7表達(dá)上調(diào)后，進(jìn)一步通過(guò)BMP-7促進(jìn)其下游因子ALK2的活化，進(jìn)而磷酸化Smad1/5/8，可能是DSHX治療大鼠肝纖維化的機(jī)制之一，但DSHX對(duì)Id2的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)前期研究工作的延伸，結(jié)果表明DSHX可作用于BMP-7/ALK2/Smad1/5/8信號(hào)軸，刺激其蛋白質(zhì)表達(dá)，具有一定治療肝纖維化的潛能。研究結(jié)果對(duì)該藥的開發(fā)及臨床應(yīng)用具有一定指導(dǎo)價(jià)值，但本實(shí)驗(yàn)仍存在不足及尚待完善之處：(1)尚未采用小干擾RNA或基因敲除法深入研究DSHX是否只通過(guò)BMP-7信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化效用，或是存在著對(duì)其他信號(hào)通路影響而發(fā)揮抗肝纖維化作用的可能。(2)仍然只處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚未對(duì)人體肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，其肝組織上述因子的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。作者相信，隨著本課題的不斷深入，有希望明確DSHX治療肝纖維化的確切分子機(jī)制，為將來(lái)該藥的臨床應(yīng)用提供較可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有較大的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。

[1]WangFS，F(xiàn)anJG，ZhangZ，etal．Theglobalburdenofliverdisease:themajorimpactofChina[J]．Hepatology，2014，60(6)：2099-2108.

[2]FriedmanSL．Hepaticfibrosis:emergingtherapies[J]．DigDis，2015，33(4)：504-507.

[3]過(guò)憶，薛博瑜．肝纖維化的細(xì)胞和分子機(jī)制[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2015，44(9)：1272-1274，1275．

[4]WangSL，YangCQ，QiXL，etal．Inhibitoryeffectofbonemorphogeneticprotein-7onhepaticfibrosisinrats[J]．IntJClinExpPathol，2013，6(5)：897-903.

[5]BiWR，XuGT，LvLX，etal．Theratiooftransforminggrowthfactor-β1/bonemorphogeneticprotein-7intheprogressionoftheepithelial-mesenchymaltransitioncontributestoratliverfibrosis[J]．GenetMolRes，2014，13(1)：1005-1014.

[6]ZhaoXK，ChengML，WuRM，etal．Effectofdanshaohuaxiancapsuleongremlinandbonemorphogeneticprotein-7expressioninhepaticfibrosisinrats[J]．WorldJGastroenterol，2014，20(40)：14875-14883.

[7]WranaJL．RegulationofSmadactivity[J]．Cell，2000，100(2)：189-192.

[8]KhanI，AgarwalP，ThangjamGS，etal．RoleofTGF-βandBMP7inthepathogenesisoforalsubmucousfibrosis[J]．GrowthFactors，2011，29(4)：119-127.

[9]ZeisbergM，YangCQ，MartinoM，etal．Fibroblastsderivefromhepatocytesinliverfibrosisviaepithelialtomesenchymaltransition[J]．JBiolChem，2007，282(32)：23337-23347.

[10]楊麗，楊長(zhǎng)青，袁敏，等．肝纖維化時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白7對(duì)肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原的影響[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89(6)：419-422．

[11]王勝蘭，楊長(zhǎng)青，楊麗，等．BMP-7防治實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的研究[J]．同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，31(2)：14-18．

[12]Macías-SilvaM，HoodlessPA，TangSJ，etal．SpecificactivationofSmad1signalingpathwaysbytheBMP7typeIreceptor,ALK2[J]．JBiolChem，1998，273(40)：25628-25636.

[13]ChenBL，PengJ，LiQF，etal．Exogenousbonemorphogeneticprotein-7reduceshepaticfibrosisinSchistosomajaponicum-infectedmiceviatransforminggrowthfactor-β/Smadsignaling[J]．WorldJGastroenterol，2013，19(9)：1405-1415.

[14]RoachKM，F(xiàn)eghali-BostwickC，WulffH，etal．HumanlungmyofibroblastTGFβ1-dependentSmad2/3signallingisCa2+-dependentandregulatedbyKCa3.1K+channels[J]．FibrogenesisTissueRepair，2015(8)：5.

[15]NortonJD，DeedRW，CraggsG，etal．Idhelix-loop-helixproteinsincellgrowthanddifferentiation[J]．TrendsCellBiol，1998，8(2)：58-65.

[16]KowanetzM，ValcourtU，Bergstr?mR，etal．Id2andId3definethepotencyofcellproliferationanddifferentiationresponsestotransforminggrowthfactorbetaandbonemorphogeneticprotein[J]．MolCellBiol，2004，24(10)：4241-4254.

[17]RuzinovaMB，BenezraR．Idproteinsindevelopment,cellcycleandcancer[J]．TrendsCellBiol，2003，13(8)：410-418.

[18]UekiT，KanedaY，TsutsuiH，etal．Hepatocytegrowthfactorgenetherapyoflivercirrhosisinrats[J]．NatMed，1999，5(2)：226-230.

[19]KinoshitaK，IimuroY，OtogawaK，etal．Adenovirus-mediatedexpressionofBMP-7suppressesthedevelopmentofliverfibrosisinrats[J]．Gut，2007，56(5)：706-714．

[20]楊婷，謝汝佳，羅新華，等．丹芍化纖膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝臟Smads分子表達(dá)的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志，2010，26(9)：1807-1812．

[21]趙雪珂，吳榮敏，姚玉梅，等．丹芍化纖膠囊含藥血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞Gremlin和BMP7表達(dá)的影響[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(2)：182-186．

Danshaohuaxian capsule attenuates hepatic fibrosis induced by CCl4in rats by up-regulating expression of ALK2 and p-Smad1/5/8*

YuLei1，ZhaoXueke2△，MuMao2，LiHong2，YaoYumei2，ZhuJuanjuan2，ZhangBaofang2，LiuYang2，GuoHui2

(1.PrenatalDiagnosticCenter；2.DepartmentofInfectiousDiseases,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the effect of Danshaohuaxian capsule(DSHX) on expressions of bone morphogenetic protein receptor Ⅰ(BMPR-Ⅰ,ALK2),phosphorylated Smad1/5/8 (p-Smad1/5/8) and inhibitor of DNA binding/differentiation 2 (Id2) in rat liver of hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCl4),and to explore its possible mechanism for treating liver fibrosis.Methods A total of 50 male Wistar rats were divided into control group(A),CCl4-induce hepatic fibrosis group(B),untreated model group(C),low-dose-DSHX treated group(D),high-dose-DSHX treated group(E),10 rats in each group.Fibrous liver models of rats were induced by subcutaneous injection of CCl4and high-lipid/low-protein diet for 8 weeks except for control group.Then the two DSHX treated groups were treated respectively with low dose(0.5 g/kg) and high dose(1.0 g/kg) DSHX capsule once per day for 8 weeks.By the end of the experiment,the level of hyaluronic acid(HA) and hydroxyproline(Hyp) in the liver homogenate were determined by using enzyme-linked immunosorbent assay,the mRNA expressions of ALK2 and Id2 were determined by using RT-PCR,the protein expressions of ALK2,Id2 and p-Smad 1/5/8 were determined by using Western blotting,respectively.Results Compared with group A,the concentration of HA and Hyp increased in group B(P<0.01),the mRNA and protein expression of ALK2 and Id2,the protein expression of p-Smad 1/5/8 decreased in group B(P<0.01).Compared with groups B and C,the degree of hepatic fibrosis was significantly improved,the level of HA and Hyp decreased,and the mRNA and protein expression of ALK2,the protein expression of p-Smad 1/5/8,the mRNA expression of Id2 were significantly higher in the two DSHX-treated groups respectively(P<0.01).However,there was no significant difference in the expression of Id2 protein between the two DSHX-treated groups and groups B and C(P>0.05).Conclusion The therapeutic mechanism of DSHX for hepatic fibrosis in rats may be associated with up-regulation of the expression of ALK2 and p-Smad 1/5/8.

hepatic fibrosis；bone morphogenetic protein；Smad1/5/8；inhibitor of DNA binding/differentiation；Danshaohuaxian capsule

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560104)。 作者簡(jiǎn)介：余蕾(1982-)，副主任技師，博士，主要從事產(chǎn)前診斷及肝纖維化防治研究。△

Tel:0851-86773914；E-mail:zhaoxueke1@163.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.003

R

A

1671-8348(2016)35-4904-04

2016-05-20

2016-08-08)