羅格列酮對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的分泌及mRNA表達(dá)的影響

孫殿靜，劉晴晴，耿建林

(衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北衡水 053000)

羅格列酮對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的分泌及mRNA表達(dá)的影響

孫殿靜，劉晴晴，耿建林

(衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北衡水 053000)

目的 研究羅格列酮對(duì)胰島素抵抗(IR)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的分泌及mRNA表達(dá)的影響。方法 將3T3-L1脂肪細(xì)胞分為5組：A組為對(duì)照組，B、C、D、E組為不同水平羅格列酮處理的IR組，分別給予終濃度為0、0.1、0.5、1.0μmol/L的羅格列酮。檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液的葡萄糖消耗量，分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)檢測(cè)瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素的分泌及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與B組比較，D、E組細(xì)胞分泌的瘦素及抵抗素水平及其mRNA表達(dá)水平均降低，分泌的脂聯(lián)素及其mRNA表達(dá)水平與葡萄糖消耗量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組與C組細(xì)胞分泌的瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 羅格列酮可以通過調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素的表達(dá)及分泌減輕脂肪細(xì)胞的IR。

羅格列酮；胰島素抵抗；脂聯(lián)素；瘦素；抵抗素

2型糖尿病(T2DM)是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，隨著生活水平的逐漸提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，T2DM的發(fā)病率逐年升高[1]，胰島素抵抗(IR)是患者的重要生理病理變化之一[2]。脂肪組織不僅是內(nèi)分泌器官，也是免疫器官。隨著研究的深入，脂肪組織被證實(shí)具廣泛的分泌譜，可分泌大量的生物活性物質(zhì)如脂肪酸、脂蛋白脂酶、類固醇激素、生長(zhǎng)因子、血管緊張素原及前列腺素，也可分泌大量細(xì)胞因子及類細(xì)胞因子樣分子，其分泌的脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等因素在IR的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。羅格列酮屬噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，已廣泛應(yīng)用于T2DM的治療，可改善IR作用，但其對(duì)脂肪細(xì)胞因子的影響尚缺乏相關(guān)報(bào)道[5]。本研究旨在探討羅格列酮對(duì)IR 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的分泌，以及mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 3T3-L1細(xì)胞株購自賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.2 儀器與試劑 奧林巴斯顯微鏡CX41(上海西努光學(xué)科技有限公司)，QQ-80A-Ⅱ型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(上海啟前電子科技有限公司)，3-18R高速冷凍離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)，DG5033A酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)，Image-Pro Insight圖像分析軟件(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)。主要試劑見表1。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h，換用含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再換用含10 mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，隨后換用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液1次，培養(yǎng)4 d，90%前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。

表1 主要試劑

1.3.2 IR模型的建立及分組 按每毫升3×105個(gè)的密度將3T3-L1脂肪細(xì)胞懸液接種于96孔板培養(yǎng)，置于無血清培養(yǎng)基中處理12 h同步化進(jìn)行分組，每組12孔。其中，A組為對(duì)照組，B、C、D、E組為不同水平羅格列酮處理的IR組。IR組細(xì)胞均添加1 μmol/L地塞米松制作IR模型[6]。C～E組細(xì)胞分別添加終濃度為0.1、0.5、1.0 μmol/L羅格列酮+無水乙醇溶液，A、B組均加入等量的無水乙醇。

1.3.3 葡萄糖消耗量的測(cè)定 所有細(xì)胞培養(yǎng)24 h后給予100 nmol/L胰島素，刺激15 min后取培養(yǎng)基，以葡萄糖測(cè)試盒檢測(cè)并計(jì)算培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，評(píng)價(jià)IR程度。

1.3.4 脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別檢測(cè)各組細(xì)胞的脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的mRNA表達(dá)水平。按照TrizolTM試劑盒說明書提取總RNA，測(cè)定RNA水平及純度，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取5 μL cDNA稀釋4倍后，取2 μL為模板，分別以p27、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、Bax、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的引物進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)條件：95 ℃變性3 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火/延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃每增加0.5 ℃進(jìn)行5 s讀板，形成溶解曲線。所有樣品均設(shè)置3個(gè)平行管，基因表達(dá)量以平行管平均循環(huán)閾值(cycle-threshold，Ct)表示，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 觀察指標(biāo) 各組葡萄糖消耗量，脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素分泌水平， 脂聯(lián)素、瘦素及抵抗素mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)水平比較 各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量、瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D、E組的上述各項(xiàng)指標(biāo)水平與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)水平比較

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析 葡萄糖消耗量與脂聯(lián)素水平呈正相關(guān)(r=1.241，P=0.005)，與瘦素、抵抗素水平呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-1.082、-1.764，P值分別為0.018、0.000)；瘦素與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)(r=-1.524，P=0.000)，與抵抗素水平呈正相關(guān)(r=1.175，P=0.012)；脂聯(lián)素與抵抗素水平呈負(fù)相關(guān)(r=1.184，P=0.010)。

2.3 各組細(xì)胞瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 各組細(xì)胞的瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D、E組的上述各項(xiàng)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞的瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3 討 論

目前研究認(rèn)為，IR是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制之一，IR常伴有高胰島素血癥，發(fā)生IR時(shí)，胰島素的脂肪合成作用增強(qiáng)，脂肪貯存增多，而腹內(nèi)脂肪的增加遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于皮下脂肪，形成內(nèi)臟或中央型肥胖[7-8]。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不僅是儲(chǔ)存能量的器官，而且是全身較為重要的內(nèi)分泌器官。脂肪組織可分泌多種蛋白，包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、腫瘤壞死因子、纖溶酶原激活物抑制劑-1、白細(xì)胞介素等多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子統(tǒng)稱為脂肪因子。脂肪因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的途徑參與各種復(fù)雜的代謝過程，在T2DM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9-10]。諸多脂肪因子中，瘦素是肥胖基因(ob)的編碼產(chǎn)物，也是迄今為止研究最深入的脂肪細(xì)胞因子。瘦素作為一種飽食因子，與其受體結(jié)合后可以抑制增加食欲肽(如神經(jīng)肽Y、甘丙肽、增食欲素)的分泌，和(或)促進(jìn)減少食欲肽(如前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素、可卡因-安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物、胰升血糖素樣肽1及神經(jīng)降壓素等)的分泌，通過上述機(jī)制共同參與食欲和能量代謝調(diào)節(jié)[11]。瘦素受體廣泛存在于包括脂肪組織在內(nèi)的多種外周組織，參與血壓調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，影響血管、大腦及骨的生成。瘦素與胰島素同為人體能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其功能紊亂與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)瘦素的抵抗，患者外周血瘦素水平明顯升高[12]。脂聯(lián)素也稱脂肪細(xì)胞補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、脂肪中最豐富的基因轉(zhuǎn)錄物之一、相對(duì)分子質(zhì)量為28×103的凝膠結(jié)合蛋白，是脂肪細(xì)胞的特異性分泌蛋白，參與體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素具有增強(qiáng)胰島素敏感性、抗炎及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[13]。抵抗素存在于血漿中，屬于抵抗素樣分子家族成員，是脂肪細(xì)胞分泌的富含半胱氨酸的多肽類激素。有研究表明，抵抗素可以作用于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致IR[14]。本研究中，與對(duì)照組相比，IR組細(xì)胞的瘦素及抵抗素分泌及mRNA表達(dá)水平均明顯上升，而葡萄糖消耗量及脂聯(lián)素水平降低，胰島素脂肪細(xì)胞上述因子的合成及分泌功能均受損。對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析：脂聯(lián)素水平與葡萄糖消耗呈正相關(guān)，瘦素及抵抗素與葡萄糖消耗呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果說明T2DM患者的IR與脂肪細(xì)胞因子的異常改變相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可以通過與過氧化物酶體系激活受體結(jié)合而上調(diào)其應(yīng)答基因的表達(dá)，從而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)的表達(dá)及周圍細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，降低血糖并改善患者的IR[15]。本次研究分別利用不同水平羅格列酮處理IR脂肪細(xì)胞，0.5及1.0μmol/L羅格列酮均可以抑制瘦素及抵抗素的表達(dá)與分泌，促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)與分泌，并通過上述機(jī)制促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)糖的利用；0.1μmol/L羅格列酮僅可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)，而對(duì)脂肪細(xì)胞因子的分泌及葡萄糖的利用無明顯影響。這一結(jié)果說明羅格列酮對(duì)脂肪細(xì)胞的作用呈劑量依賴性。

綜上所述，羅格列酮可以通過調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素的表達(dá)及分泌，減輕脂肪細(xì)胞的IR。

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The influence of rosiglitazone on the secretion and mRNA expression of adiponectin,leptin and resistin in 3T3-L1 adipocytes with insulin resistance*

SunDianjing，LiuQingqing，GengJianlin

(DepartmentofEndocrinology,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hengshui,Hebei053000,China)

Objective To study the influence of rosiglitazone on the secretion and mRNA expression of adiponectin,leptin and resistin in 3T3-L1 adipocytes with insulin resistance(IR).Methods 3T3-L1 adipocytes were divided into 5 groups:group A was the control group,group B,C,D and E were the IR groups treated with different concentrations of rosiglitazone.The group B,C,D and E were given 0,0.1,0.5,1.0 μmol/L rosiglitazone,respectively.The consumption of glucose was detected,while the secretion and mRNA expression of leptin,adiponectin and resistin were detected by using ELISA and Q-RT-PCR respectively.Results Compared with the group B,the secretion and mRNA expression of leptin and resistin in group D and E were decreased,while the secretion and mRNA expression of adiponectin and the consumption of glucose were increased,these differences were statistically significant(P<0.05).The secretion of leptin,adiponectin and resistin had no significant difference between group B and group C(P>0.05).Conclusion Rosiglitazone could alleviate the IR in adipocytes by regulating the expression and section of leptin,adiponectin and resistin.

rosiglitazone；insulin resistance；adiponectin；leptin；resistin

河北省衡水市科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(15024)。 作者簡(jiǎn)介：孫殿靜(1981-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事糖尿病相關(guān)性研究。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.002

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A

1671-8348(2016)35-4901-03

2016-06-20

2016-08-11)