下調(diào)PTEN基因?qū)β云^痛大鼠NR2B亞基酪氨酸磷酸化和一氧化氮的影響

李王文，秦光成，陳力學(xué)△，謝景梅，吳白雪，周冀英

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.實(shí)驗(yàn)研究中心；2.神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

下調(diào)PTEN基因?qū)β云^痛大鼠NR2B亞基酪氨酸磷酸化和一氧化氮的影響

李王文1，秦光成1，陳力學(xué)1△，謝景梅1，吳白雪1，周冀英2

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.實(shí)驗(yàn)研究中心；2.神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

目的 利用RNAi重組腺病毒下調(diào)第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)的表達(dá)，探討PTEN基因?qū)β云^痛大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾核(TNC)內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基酪氨酸磷酸化(NR2B-pTyr)蛋白表達(dá)水平和一氧化氮(NO)含量的影響。方法 將SD雄性大鼠分為對(duì)照組、對(duì)照干預(yù)組、模型組和模型干預(yù)組。硬腦膜滴注炎性湯(IS)建立慢性偏頭痛大鼠模型，TNC注射AdR-siPTEN，7 d后觀察大鼠行為學(xué)改變，檢測(cè)大鼠TNC內(nèi)PTEN、NR2B-pTyr和NO含量。結(jié)果 AdR-siPTEN可下調(diào)慢性偏頭痛大鼠模型TNC中PTEN的表達(dá)；與模型組比較，IS干預(yù)慢性偏頭痛大鼠的行為學(xué)癥狀明顯緩解，大鼠的TNC內(nèi)NR2B-pTyr表達(dá)水平及NO水平明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 PTEN參與調(diào)節(jié)慢性偏頭痛的病理過程，下調(diào)PTEN基因可緩解IS誘導(dǎo)的慢性偏頭痛大鼠的疼痛行為學(xué)，其機(jī)制可能與下調(diào)PTEN引起NR2B-pTyr表達(dá)量及NO水平降低有關(guān)。

慢性偏頭痛；第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因；N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基；磷酸化；一氧化氮

偏頭痛(migraine)是一種反復(fù)發(fā)作的、一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性的劇烈頭痛，發(fā)作時(shí)常伴隨惡心、嘔吐、畏光和畏聲等癥狀[1]。根據(jù)國際頭痛協(xié)會(huì)(IHS)國際頭痛疾病分類第2版(ICHD-Ⅱ)的標(biāo)準(zhǔn)，偏頭痛反復(fù)發(fā)作(每個(gè)月不少于15 d)，持續(xù)3個(gè)月以上，無藥物濫用，即為慢性偏頭痛(chronic migraine，CM)。CM已被WHO列為四大最嚴(yán)重的慢性功能障礙性疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前多認(rèn)為神經(jīng)源性炎癥引起的中樞致敏與CM的發(fā)病相關(guān)。神經(jīng)源性炎癥所致的神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的異常激活是產(chǎn)生疼痛及痛覺維持的重要機(jī)制，NMDAR的性質(zhì)在很大程度上由其亞單位NR2B所決定，其中NR2B酪氨酸磷酸化(NMDAR2B tyrosine phosphorylation,NR2B-pTyr)水平升高是誘導(dǎo)和維持慢性疼痛炎癥性痛覺過敏的主要原因之一[2]。

RNAi重組腺病毒下調(diào)第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是一個(gè)近年來新發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持具有重要作用，同時(shí)與腦缺血、癲癇、藥物成癮性等神經(jīng)精神障礙疾病的發(fā)生密切相關(guān)。已有研究報(bào)道，下調(diào)PTEN基因可降低NR2B的表達(dá)和一氧化氮(NO)的水平，緩解偏頭痛的發(fā)作[3]。為此本文通過AdR-siPTEN重組腺病毒下調(diào)PTEN基因，觀察炎性湯誘導(dǎo)的CM大鼠行為學(xué)的變化，同時(shí)探討PTEN是否可通過調(diào)節(jié)NR2B-pTyr影響NO的合成，繼而抑制CM的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及大鼠CM模型的建立 清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)成年雄性大鼠，體質(zhì)量(210±30)g，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均每組6只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。參見Oshinsky等[4]和Stucky等[5]的方法稍作改動(dòng)，建立大鼠CM模型。將大鼠頭部建立炎性湯[IS，包含1 mmol/L組織胺、1 mmol/L 5-羥色胺、1 mmol/L緩激肽、0.1 mmol/L前列腺素E2的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 7.4，美國Sigma公司]誘導(dǎo)窗，植入微量給藥系統(tǒng)1周后，選擇傷口未感染的24只實(shí)驗(yàn)大鼠入實(shí)驗(yàn)組，將其分為以下4組：對(duì)照組(Sham組)、對(duì)照干預(yù)組(Sham+AdR-siPTEN組)、模型組(IS組)、模型干預(yù)組(IS+AdR-siPTEN組)，每組6只。實(shí)驗(yàn)大鼠硬腦膜下每次泵入炎性湯10 μL，3次/周，連續(xù)3周，建立CM大鼠模型，對(duì)照組大鼠硬腦膜下泵入等體積生理鹽水。造模結(jié)束后，PTEN干預(yù)組立即定位三叉神經(jīng)脊束核尾核(TNC,在前囟后14.6 mm、中線旁開2.5 mm、深9.0 mm)，用微量注射器緩慢注射重組腺病毒AdR-siPTEN 5 μL。1周后取大鼠TNC，做連續(xù)冰凍切片，厚15 μm，在熒光顯微鏡下觀察TNC中熒光蛋白的表達(dá)。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)觀察 最后一次泵入IS或生理鹽水后，用大鼠自主活動(dòng)行為分析儀(淮北正華公司)觀察大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運(yùn)動(dòng)的次數(shù)總和(每個(gè)癥狀出現(xiàn)1次計(jì)1分)等行為學(xué)癥狀90 min。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PTEN基因mRNA表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組大鼠在3.5%水合氯醛麻醉下，快速斷頭分離出TNC，立即放入液氮中速凍。用Trizol法提取總RNA，根據(jù)日本Toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作。PCR總反應(yīng)體系25 μL。引物序列：PTEN(362 bp)上游序列：5′-TTG AAG ACC ATA ACC CAC C-3′，下游序列：5′-AGT TCC GCC ACT GAA CAT-3′；三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，470 bp)上游序列：5′-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3′，下游序列：5′-ACC AGT GGA TGC AGG GAT-3′。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s。72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，以GAPDH為內(nèi)參照。將PCR產(chǎn)物在l %的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用Quantity One軟件進(jìn)行電泳條帶吸光度(A)值分析，以PTEN/GAPDH積分吸光度值的比值表示基因表達(dá)水平。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá) 取各實(shí)驗(yàn)組大鼠TNC組織塊，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG)分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，按1∶500分別加入兔抗PTEN抗體、兔抗NR2B-pTyr抗體，4 ℃孵育過夜。次日吐溫20的Tris緩沖生理鹽水(TBST)洗膜后再按1∶500 0加入羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜?；瘜W(xué)發(fā)光試劑于暗室自顯影，凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定積分吸光度值分析結(jié)果。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照。

1.2.4 NO水平的測(cè)定 取各組大鼠TNC組織塊，稱重后用眼科剪盡快剪碎，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)[(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-Na2)，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液]勻漿，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液0.5 mL，根據(jù)NO測(cè)定試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)測(cè)定組織NO水平。

2 結(jié) 果

2.1AdR-siPTEN在大鼠TNC的轉(zhuǎn)染效果AdR-siPTEN轉(zhuǎn)染的大鼠TNC有紅色熒光蛋白表達(dá)(圖1)，表明PTEN基因腺病毒轉(zhuǎn)染成功。

圖1 AdR-siPTEN轉(zhuǎn)染的TNC顯示紅色熒光(×200)

2.2 大鼠行為學(xué)的變化 第9次注射IS的模型組大鼠出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多、往返運(yùn)動(dòng)等不適癥狀，表明造模成功。模型組與對(duì)照組、模型干預(yù)組、對(duì)照干預(yù)組的行為學(xué)評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組、模型干預(yù)組與對(duì)照干預(yù)組的行為學(xué)評(píng)分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)評(píng)分

2.3 大鼠TNC中PTENmRNA檢測(cè)結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組與對(duì)照干預(yù)組、模型干預(yù)組間PTEN基因mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與對(duì)照干預(yù)組、模型干預(yù)組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。表明重組腺病毒AdR-siPTEN能有效抑制TNC中PTEN基因mRNA表達(dá)。

2.4 大鼠TNC中PTEN和NR2B-pTyr蛋白表達(dá)Westernblotting結(jié)果顯示，對(duì)照組PTEN基因蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照干預(yù)組與模型干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組PTEN基因蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照干預(yù)組與模型干預(yù)組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4；表明重組腺病毒AdR-siPTEN能有效抑制TNC中PTEN蛋白表達(dá)。與模型組比較，模型干預(yù)組NR2B-pTyr蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型干預(yù)組與對(duì)照組NR2B-pTyr蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組與對(duì)照組比較，NR2B-pTyr蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。表明IS誘導(dǎo)的CM大鼠TNC中NR2B-pTyr蛋白表達(dá)水平明顯增高，而重組腺病毒AdR-siPTEN能明顯抑制TNC中NR2B-pTyr蛋白表達(dá)。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖3 各組大鼠TNC內(nèi)PTEN基因mRNA的表達(dá)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖4 各組大鼠TNC內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)

2.5 大鼠TNC中NO水平比較 與模型組比較，模型干預(yù)組NO水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型干預(yù)組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。表明IS誘導(dǎo)的CM大鼠模型TNC中NO水平明顯增高，而重組腺病毒AdR-siPTEN能明顯降低TNC中NO水平。

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖5 各組大鼠TNC內(nèi)NR2B-pTyr蛋白表達(dá)

*：P<0.05，與模型組比較；n=6。

圖6 各組大鼠TNC內(nèi)NO水平比較

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用AdR-siPTEN重組腺病毒，可以使CM模型大鼠咬尾、撓頭次數(shù)和爬籠等行為學(xué)癥狀明顯緩解，降低TNC中PTEN基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)下調(diào)PTEN基因后，大鼠TNC的NR2B-pTyr和NO水平也顯著降低。上述結(jié)果表明，PTEN基因可能通過降低NR2B-pTyr和NO水平，參與CM的發(fā)作。

CM的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但目前三叉神經(jīng)系統(tǒng)痛覺中樞敏化在CM發(fā)病的病理生理機(jī)制中占主導(dǎo)地位，而TNC是三叉神經(jīng)系統(tǒng)痛覺中樞敏化中最重要的解剖結(jié)構(gòu)[6]。NR2B是NMDAR的一個(gè)基本調(diào)節(jié)亞基，在學(xué)習(xí)、記憶、痛覺傳導(dǎo)及中樞敏化中發(fā)揮重要作用，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病與NR2B也有密切關(guān)系[7]，其酪氨酸磷酸化是NR2B激活的一個(gè)重要機(jī)制[8]。Kato等[9]發(fā)現(xiàn)，NR2B-pTyr在中樞痛覺敏化的形成和維持，以及興奮性突觸傳遞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮中毒中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究證實(shí)，在IS誘發(fā)的CM大鼠TNC中，NR2B-pTyr表達(dá)水平較對(duì)照組大鼠明顯升高。而NR2B-pTyr表達(dá)水平的升高，會(huì)使鈣離子(Ca2+)滲透性增加，當(dāng)神經(jīng)元中Ca2+濃度達(dá)到一定水平，并與鈣調(diào)蛋白相結(jié)合，就會(huì)激活神經(jīng)元的一氧化氮合酶(NOS)，最終引起中樞痛覺過敏和頭痛。另有研究表明，NR2B-pTyr在三叉神經(jīng)系統(tǒng)的中樞敏化和痛覺傳遞中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，隨著NR2B-pTyr在TNC中表達(dá)水平的升高，CM大鼠的痛閾值明顯降低，且隨著AdR-siPTEN抑制PTEN基因的表達(dá)，繼而抑制NR2B-pTyr在TNC中的表達(dá)，模型組大鼠的痛閾值恢復(fù)至與對(duì)照組相近的水平[10]。這些結(jié)果表明，CM大鼠的痛閾值是降低的，而痛閾值的降低與NR2B-pTyr表達(dá)升高相關(guān)。

NO是目前公認(rèn)的在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的分子，它可以立即擴(kuò)張大腦動(dòng)脈引起非特異性頭痛，又可以作為信號(hào)分子傳導(dǎo)痛覺，參與中樞敏化的形成，引起延遲的典型偏頭痛樣頭痛[11]。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛大鼠模型中TNC神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)活性增強(qiáng)，一方面可以導(dǎo)致內(nèi)源性NO的釋放大量增加，增加的NO參與TNC中樞敏化，引起痛覺超敏；另一方面它可以通過增加三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中樞突觸釋放的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)，增加易化痛覺傳遞，從而形成偏頭痛[12-14]。還有研究表明，在偏頭痛患者頭痛發(fā)作期，其血清NO水平明顯升高，而在其頭痛間歇期，NO水平降低，但是仍高于正常水平[15]。與上述研究類似，本研究結(jié)果表明，在CM大鼠的TNC中，NO水平明顯升高，導(dǎo)致TNC中樞敏化，從而導(dǎo)致偏頭痛大鼠模型的痛閾值降低。

PTEN是定位在第10號(hào)染色體的抑癌基因，它不僅可以通過抑制細(xì)胞增殖和通過DNA損傷使細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤形成，還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道，下調(diào)PTEN基因可降低NR2B和NR2B-pTyr的表達(dá)，阻斷Ca2+內(nèi)流，增加細(xì)胞活力，從而保護(hù)神經(jīng)元損傷；且下調(diào)PTEN基因可引起環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)表達(dá)增加，從而增強(qiáng)全腦缺血再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[15-17]。本研究表明，通過AdR-siPTEN轉(zhuǎn)染TNC，可以使CM大鼠痛閾值升高，以及行為學(xué)恢復(fù)到與對(duì)照組基本一致的水平，同時(shí)，也可使TNC內(nèi)NR2B-pTyr和NO水平降低。提示PTEN可能通過PTEN/NR2B-pTyr/NO信號(hào)通路在CM的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而PTEN影響TNCNR2B-pTyr水平的分子機(jī)制，以及其如何通過PTEN/NR2B-pTyr/NO信號(hào)通路發(fā)揮作用，目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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The effects of PTEN gene down-regulation on the NR2B-pTyr expression and NO in rat model of chronic migraine*

LiWangwen1，QinGuangcheng1，ChenLixue1△，XieJingmei1，WuBaixue1，ZhouJiying2

(1.LaboratoryResearchCenter,2.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To employ the RNAi recombinant adenovirus to knock down the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN) gene,and to explore the effects of PTEN gene on the expression of tyrosine phosphorylation of the NR2B subunit and nitric oxide(NO) in the trigeminal nucleus caudalis(TNC) of rats with inflammatory soup-induced chronic migraine.Methods SD rats were divided into the control groups(with or without intervention) and model groups(with or without intervention).The chronic migraine rat model was established by pumping inflammation soup(IS) to the rat dura mater,and injected AdR-siPTEN into the TNC of rat after the last time pumping IS.The behaviors change of migraine rats was observed,and the expression of PTEN,NR2B-pTyr and NO in TNC of migraine rats was detected 7 days after injecting AdR-siPTEN.Results The expression of PTEN gene in TNC of rate model of chronic migraine was down-regulated by the localized injection of AdR-sipTEN.Compared with the model group,behavioral symptoms of IS-induced rats were obviously relieved,and the expression of PTEN,NR2B-pTyr and NO production in TNC of IS-induced rats was significantly decreased,there was statistically significant difference(P<0.05).Conclusion PTEN may play an important role in the pathological mechanism of chronic migraine.Down-regulating PTEN gene expression can relieve IS-induced pain-related behaviors of rats with chronic migraine,which may be related to the decrease of NR2B-pTyr expression and NO production induced by down-regulation of PTEN.

chronic migraine；phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten；NR2B;phosphorylation；nitric oxide

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500957；81671093)；重慶市科委基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013jjB10009)；重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20160107)。 作者簡介：李王文(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事偏頭痛發(fā)病機(jī)制研究。△

R747.2

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1671-8348(2016)35-4897-04

2016-06-16

2016-08-06)