多奈哌齊抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型血腦屏障滲透性的研究

江瀅 劉瑩瑩 馬麗麗 陳曉紅

·基礎(chǔ)研究論著·

多奈哌齊抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型血腦屏障滲透性的研究

江瀅 劉瑩瑩 馬麗麗 陳曉紅

目的 探討多奈哌齊對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型血腦屏障滲透性的影響。方法 將48只6～8周齡雌性C57BL/6小鼠分為多奈哌齊組(19只)、PBS 組(19只)與空白對(duì)照組(10只)。將多奈哌齊組及PBS組制備為EAE小鼠模型，在接種免疫后第13日，將多奈哌齊2 mg/(kg·d)溶解于PBS中對(duì)多奈哌齊組進(jìn)行灌胃；而PBS組只予PBS進(jìn)行灌胃。對(duì)EAE小鼠進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分和組織學(xué)評(píng)估(炎癥評(píng)分及脫髓鞘評(píng)分)，利用伊文思藍(lán)對(duì)EAE小鼠腦組織的藍(lán)染程度評(píng)估血腦屏障滲透性，用蛋白免疫印跡法檢測(cè)EAE小鼠腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)情況。結(jié)果 多奈哌齊組的臨床癥狀評(píng)分低于PBS組的臨床癥狀評(píng)分 (t=4.351,P<0.001)。多奈哌齊組的炎癥評(píng)分低于PBS組(t=6.325,P<0.001)；PBS組的腰髓有大片的髓鞘脫失，但多奈哌齊組脫髓鞘病變較其少，2組評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.308,P=0.008)。與空白對(duì)照組相比，PBS組(t=8.621,P<0.001)和多奈哌齊組(t=9.974,P<0.001)腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量均較高；與PBS組相比，多奈哌齊組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量較低(t=2.286,P=0.045)。與PBS組相比，多奈哌齊可抑制MMP-2(t=4.679,P=0.010)和MMP-9 (t=5.822,P=0.001)的表達(dá)。結(jié)論 多奈哌齊可降低EAE小鼠血腦屏障的滲透性。

多奈哌齊；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；血腦屏障；基質(zhì)金屬蛋白酶

多發(fā)性硬化(MS)是最常見(jiàn)的發(fā)生于青年人的中樞神經(jīng)慢性炎性脫髓鞘疾病[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠是研究MS免疫病理學(xué)機(jī)制及其實(shí)驗(yàn)治療的最佳動(dòng)物模型[2]。研究顯示，EAE的特征性病理變化是血腦屏障破壞和T細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦內(nèi)細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和自由基的含量升高，最終導(dǎo)致髓鞘脫失和神經(jīng)傳導(dǎo)受阻[1,3]。多奈哌齊是一種具有高選擇性的膽堿酯酶抑制劑，可用于阿爾茨海默病的治療，且目前發(fā)現(xiàn)其具有抗炎效應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)作用[4-7]。雖然多奈哌齊已經(jīng)被用于治療MS患者和EAE小鼠的認(rèn)知功能障礙，但其在EAE/MS中的抗炎作用目前尚未清楚[8-10]。在本研究中，我們探討了多奈哌齊對(duì)EAE小鼠模型的血腦屏障滲透性及MMP-2/9的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

一、動(dòng)物和試劑

6～8周齡雌性C57BL/6小鼠(體質(zhì)量16～18 g)48只，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將小鼠分為多奈哌齊組19只(其中7只用于臨床癥狀評(píng)估、6只用于組織學(xué)評(píng)估及MMP-2/9蛋白免疫印跡測(cè)定、6只用于血腦屏障受損的評(píng)價(jià))，PBS 組19只(只數(shù)分配與多奈哌齊組相同)與空白對(duì)照組10只(其中6只作為血腦屏障受損的評(píng)價(jià)對(duì)照、4只作為MMP-2/9蛋白免疫印跡測(cè)定對(duì)照)。多奈哌齊和完全弗氏佐劑(CFA)購(gòu)自Sigma公司。MOG35-55(MEVGWYRSP FSRVVHLYRNGK)肽段由CL.BioScientific公司合成(中國(guó)西安)。純度超過(guò)95%的結(jié)核分支桿菌H37Ra購(gòu)自Difco公司，百日咳毒素(PTX)購(gòu)自Alexis公司。單克隆MMP-2抗體和多克隆MMP-9抗體分別購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司和Abcam公司。

二、EAE小鼠模型的誘導(dǎo)和臨床癥狀評(píng)估

采用經(jīng)典的MOG35-55肽段免疫誘導(dǎo)方法將多奈哌齊組及PBS組制備為EAE小鼠模型[11]。首先，將200 μg MOG35-55肽段乳化于含結(jié)核分支桿菌H37RA 500 μg的完全弗氏劑中，并對(duì)2組小鼠皮下注射混合后的完全弗氏劑，同時(shí)腹腔注射含PTX 300 ng的PBS，并在48 h后腹腔注射相同劑量的PTX，在第7日追加皮下注射含MOG35-55肽段的完全弗氏劑。在接種免疫后第13日，將多奈哌齊2 mg/(kg·d)(此劑量的選擇來(lái)源于已發(fā)表文章的數(shù)據(jù)和尋找最佳劑量的預(yù)實(shí)驗(yàn))溶解于PBS中對(duì)多奈哌齊組進(jìn)行灌胃[8]；而PBS組只予PBS進(jìn)行灌胃。每日評(píng)估EAE小鼠的殘疾程度，臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)標(biāo)志；1分，尾部張力減退；2分，松弛尾；3分，后肢共濟(jì)失調(diào)和(或)輕癱； 4分，后肢完全癱瘓；5分，垂死或死亡[11]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們定義個(gè)體小鼠出現(xiàn)第一種癥狀的時(shí)間為疾病的發(fā)病時(shí)間，臨床癥狀評(píng)分的均值為在實(shí)驗(yàn)中每只小鼠的臨床癥狀評(píng)分總和的平均值。臨床癥狀評(píng)分越高，個(gè)體小鼠的病情越重。

三、組織學(xué)評(píng)估

應(yīng)用常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和依來(lái)鉻花青浸漬染色對(duì)EAE小鼠腰髓組織分別進(jìn)行炎性浸潤(rùn)和脫髓鞘評(píng)估。炎癥評(píng)分量表如下所示：0分，沒(méi)有炎性細(xì)胞；1分，一些散在的炎性細(xì)胞；2分，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在血管周?chē)?分，廣泛血管周?chē)涮讕纬刹U(kuò)展到相鄰實(shí)質(zhì)，或?qū)嵸|(zhì)浸潤(rùn)無(wú)明顯的袖套[12]。腰髓的脫髓鞘情況據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)導(dǎo)的評(píng)分細(xì)則進(jìn)行評(píng)分：1分，軟腦膜下脫髓鞘；2分，軟腦膜下及血管周?chē)l(fā)生明顯的脫髓鞘；3分，血管周?chē)蜍浤は旅撍枨拾l(fā)生融合；4分，血管周和軟腦膜下脫髓鞘，并累及一個(gè)半腰髓，伴隨著大量細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)；5分，血管周和軟腦膜下脫髓鞘，并累及整個(gè)腰髓，伴隨著大量細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)。

四、血腦屏障受損的評(píng)價(jià)

我們用伊文思藍(lán)染色評(píng)估空白對(duì)照組、PBS組和多奈哌齊組血腦屏障的完整性[14]。2%伊文思藍(lán)染色劑均經(jīng)過(guò)滅菌消毒。在小鼠接種免疫后第20日，每只小鼠靜脈接受的伊文思藍(lán)劑量為4 ml/kg。靜脈注射伊文思藍(lán)30 min后，伊文思藍(lán)染色液向全身組織擴(kuò)散，用生理鹽水沖洗掉血管內(nèi)的伊文思藍(lán)染色液。迅速取出小鼠腦組織并稱重，用2.5 ml PBS和2.5 ml 60%的三氯乙酸混合液浸泡腦組織，以達(dá)到沉淀蛋白質(zhì)的目的。樣品在1 000×g的離心力下離心30 min。取上清液，用分光光度計(jì)在610 nm波長(zhǎng)下測(cè)量EAE小鼠腦內(nèi)的伊文思藍(lán)含量(EB的吸光度)。根據(jù)伊文思藍(lán)的溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

五、MMP-2/9蛋白免疫印跡測(cè)定

MMP(尤其是MMP-2/9)可以增加EAE小鼠和MS患者的血腦屏障滲透性，我們用蛋白免疫印跡法檢測(cè)空白對(duì)照組、PBS組和多奈哌齊組腦內(nèi)的MMP-2和MMP-9的表達(dá)。各組小鼠腦組織均用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(每孔含有20 μg)進(jìn)行電泳，然后把所分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Bio-Rad)，并用5%的脫脂奶粉封閉，接著分別加入多克隆抗MMP-2抗體(1∶2 000)和多克隆抗MMP-9抗體(1∶2 000)在4℃搖育過(guò)夜。在TBST緩沖液洗膜3次后，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗體和兔抗體孵育30 min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選擇-actin作為內(nèi)參。最后將所得譜帶照相并經(jīng)Quantity one圖像分析軟件分析相應(yīng)譜帶密度值，結(jié)果以譜帶的光密度值和空白地方(沒(méi)有譜帶部位)光密度值的比值表示。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、多奈哌齊對(duì)EAE小鼠臨床癥狀嚴(yán)重程度的影響

PBS組與多奈哌齊組的發(fā)病時(shí)間無(wú)明顯差異[(14.0±0.3)dvs.(14.7±0.2)d,t=1.987,P=0.070]。多奈哌齊組的臨床癥狀評(píng)分為(1.08±0.13)分，而PBS組的臨床癥狀評(píng)分為(2.05±0.18)分，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.351,P<0.001)。

二、多奈哌齊對(duì)EAE小鼠病理結(jié)果的影響

多奈哌齊組的炎癥評(píng)分明顯低于PBS組[(1.50±0.18)分vs.(2.83±0.11)分,t=6.325,P<0.001]。此外，在接種免疫后第20日，我們發(fā)現(xiàn)PBS組的腰髓有大片的髓鞘脫失，但多奈哌齊組脫髓鞘病變較其少，2組評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.92±0.20)分vs.(2.67±0.12)分,t=3.308,P=0.008]。2組典型炎癥病變和脫髓鞘病變的切片如圖1所示。

三、多奈哌齊對(duì)EAE小鼠血腦屏障的影響

空白對(duì)照組、PBS組和多奈哌齊組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量分別為(67.2±3.2)mg/g、(185.8±13.4) mg/g與(150.5±7.7)mg/g。與空白對(duì)照組相比，PBS組(t=8.621,P<0.001)和多奈哌齊組(t=9.974,P<0.001)小鼠腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量均較高。但與PBS組相比，多奈哌齊組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量較低(t=2.286,P=0.045)。

四、多奈哌齊對(duì)EAE小鼠腦內(nèi)MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，PBS組MMP-2 (5.60±0.65vs. 0.54±0.25,t=7.286,P=0.002)和MMP-9 (10.93±0.87vs. 2.61±0.49,t=8.322,P<0.001)的表達(dá)更高，而與PBS組比較，多奈哌齊可以抑制EAE小鼠腦內(nèi)MMP-2 (1.95±0.44vs. 5.60±0.65，t=4.679,P=0.010)和MMP-9 (4.45±0.70vs. 10.93±0.87,t=5.822,P=0.001)的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

討 論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多奈哌齊可以改善MS患者和EAE小鼠的認(rèn)知功能[8-10，15-16]。在本研究中，我們觀察到多奈哌齊可以減輕EAE小鼠病情的嚴(yán)重程度及其腰椎細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘征象，這恰恰與PBS組截然相反，近期也有研究顯示多奈哌齊可以快速增加調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及髓鞘化的髓鞘相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[17]。以上結(jié)果表明多奈哌齊對(duì)于疾病臨床期的EAE小鼠是具有治療作用的。

多奈哌齊發(fā)揮抗炎作用的潛在機(jī)制是多因素的。De Vries等[18]發(fā)現(xiàn)，血腦屏障滲透性升高，導(dǎo)致大量的白細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這一病理變化在MS和EAE小鼠疾病的發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要角色。MMP-2和MMP-9可能與T細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血腦屏障破壞相關(guān)，它們可以特異性降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原是血管基底膜的一個(gè)核心結(jié)構(gòu)成分，其降解會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞[19- 22]。在EAE小鼠出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)達(dá)到高峰，在MS患者的腦組織中也存在相同現(xiàn)象[23-25]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)血腦屏障滲透性的升高與MMP-2和MMP-9的上調(diào)同時(shí)存在，即多奈哌齊能降低MMP的表達(dá)和血腦屏障的滲透性[26]。

圖1 多奈哌齊組和PBS組腰髓組織病理結(jié)果

A、a：PBS組HE染色切片，可見(jiàn)普遍存在著炎性浸潤(rùn)與廣泛的血管袖套形，A為×40， a為×400；B、b：多奈哌齊組HE染色切片，炎性浸潤(rùn)與血管袖套形成較PBS組少，B為×40，b為×400；C、c：PBS組依來(lái)鉻花青浸漬染色切片，可見(jiàn)大片的脫髓鞘斑塊形成，C為×40，c為×400；D、d：多奈哌齊組依來(lái)鉻花青浸漬染色切片，脫髓鞘斑塊較PBS組少，D為×40，d為×400

圖2 不同組小鼠腦內(nèi)MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況

與空白對(duì)照(control)組相比，**P<0.01，與PBS組比較，##P<0.01

目前，多奈哌齊已被用于治療EAE小鼠及MS患者的認(rèn)知功能障礙[8-10]。我們的研究進(jìn)一步表明多奈哌齊可以減輕EAE小鼠疾病的嚴(yán)重程度、降低EAE小鼠中血腦屏障的滲透性及MMP-2/9的表達(dá)，提示在疾病臨床期予以多奈哌齊可以減輕EAE小鼠炎癥及炎癥介導(dǎo)的一系列病理生理反應(yīng)，而通過(guò)抑制MMP-2/9的表達(dá)改善血腦屏障滲透性的效應(yīng)可能是多奈哌齊治療EAE的一個(gè)機(jī)制，提示多奈哌齊在MS的治療上具有應(yīng)用前景。

[1]Geurts JJ, Barkhof F. Grey matter pathology in multiple sclerosis. LancetNeurol, 2008, 7(9): 841-851.

[2]Stromnes IM, Goverman JM. Active induction of experimentalallergicencephalomyelitis. Nat Protoc, 2006, 1(14): 1810-1819.

[3]Keegan BM, Noseworthy JH.Multiple sclerosis. Annu Rev Med, 2002, 53: 285-302.

[4]Hwang J, Hwang H, Lee HW, Suk K. Microglia signaling as a target ofdonepezil. Neuropharmacology, 2010, 58(7): 1122-1129.

[5]Yoshiyama Y, Kojima A, Ishikawa C, Arai K.Anti-inflammatory action of donepezil ameliorates tau pathology, synaptic loss, and neurodegeneration in a tauopathy mouse model.J Alzheimers Dis, 2010,22(1):295-306.

[6]Reale M, Iarlori C, Gambi F, Feliciani C, Isabella L, Gambi D. Theacetylcholinesterase inhibitor, Donepezil, regulates a Th2 bias in Alzheimer’sdisease patients. Neuropharmacology, 2006, 50(5): 606-613.

[7]Chen T, Hou R, Xu S, Wu C. Donepezil regulates 1-methyl-4-phenylpyridinium-Induced microglial polarization in Parkinson’s disease. ACS Chem Neurosci, 2015, 6(10):1708-1714.

[8]D’Intino G, Paradisi M, Fernandez M, Giuliani A, Aloe L, Giardino L, Calzà L.Cognitive deficit associated with cholinergic and nerve growth factordown-regulation in experimental allergic encephalomyelitis in rats. Proc NatlAcad Sci USA, 2005, 102(8): 3070-3075.

[9]Krupp LB, Christodoulou C, Melville P, Scherl WF, Pai LY, Muenz LR, He D, Benedict RH, Goodman A, Rizvi S, Schwid SR, Weinstock-Guttman B, Westervelt HJ, Wishart H. Multicenter randomized clinical trial of donepezil for memory impairment in multiple sclerosis. Neurology, 2011,76(17):1500-1507.

[10]Wiebenga OT, Hulst HE, Kooi EJ, Killestein J, Geurts JJ, Heilman KM, Williamson JB, Krupp LB, Christodoulou C, Benedict RH.Multicenter randomized clinical trial of donepezil for memory impairment in multiple sclerosis.Neurology, 2011,77(22):1998-2000.

[11]Chen X, Hu X, Zou Y, Pi R, Liu M, Wang T, Zheng X, Liu M, Lin M, Liu P, Tao L. Combined treatmentwithminocycline and prednisone attenuates experimental autoimmuneencephalomyelitis in C57 BL/6 mice. J Neuroimmunol,2009,210(1-2): 22-29.

[12]Racke MK, Quigley L, Cannella B, Raine CS, McFarlin DE, Scott DE.Superantigen modulation of experimental allergic encephalomyelitis: activationof energy determines outcome. J Immunol, 1994,152(4): 2051-2059.

[13]Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, Benvenuto F, Bonanni I, Gerdoni E,Giunti D, Ceravolo A, Cazzanti F, Frassoni F, Mancardi G, Uccelli A. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitisinducing T-cell anergy. Blood, 2005, 106(5): 1755-1761.

[14]Ma X, Jiang Y, Wu A, Chen X, Pi R, Liu M, Liu Y.Berberine attenuatesexperimental autoimmune encephalomyelitis in C57 BL/6 mice.PLoS One, 2010,5(10):e13489.

[15]Janowsky DS, Davis JM, Overstreet DH. Anticholinesterase (DFP) toxicity antagonism by chronic donepezil: a potential nerve agent treatment.Pharmacol Biochem Behav, 2005,81(4):917-922.

[16]Scali C, Casamenti F, Bellucci A, Costagli C, Schmidt B, Pepeu G.Effect of subchronic administration of metrifonate, rivastigmine and donepezil on brain acetylcholine in aged F344 rats.J Neural Transm, 2002,109(7-8):1067-1080.

[17]Imamura O, Arai M, Dateki M, Ogata T, Uchida R, Tomoda H, Takishima K. Nicotinic acetylcholine receptors mediate donepezil-induced oligodendrocyte differentiation.J Neurochem, 2015,135(6):1086-1098.

[18]De Vries HE, Kuiper J, De Boer AG, Van Berkel TJ, Breimer DD. The blood-brainbarrier in neuroinflammatory diseases. Pharmacol. Rev, 1997, 49(2): 143-155.

[19]Yong VW, Power C, Forsyth P, Edwards DR. Metalloproteinases in biology and pathology of the nervous system. Nat Rev Neurosci,2001,2(7): 502-511.

[20]Vandooren J, Van Damme J, Opdenakker G. On the structure and functions of gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 in neuroinflammation.Prog Brain Res, 2014, 214:193-206.

[21]Mun-Bryce S, Rosenberg GA. Gelatinase B modulates selective opening ofthe blood-brain barrier during inflammation. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol, 1998, 274(5 Pt 2), 1203-1211.

[22]Mirshafiey A, Asghari B, Ghalamfarsa G, Jadidi-Niaragh F, Azizi G.The significance of matrix metalloproteinases in the immunopathogenesis and treatment of multiple sclerosis.Sultan Qaboos Univ Med J, 2014, 14(1):e13-25.

[23]Dong M, Liu R, Guo L, Li C, Tan G. Pathological findings in rats with experimental allergic encephalomyelitis.APMIS, 2008, 116(11):972-984.

[24]Benesová Y, Vasku A, Novotná H, Litzman J, Stourac P, Beránek M, Kadanka Z,Bednarík J.Matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-2 as biomarkers of various courses in multiple sclerosis.Mult Scler, 2009,15(3):316-322.

[25]Trentini A, Castellazzi M, Cervellati C, Manfrinato MC, Tamborino C, Hanau S, Volta CA, Baldi E, Kostic V, Drulovic J, Granieri E, Dallocchio F, Bellini T, Dujmovic I, Fainardi E.Dis Markers.Interplay between matrix metalloproteinase-9, matrix metalloproteinase-2, and interleukins in multiple sclerosis patients.Dis Markers, 2016, 2016:3672353.

[26]馬麗麗, 陳曉紅. 小檗堿在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué)，2012，43(7): 437-440.

(本文編輯：洪悅民)

Effect of donepezil on inhibiting blood-brain barrier permeability in mouse models with experimental autoimmune encephalomyelitis

JiangYing,LiuYingying,MaLili,ChenXiaohong.

DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

,ChenXiaohong,E-mail:xiaohongchenzssy@aliyun.com

Objective To evaluate the effect of donepezil upon inhibiting the blood-brain barrier permeability in mouse models with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods Forty eight female C57BL/6 mice, aged 6-8 weeks, were divided into the donepezil (n=19), phosphate buffer saline(PBS,n=19) and control groups (n=10). EAE mouse models were established in the donepezil and PBS groups. In the donepezil group, intragastric gavage of PBS containing 2 mg/(kg·d) of donepezil was delivered at 13 d after innoculation, whereas PBS alone was administered in the PBS group. The grading of clinical symptoms and histological evaluation were performed in EAE mice (inflammation and demyelinating scores). The blood-brain barrier permeability was assessed by Evans blue staining. The expression levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 were measured by western blot. Results The score of clinical symptoms in the donepezil group was significantly lower compared with that in the PBS group (t=4.351,P<0.001). The inflammation score in the donepezil group was considerably lower than that in the PBS group (t=6.325,P<0.001). In the PBS group, a large mass of myelinoclasis was observed, whereas demyelinating lesion was seldom seen in the donepezil group with statistical significance (t=3.308,P=0.008). Compared with the control group, intracerebral content of Evans blue in the PBS (t=8.621,P<0.001) and donepezil groups (t=9.974,P<0.001) was significantly higher. However, intracerebral content of Evans blue in the donepezil group was significantly less compared with that in the PBS group (t=2.286,P=0.045). Compared with the PBS group, donepezil could significantly down-regulate the expression levels of MMP-2 (t=4.679,P=0.010) and MMP-9 (t=5.822,P=0.001). Conclusion Donepezil can reduce the blood-brain barrier permeability in EAE mouse models.

Donepezil; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinase

10.3969/j.issn.0253.9802.2016.12.003

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2014233)

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)科

，陳曉紅，E-mail：xiaohongchenzssy@aliyun.com

2016-08-23)