HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立及鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究

龔 菂，李 芬，鄒 欣，王定坤，陸付耳，王開富

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1.中西醫(yī)結(jié)合研究所、2.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心，湖北 武漢 430030)

HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立及鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究

龔 菂1，李 芬2，鄒 欣1，王定坤1，陸付耳1，王開富1

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1.中西醫(yī)結(jié)合研究所、2.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心，湖北 武漢 430030)

目的 建立HepG2(人肝胚胎瘤細(xì)胞)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)細(xì)胞模型，并在該模型上研究小檗堿改善IR的效應(yīng)。方法 用25 mmol·L-1高糖，并分別用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1胰島素處理，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生IR；對(duì)2-NBDG(熒光素標(biāo)記葡萄糖)與HepG2細(xì)胞孵育濃度設(shè)定為：50、100、200、400、600、800 μmol·L-1、孵育時(shí)間設(shè)定為：20、40、60、80、100 min，擬篩選最佳胰島素處理濃度、2-NBDG與HepG2最佳孵育濃度和最佳孵育時(shí)間，通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量及細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量作為判定模型成功的標(biāo)志；用二甲雙胍、鹽酸小檗堿干預(yù)模型細(xì)胞，研究鹽酸小檗堿在細(xì)胞水平上改善IR的效應(yīng)。結(jié)果 6種濃度的胰島素均可不同程度誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生IR，雖然10-5、10-4mol·L-1劑量最明顯，但細(xì)胞死亡較多，以10-6mol·L-1劑量制模有效且細(xì)胞成活率高，與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)2-NBDG與HepG2細(xì)胞孵育濃度大于100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞熒光強(qiáng)度與正常組差異有顯著性，孵育時(shí)間超過20 min熒光強(qiáng)度與正常組比較有明顯差異，超過100 min，細(xì)胞內(nèi)熒光有明顯淬滅衰減現(xiàn)象；鹽酸小檗堿、二甲雙胍能明顯增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖的消耗及細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 用HepG2制作IR細(xì)胞模型時(shí)，選擇10-6mol·L-1劑量的胰島素；2-NBDG孵育濃度選擇為200 μmol·L-1、2-NBDG孵育時(shí)間選擇為80min較為適宜，鹽酸小檗堿及二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞IR具有明顯的改善作用。

鹽酸小檗堿，HepG2細(xì)胞，胰島素抵抗，細(xì)胞模型；葡萄糖攝?。粚?shí)驗(yàn)研究

目前認(rèn)為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是貫穿多種代謝相關(guān)疾病的主線，是心血管疾病、高脂血癥、高尿酸血癥及代謝綜合癥的共同病理基礎(chǔ)[1-2]。構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型是進(jìn)行IR相關(guān)疾病的病理機(jī)制探索及藥物研發(fā)的重要途徑。肝臟及外周組織是胰島素作用的靶器官，是IR產(chǎn)生的主要部位。HepG2細(xì)胞源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞，系一種表型與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，在高水平的胰島素條件下，HepG2細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時(shí)間呈正相關(guān)[3]，因此 HepG2是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想細(xì)胞模型[4]，鑒于目前許多報(bào)道有關(guān)HepG2 細(xì)胞體外建立胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)條件均不太一致，特別是過去觀察細(xì)胞成模只是單從細(xì)胞上清葡萄糖的消耗量來反映，有很大局限性，因此，我們對(duì)該細(xì)胞的制模條件、尤其是利用熒光標(biāo)記葡萄糖-2-NBDG摻入到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)HepG2 細(xì)胞攝取葡萄糖的相關(guān)實(shí)驗(yàn)及小檗堿改善HepG2 細(xì)胞IR效應(yīng)進(jìn)行了系列研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；2-NBDG(熒光標(biāo)記葡萄糖)購置Cayman Chemical公司；胰島素購置Sigma公司；鹽酸小檗堿(批號(hào)：110713-200208，純度：99.0%)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所；二甲雙胍(批號(hào)：EJ121231，純度：98.5%)購自天津太平洋化學(xué)制藥有限公司。葡萄糖測(cè)試試劑盒購置南京建成生物工程研究所。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2消化后，以每孔1.5×104種到96孔板內(nèi)(完全培養(yǎng)基)，吸去原培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，饑餓10 h。加不同濃度：0(不加胰島素)、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1胰島素處理36 h(母液用無血清培養(yǎng)基稀釋)，吸去胰島素，PBS清洗2次，加入無血清培養(yǎng)基，孵育24h，用葡萄糖氧化酶法，于505 nm處以酶標(biāo)儀分別檢測(cè)用胰島素處理的各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液及未接種細(xì)胞的空白孔(含糖量已知的培養(yǎng)液) OD值，與葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)濃度計(jì)算每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，并用未接種細(xì)胞的空白孔糖含量均值相減，計(jì)算葡萄糖的消耗量。

計(jì)算方法：待測(cè)液葡萄糖含量/mmol·L-1=(待測(cè)液OD值/標(biāo)準(zhǔn)液OD值)×5.55 mmol·L-1

葡萄糖消耗量/mmol·L-1=空白孔糖含量均值-每孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液糖含量

1.3 HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育時(shí)間 通過對(duì)細(xì)胞上清葡萄糖消耗量的檢測(cè)初步篩選胰島素最佳制模劑量為10-6mol·L-1，細(xì)胞成模后再用2-NBDG與HepG2細(xì)胞分別孵育20、40、60、80、100 min檢測(cè)細(xì)胞上清葡萄糖消耗量及細(xì)胞對(duì)2-NBDG(熒光強(qiáng)度)攝取量，計(jì)算對(duì)照組與模型組的差值，篩選最佳孵育時(shí)間。

1.4 HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育濃度 通過對(duì)細(xì)胞上清葡萄糖消耗量的檢測(cè)初步篩選胰島素最佳制模劑量為10-6mol·L-1，細(xì)胞成模后再分別設(shè)定50、100、200、400、600、800 μmol·L-12-NBDG劑量與HepG2細(xì)胞共孵育60 min后，檢測(cè)細(xì)胞上清葡萄糖消耗量及細(xì)胞對(duì)2-NBDG(熒光強(qiáng)度)攝取量，計(jì)算對(duì)照組與模型組的差值，確定2-NBDG最佳濃度。

1.5 熒光葡萄糖的攝取 將細(xì)胞種置于特殊的96孔板，黑板子底部透明，每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞，用上述方法造模后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗板2次，加入二甲雙胍(終濃度為25 μmol·L-1)、鹽酸小檗堿(終濃度為10 μmol·L-1)干預(yù)胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞，孵育24 h后收集培養(yǎng)上清液，用葡萄糖氧化酶方法檢測(cè)上清液中葡萄糖的含量，PBS洗板2次，避光加入200 μmol·L-1的2-NBDG 37 ℃孵育1 h后棄去2-NBDG，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入100 μL的PBS(整個(gè)過程避光)，快速在酶標(biāo)儀下，在460 nm 激發(fā)光、528 nm發(fā)射光，儀器靈敏度為50的條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算對(duì)照組及給藥組細(xì)胞的葡萄糖消耗量及細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的胰島素對(duì)制模的影響 如Tab 1所示，6種濃度的胰島素均可不同程度的誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生IR，但10-6mol·L-1劑量最適宜，其細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖消耗明顯增多且細(xì)胞成活率高，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育時(shí)間 由Fig 1可見，當(dāng)孵育時(shí)間>20 min以上，各時(shí)間組HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于NC組(P<0.05)；于80 min攝取的葡萄糖最多，與NC組比較差異具有顯著性(P<0.01)，結(jié)果表明HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育時(shí)間以80 min較為適宜。

Tab 1 Effect of different concentrations of insulin on model

GroupInsulinconcentration(mmol·L-1)Glucoseconsumption(mmol·L-1)Normalcontrol05.771±0.22210-95.005±0.28310-85.316±0.161Model10-73.712±0.368*10-62.059±0.166*10-51.954±0.215**10-41.543±0.145**

*P<0.05;**P<0.01vsnormal control group (without insulin group)

Fig 1 Effect of different incubating time of 2-NBDG on fluorescence intensity

NC：Normal control；20-100： Different time set,*P<0.05,**P<0.01vsNC

2.3 HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育濃度 Fig 2顯示，當(dāng)孵育濃度>100 μmol·L-1以上，各濃度組HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于NC組(P<0.05，P<0.01)，且孵育濃度與熒光強(qiáng)度具有明顯的量效關(guān)系。

2.4 鹽酸小檗堿對(duì)IR的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖消耗的影響 如Tab 2所示，用鹽酸小檗堿、二甲雙胍分別對(duì)胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)兩種藥物均能促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖的消耗，與模型組比較葡萄糖消耗量明顯增多(P<0.05)。

2.5 鹽酸小檗堿對(duì)IR的HepG2細(xì)胞內(nèi)攝取葡萄 糖的影響 Fig 3顯示，當(dāng)鹽酸小檗堿、二甲雙胍組(西藥陰性對(duì)照組)干預(yù)IR的HepG2細(xì)胞后，兩組均能明顯促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，顯示細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于模型組(P<0.01)；Fig 4顯示，在熒光顯微鏡下(×200)觀察進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的2-NBDG，可見鹽酸小檗堿及二甲雙胍兩組細(xì)胞內(nèi)2-NBDG明顯增多，熒光強(qiáng)度明顯高于模型組。

Fig 2 Effect of different concentrations of 2-NBDG on fluorescence intensity

NC：Normal control ；50～800：Different concentration groups.*P<0.05,**P<0.01vsNC.

Tab 2 Effect of berberine hydrochloride on glucose

GroupDrugdose/μmol·L-1Glucoseconsumption/mmol·L-1Normalcontrol25.33±0.77Modelgroup11.95±1.94**Berberinehydrochloride1016.85±0.33*#Metformingroup25016.27±1.09*#

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group；#P<0.05vsmodel group

Fig 3 Effect of berberine hydrochloride on 2-NBDG uptake in HepG2 cells

M:Model group，BBR：Berberine hydrochloride; MET：Metformin group.**P<0.01vsmodel.

3 討論

體外建立胰島素抵抗細(xì)胞模型既能在細(xì)胞及分子水平深入探討胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制，又可體外篩選防治胰島素抵抗的藥物，因此建立穩(wěn)定可靠的細(xì)胞模型至關(guān)重要，HepG2 細(xì)胞源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞，是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的研究胰島素抵抗機(jī)制的細(xì)胞模型。我們圍繞細(xì)胞模型制作條件及鹽酸小檗堿抗胰島素抵抗的效應(yīng)進(jìn)行了系列研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度胰島素刺激HepG2細(xì)胞均可不同程度誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗,并表現(xiàn)為明顯的量效關(guān)系，用10-5、10-4mol·L-1劑量的胰島素刺激細(xì)胞能使細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖消耗量明顯減少，表明胰島素抵抗明顯，但MTT檢測(cè)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡增多，可能是太高濃度的胰島素使細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)活力有所降低，因此，該劑量制模不可??；用10-8、10-9mol·L-1濃度刺激細(xì)胞，雖然細(xì)胞存 活率高，但細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖消耗量與正常對(duì)照組比較差異無顯著性，表明胰島素抵抗不明顯，故以10-6mol·L-1誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型效果最佳。許多文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]判定胰島素抵抗細(xì)胞模型成功與否，僅單從細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖消耗量來反映具有很大的局限性，也有人用同位素標(biāo)記葡萄糖來監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量而反映胰島素抵抗情況[7]，方法雖靈敏可靠，但鑒于同位素對(duì)人體的傷害，導(dǎo)致目前國(guó)內(nèi)幾乎不生產(chǎn)同位素標(biāo)記的葡萄糖試劑盒，取而代之的是新型的熒光素標(biāo)記的葡萄糖-2-NBDG，這種試劑盒可以通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)來反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取量。因此本研究采用兩種方法即同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖消耗量及細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝取量來反映胰島素抵抗的模型成功與否，更精細(xì)更完善。細(xì)胞與2-NBDG的孵育時(shí)間和孵育濃度是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，本研究結(jié)果顯示：當(dāng)孵育時(shí)間>20 min以上時(shí)，各時(shí)間組HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取均明顯增多，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于NC組(P<0.05)，表明細(xì)胞攝取的葡萄糖多，于80min攝取的葡萄糖最多，與NC組比較差異有顯著性(P<0.01)，結(jié)果表明HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育時(shí)間以80 min較為適宜；當(dāng)孵育濃度>100 μmol·L-1以上時(shí)，各濃度組HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強(qiáng)度明顯高于NC組(P<0.05，P<0.01)，且孵育濃度與熒光強(qiáng)度具有明顯的量效關(guān)系。因此認(rèn)為HepG2細(xì)胞與2-NBDG孵育濃度以200 μmol·L-1即可(考慮2-NBDG試藥成本而不選用高劑量2-NBDG濃度)。

Fig 4 2-NBDG in cells under fluorescence miroscope(×200)

A: Model set B：Berberine hydrochloride(Drug dose：10 μmol·L-1) C：Metformin group(Drug dose：250 μmol·L-1)

鹽酸小檗堿是一種常見的異哇琳生物堿，作為中草藥其常用于治療炎癥、細(xì)菌相關(guān)性腹瀉、腸道寄生蟲感染等，除抗炎作用外，近來有關(guān)鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的報(bào)道相繼增多[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型成功建立的基礎(chǔ)上用鹽酸小檗堿和二甲雙胍干預(yù)細(xì)胞后，兩種藥物均能使細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖的消耗量明顯增多、細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.01)，而兩組藥物間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),熒光顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞對(duì)2-NBDG攝取明顯增多(Fig 5)，與熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果十分吻合，該結(jié)果表明鹽酸小檗堿和二甲雙胍均能明顯改善高糖加胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。近年來，小檗堿抗糖尿病已成為研究熱點(diǎn)[10-12]但其作用機(jī)制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)途徑是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一，研究表明，胰島素刺激包括脂肪和骨骼肌在內(nèi)的靶組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體(InsR)、胰島素受體底物-1(IRS-1)、PI-3K葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的[13]。在PI-3K途徑中，當(dāng)胰島素與靶細(xì)胞表面的受體(InsR)結(jié)合，InsR即發(fā)生自身磷酸化并激活內(nèi)在的酪氨酸激酶，導(dǎo)致IRS-1等酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的IRS-1與PI-3K的p85調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合，催化p110而激活PI-3K，活化的PI-3K可加速GLUT4從胞內(nèi)易位至胞膜，調(diào)節(jié)肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[14]。這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的任何環(huán)節(jié)障礙均可引起胰島素抵抗。對(duì)于體外的胰島素抵抗細(xì)胞模型,鹽酸小檗堿可能主要通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來改善胰島素的生物效應(yīng),提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小檗堿可能以胰島素增敏劑的形式促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗而改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗，但它促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗或細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的機(jī)制將在后期進(jìn)一步的研究報(bào)道。

[1] Sowers J R,Frohlich ED. Insulin and insulin resistance impact on bloodpressure and cardiovascular disease[J].MedClinNorthAm,2004,88(1):63-821.

[2] Valeria L Z,Monika Z B. Insulin resistance in hypertension and cardio-vascular disease[J].BestPractice&Research,2006,20(3):355-3671.

[3] Levy J R，Belsky M． Down-regulated insulin receptors in HepG2 cells have an altered intracellular itinerary[J]．AmJMedSci， 1990,299(5):302-308.

[4] Dhananjay G，Shailly V，Ramji L K． Long-term effects of tumor necrosis factor-α treatment on insulin sigalling pathway in HepG2 cells and HepG2 cells overexpressing constitutively active Akt/PKB[J].JCellBiochem，2007,100(3):593-607.

[5] 方 飛，吳新榮，羅明俐，呂 歡. HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及在篩選桑葉有效部位中的應(yīng)用[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2012,31(6):691-4.

[5] Fang F, Wu X R, Luo M L, et al. Establishment of insulin resistance HepG2 cell model and its application in screening bioactive compoments of mulberry leaves[J].HeraldMed, 2012,31(6):691-4.

[6] 李秀麗，賀嵩敏，朱 瑩,等. HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立與鑒定[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013,19(5):203-6.

[6] Li X L, He S M, Zhu Y, et al. Establishment and identify of HepG2 cells model of insulin resistance[J].ChinJExpTraditMedForm, 2013,19(5): 203-6.

[7] 易 屏，陸付耳，陳 廣，等. 小檗堿抑制IKKBSer 181磷酸化改善高糖誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制[J]. 中草藥， 2008,39(5):724-8.

[7] Yi P, Lu F E, Chen G, et al. Molecular mechanism of berberine on improving insulin resistance of 3T3-L1 adipocytes induced by high glucose through IKKβ Ser 181 phosphorylation[J].ChinTraditHerbalDrugs, 2008,39(5):724-8.

[8] 丁陽平，葉小利，周 潔，等. 小檗堿降糖作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2013，44(6)：763-9.

[8] Ding Y P,Ye X L,Zhou J, et al. Research progress in hypoglycemic mechanism of bererbine[J].ChinTraditHerbalDrugs, 2013,44(6):763-9.

[9] 陳 廣，陸付耳，王增四，等. 小檗堿改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗與PI-3K、GLUT4蛋白相關(guān)性的研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2008,24(8):1007-10.

[9] Chen G, Lu F E,Wang Z S, et al. Study on the improvement of berberine in type 2 diabetic rats with insulin resistance and the relationship between PI-3K and GLUT4 protein correlation[J].ChinPharmacolBull, 2008,24(8):1007-10.

[10]李 穎，李健琳，范 晨，等. 小檗堿片對(duì)2型糖尿病患者胰島素分泌及抵抗的影響[J]. 現(xiàn)代診斷與治療， 2015,26(7):1450-1.

[10]Li Y , Li J L, Fan C, et al. Berberine tablets in patients with type 2 diabetes insulin secretion and the influence of the resistance[J].ModernDiagnTreat, 2015,(267):1450-1.

[11]張 青，李 琰，陳 磊. 黃連素對(duì) 2 型糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015,40(9):1660-5.

[11]Zhang Q, Li Y, Chen L, et al. Effect of berberine in treating type 2 diabetes mellitus and complications and its relevant mechanisms[J].ChinJChinMaterMed, 2015,40(9):1660-5.

[12]馬 航,胡慭然,鄒宗堯,等.黃連生物堿降糖作用研究及構(gòu)效關(guān)系初探[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(11):1575-9.

[12]Ma H,Hu Y R,Zou Z Y,et al. Preliminary evaluation of antihyperglycemic effect of Rhizoma Coptidis alkaloids and their structure-activity relationships[J].ChinPharmacolBull,2015,31(11):1575-9.

[13]Wojtaszewski J F P,Hansen B F,Kien B, et a.l Insulin signaling in human skeletalmuscle: time course and effectof exercise[J].DiaBetes, 1997,46(11): 1775-81.

[14]Jackson S, Bagstaff S, Yeasman S J, et a.l Decreased insulin re-sponsiveness ofglucose uptake in cultured human skeletalmuscle cells from insulin-resistantnondiabetic relatives ofType 2 diabetic families[J].Diabetes， 2000,49(7): 1169-77.

HepG2 cell IR： Establishment of model and improvement by berberine

GONG Di1, LI Fen2， ZOU Xin1， WANG Ding-kun1LU Fu-er1,WANG Kai-fu1

(1.InsitituteofIntegratedTraqditionalChineseandWesternMedicine, 2.ExperimentMedicalResearchCenter,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Aim To establish insulin resistance cell model on HepG2 cells (human embryonic liver tumor cells ) and investigate the effect of berberine hydrochloride on insulin-resistant HepG2 (IR-HepG2) cells. Methods ① IR model was induced by respectively using 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4mol·L-1insulin with 25 mmol·L-1glucose in HepG2 cells. ② HepG2 cells were incubated with 2-NBDG (fluorescent labeled glucose) in a series of concentration: 50, 100, 200, 400, 600, 800 μmol·L-1and a series of incubation time: 20, 40, 60, 80, 100 min, to select the optimum concentration of insulin and the optimum incubation concentration and time of 2-NBDG in HepG2 cells. The success of the model was determined by detecting the consumption of glucose in the cell supernatant and the uptake of glucose in HepG2 cells. ③ To study the effect of berberine hydrochloride on improving insulin resistance on the cell level, metformin and berberine hydrochloride were used in the IR cells. Results Six concentrations of insulin induced the IR model in different degrees. Although 10-4, 10-5mol·L-1insulin was significant, a large amount of cells died. 10-6mol·L-1insulin was effective and had high survival rate of HepG2 cells, which had statistical significance compared with the normal group. When the incubation concentration of 2-NBDG was more than 100 mol·L-1, the fluorescence intensity of the cells was significantly different from the normal group. When the incubation time of 2-NBDG was more than 20 min, fluorescence intensity was significantly different from the normal group. When the incubation time of 2-NBDG was more than 100 min, the fluorescence quenching phenomenon was obvious in the cells. Berberine hydrochloride and metformin significantly increased the glucose consumption and glucose uptake in cell supernatant, which had statistical significance compared with the model group. Conclusions Using 10-6mol·L-1insulin induced IR model in HepG2 cells, the optimum incubation concentration and incubation time of 2-NBDG is 200 μmol·L-1and 80 min, respectively. Berberine hydrochloride and metformin have obvious effect on improving IR in HepG2 cells.

berberine hydrochloride; HepG2 cells; insulin resistance; the cell model; glucose uptake; experimentel research

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.044.html

2016-07-05，

2016-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81373872)

龔 菂(1984-)，女，檢驗(yàn)師,E-mail:27770583@qq.com; 王開富(1958-)，男，碩士，主任技師，通訊作者，Tel:027-83663660,E-mail:wkf58@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.022

A

1001-1978(2016)12-1750-05

R284.1；R343.23；R347.8；R458.5；R587.1；R915；R977.15；R977.7