安息香對永久性大腦中動脈栓塞大鼠模型的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

文 靜，王 建，陳 念，羅世蘭，謝 倩，馬 驍

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

安息香對永久性大腦中動脈栓塞大鼠模型的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

文 靜，王 建，陳 念，羅世蘭，謝 倩，馬 驍

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

目的 探討安息香對永久性局灶性腦缺血(pMCAO)大鼠模型的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 健康成年♂ SD大鼠65只，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型對照組、溶劑組、尼莫地平組、安息香組。通過線栓法建立永久性局灶性腦缺血(pMCAO)大鼠模型，參照Longa評分法對大鼠神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評分，計算缺血側(cè)腦組織含水量及腦水腫率，TTC染色法測定腦梗死率，ELISA法檢測血清中VEGF和TNF-α含量。結(jié)果 與溶劑組相比，安息香有降低模型大鼠神經(jīng)功能評分的趨勢，但差異無顯著性；安息香能明顯地降低模型大鼠缺血側(cè)腦組織含水量、腦水腫率及腦梗死率(P<0.01)；升高模型大鼠血清中VEGF的含量(P<0.01)，降低TNF-α的含量(P<0.05)。結(jié)論 安息香降低pMCAO大鼠腦含水量和腦水腫率，減小腦梗死范圍發(fā)揮腦保護(hù)作用，可能是其呈現(xiàn)開竅醒神效應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，機(jī)制可能與上調(diào)VEGF含量和下調(diào)TNF-α的含量有關(guān)。

安息香；永久性局灶性腦缺血；神經(jīng)功能評分；腦含水量；腦梗死率；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；腫瘤壞死因子-α

安息香主產(chǎn)于蘇門答臘，是安息香科植物白花樹Styraxtonkinensis(Pierre)Craib ex Hart.的干燥樹脂，具有開竅醒神、行氣活血、止痛之效，用于治療中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、心腹疼痛、產(chǎn)后血暈、小兒驚風(fēng)[1]。本研究采用線栓法致大鼠永久性局灶性大腦中動脈阻塞的模型(pMCAO)，觀察安息香的抗腦缺血損傷作用及其保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物 健康成年♂ SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量230～270 g，購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，合格證號:SCXK(川)2013-15，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。實驗場地：成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室(NO:TCM-09-315)。

1.2 實驗藥物 安息香(產(chǎn)地蘇門答臘)購于成都新荷花中藥材市場，按照2015版《中國藥典》安息香項下含量測定要求，測出安息香中苯甲酸含量為38%，符合藥典不少于27%的規(guī)定。

安息香的給藥劑量：按照成人(60 kg)日用量(1.5 g)的40倍計算，即1 g·kg-1。給藥前用體積分?jǐn)?shù)為0.05的吐溫+質(zhì)量濃度為2 g·L-1的羧甲基纖維素鈉溶液配制成50 g·L-1。配制好的藥液置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。灌胃前將藥液加熱并搖勻。

1.3 主要儀器與試劑 BP211D電子分析天平(賽多利斯)；恒溫水浴鍋(常州國華電器)；離心機(jī)(長沙湘儀)；VEGF ELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司，批號21F057)；TNF-α ELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司，批號21F075)；TTC(Amresco，美國)；尼莫地平(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號150645)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 大鼠購回經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，于d 6取健康♂大鼠65只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對照組、溶劑組(體積分?jǐn)?shù)為0.05的吐溫+質(zhì)量濃度為2 g·L-1的羧甲基纖維素鈉)、尼莫地平組(0.012 g·kg-1)、安息香組共5組，每組13只，其中8只用于腦含水量的測定，5只用于腦梗死體積的測定。模型對照組和假手術(shù)組均按20 mL·kg-1灌胃給予生理鹽水，溶劑組灌胃給予體積分?jǐn)?shù)為0.05的吐溫+質(zhì)量濃度為2 g·L-1的羧甲基纖維素鈉(具體給藥劑量見表1)，連續(xù)灌胃3 d，每天1次。

2.2 MCAO動物模型制作 各組大鼠末次給藥30 min后，參照Longa方法[2]加以改進(jìn)對大鼠進(jìn)行MCAO手術(shù)：大鼠稱重，用100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺上，四肢線繩固定。頸部正中切開，依次分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎CCA近心端和ECA遠(yuǎn)心端。在ICA近端備線，遠(yuǎn)端放置動脈夾，CCA切口，插入直徑為0.28 mm的標(biāo)記魚線，松開動脈夾，魚線向ICA插入20 mm栓線進(jìn)入ICA，穿過大腦中動脈(MCA)起始端至大腦前動脈(ACA)近端。固定栓線，記錄此刻時間，作為大腦局灶性缺血開始的時間。逐層縫合切口，消毒，回籠飼養(yǎng)并觀察。動物清醒后爬行時向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，嚴(yán)重時向右跌倒，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲提示造模成功。假手術(shù)組僅作皮膚切開和血管剝離，不做栓線處理，其余操作同其它組。在操作過程中，連續(xù)監(jiān)測動物的體溫，并把溫度保持在37℃。參照Longa評定法，進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分，得分≥1視為造模成功。

2.3 神經(jīng)功能評分 參照Longa評定法，分別于缺血4h、24h后對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，具體計分方法如下：0分，無任何神經(jīng)功能缺失體征；1分，未損傷側(cè)前肢不能伸展；2分，向未損傷側(cè)弧線行走或追尾轉(zhuǎn)圈；3分，向未損傷側(cè)傾斜或傾倒；4分，意識障礙，無自主行走。

2.4 腦組織含水量測定 各組隨機(jī)選取8只造模成功大鼠，于缺血24 h后，斷頭處死，立即取出大腦，表面水分用濾紙吸干后將缺血側(cè)與非缺血側(cè)大腦分別置于稱量杯中稱其濕重，然后置于105℃-115℃烘箱中烘至恒重后稱其干重，根據(jù)以下公式計算缺血側(cè)腦組織含水量和腦水腫率：

腦含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%

腦水腫率/%=(缺血側(cè)腦濕重-非缺血側(cè)腦濕重)/非缺血側(cè)腦濕重×100%

2.5 腦組織形態(tài)觀察及腦梗死率的測定 各組選取5只造模成功大鼠，于缺血24 h時斷頭處死，立即取出大腦，將腦置冰冷的生理鹽水(2～3) ℃中10 min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水沖洗大腦使表面不留血污，吸干周圍水分后，沿腦冠狀面切4刀，切成5片。第1刀在腦前極與視交叉連線中間；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后頁尾極之間。然后迅速將腦片置5 mL含有20 g·L-1TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30 min，其中每隔5 min翻動1次，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦片置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后拿出拍照。以分析測量圖像軟件Imagepro Plus分析腦片面積，分別計算出5個腦片共10個平面的總面積和梗死區(qū)域的面積，計算梗死區(qū)面積占總面積的比例，即梗死率。

2.6 血清中VEGF及TNF-α含量測定 各組大鼠于缺血24 h后麻醉，進(jìn)行腹主動脈取血，血液靜置0.5 h后3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，血清置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書采用ELISA法測定血清VEGF及TNF-α的含量。

3.1 安息香對MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷的影響 與假手術(shù)組比較，手術(shù)完成后的第4 h、24 h，模型組與溶劑組大鼠均明顯呈現(xiàn)出行為障礙(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，術(shù)后第4 h、24 h，尼莫地平組大鼠的行為評分明顯改善(P<0.05或P<0.01)；與溶劑組比較，安息香組大鼠的行為評分有改善趨勢，但無顯著性。見Tab 1。

GroupDose/g·kg-1NeurologicalscoreIschemia4hIschemia24hSham-0.00±0.000.00±0.00Model-2.13±0.64▲▲2.27±1.03▲▲Vehicle-1.67±0.65▲▲1.80±0.63▲▲Nimodipine0.0121.55±0.69*1.18±0.75**Benzoinum11.80±0.421.40±0.84

▲▲P<0.01vssham;*P<0.05，**P<0.01vsmodel

3.2 安息香對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織含水量及腦水腫率的影響 與假手術(shù)組比較，模型組與溶劑組的缺血側(cè)腦含水量與腦水腫率均明顯升高(P<0.01)，說明造模成功。而溶劑組腦水腫率明顯低于模型組(P<0.01)；尼莫地平組能明顯降低模型大鼠缺血側(cè)腦含水量和腦水腫率(P<0.01)。與溶劑組比較，安息香組亦能明顯降低缺血側(cè)腦含水量和腦水腫率(P<0.01)。見Tab 2。

Tab 2 Effects of benzoinum on ischemic brain tissue water content and brain edema rate in pMCAO ±s,n=8)

▲▲P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsvehicle

3.3 安息香對MCAO大鼠腦梗死面積的影響 從腦組織形態(tài)可以看出，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)完整，呈正常的玫瑰紅色，未見蒼白區(qū)。模型組和溶劑組腦組織可見明顯的蒼白腦梗死區(qū)。尼莫地平及安息香均可不同程度改善模型大鼠腦梗死面積。見Fig 1。 通過梗死區(qū)面積與總面積的比值計算得出腦梗死率。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組與溶劑組的腦梗死率明顯增加(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，尼莫地平組的腦梗死率明顯降低(P<0.01)。與溶劑組比較，安息香組亦能明顯降低缺血大鼠腦梗死率(P<0.01)。見Tab 3。

3.4 安息香對MCAO大鼠血清中VEGF及TNF-α的影響 與假手術(shù)組比較，模型組與溶劑組大鼠血清中VEGF的含量明顯降低(P<0.01)，TNF-α的含量明顯升高(P<0.01)。溶劑組TNF-α的含量明顯高于模型組(P<0.01)；尼莫地平組能明顯升高模型大鼠血清中VEGF的含量(P<0.05)，降低TNF-α的含量(P<0.01)。與溶劑組比較，安息香組能明顯升高大鼠血清中VEGF的含量(P<0.01)，降低TNF-α的含量(P<0.05)。見Tab 4。

Fig 1 TTC-stained brain tissue in each group Tab 3 Effects of benzoinum on cerebral infarction rate in pMCAO ±s,n=5)

GroupDosage/g·kg-1Cerebralinfarctionrate/%Sham-0.00±0.00Model-29.97±4.95▲▲Vehicle-28.43±3.51▲▲Nimodipine0.0127.76±6.04**Benzoinum113.10±4.14##

▲▲P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsvehicle

GroupDose/g·kg-1VEGF/ng·L-1TNF-α/ng·L-1Sham-24.52±2.2741.07±4.26Model-17.57±3.69▲▲58.20±3.54▲▲Vehicle-17.23±3.59▲▲78.90±6.50▲▲**Nimodipine0.01221.48±1.47*45.80±7.63**Benzoinum126.66±6.84##65.14±11.80#

▲▲P<0.01vssham;*P<0.05，**P<0.01vsmodel;#P<0.05，##P<0.01vsvehicle

4 討論

安息香常作為芳香開竅劑的組成藥，發(fā)揮開竅醒神之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，安息香具有抗炎解熱、抗腫瘤、止痛等作用[3]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)安息香具有抗小鼠急性缺氧損傷的作用[4]，能有效保護(hù)連二亞硫酸鈉造成的PC12細(xì)胞缺糖缺氧損傷[5]，能明顯延長飽和氯化鎂致急性腦缺血小鼠的存活時間[6]，還能開放生理狀態(tài)下小鼠的血腦屏障[7]。提示安息香對腦缺血損傷可能有一定保護(hù)作用，其在改善缺血性腦卒中組方中發(fā)揮著較為重要的治療作用。

腦缺血是導(dǎo)致老年人死亡和殘疾的最常見的一種疾病，且隨著人口老齡化，其發(fā)病率還有增加的趨勢[8]。缺血性腦卒中是由多因素、多環(huán)節(jié)損傷所致的動態(tài)復(fù)雜的疾病，可分為缺血急性期、恢復(fù)期和后遺癥時期。腦卒中急性期和恢復(fù)期的治療，直接關(guān)系到患者的身體健康和生活質(zhì)量[9]。腦缺血后，由于缺血、缺氧引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，對缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要。血管生成需要多種因子參與，VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，在血管發(fā)生和形成過程中起著主要的調(diào)控作用，它在血管發(fā)生的主要作用包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移[10]。MCAO動物模型顯示，血管新生在缺血1～2周明顯可見，在缺血半暗帶區(qū)最為明顯。也有研究表明，MCAO后24h血管內(nèi)皮細(xì)胞開始增生，血管樣結(jié)構(gòu)從軟腦膜和腦實質(zhì)的血管向缺血區(qū)發(fā)展。永久性局灶性腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF表達(dá)于缺血后2～14 d內(nèi)持續(xù)增高，新血管的形成始于缺血后6～24 h，并一直持續(xù)28 d[11]。

炎癥因子引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能受損是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)[12]，炎癥反應(yīng)與腦缺血的發(fā)生關(guān)系密切，主要涉及腦水腫的發(fā)生、血腦屏障的破壞、炎性細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)等[13]。TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子，在腦缺血病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TNF-α通常主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，但神經(jīng)元、神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后也能產(chǎn)生。在發(fā)生腦缺血時，TNF-α活性明顯升高[14]。

永久性局灶性中動脈栓塞模型是常用的腦缺血動物實驗?zāi)Ｐ停渲谱鞣椒ń?jīng)過不斷優(yōu)化，目前已經(jīng)較為成熟，該方法具有簡單、成功率高、重復(fù)性好的特點，適用于觀察缺血后病理改變及評價相關(guān)治療藥物的療效[15]。

本實驗安息香的劑量及溶劑選擇均沿襲課題組前期研究結(jié)果。用體積分?jǐn)?shù)為0.05的吐溫再加質(zhì)量濃度為2g·L-1的羧甲基纖維素鈉才可使安息香得以充分混懸[16]。在本次實驗中，溶劑組對個別指標(biāo)有干預(yù)，能明顯降低模型大鼠的腦水腫率，升高模型大鼠缺血24 h時血清中TNF-α的含量。但是與溶劑組比較，安息香能明顯降低模型大鼠的腦水腫率和模型大鼠血清中TNF-α的含量，提示安息香對MCAO大鼠具有抑制損傷炎性因子TNF-α的作用。

本實驗用線栓法制備永久性大腦中動脈阻塞腦缺血大鼠模型(pMCAO)，實驗結(jié)果顯示，安息香能改善模型大鼠神經(jīng)功能評分、降低缺血側(cè)腦組織含水量、腦水腫率及腦梗死率，具有腦保護(hù)作用，可能是發(fā)揮開竅醒神效應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究還表明：安息香能明顯降低模型大鼠血清TNF-α含量，提示其通過抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕腦缺血損傷；且安息香能明顯升高模型大鼠缺血24 h血清VEGF含量，提示其在加速缺血早期血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，啟動血管新生方面也可能發(fā)揮著重要作用。由此推測，這可能是安息香促進(jìn)腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的部分機(jī)制。而其他相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

(致謝：本實驗在成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室完成，感謝導(dǎo)師王建教授的悉心指導(dǎo)以及陳念、羅世蘭、謝倩、馬驍?shù)葘嶒炇宜型瑢W(xué)對本實驗的幫助。)

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Study of protective effects and mechanism of benzoinum against permanent focal cerebral ischemia injury in rats

WEN Jing，WANG Jian，CHEN Nian，LUO Shi-lan，XIE Qian，MA Xiao

(MinistryofEducationKeyLaboratoryofStandardizationofChineseHerbalMedicine,KeyLaboratoryofSystematicResearchandDevelopmentandUtilizationoftheResourcesofTCMinSichuanProvince,KeyLaboratoryCo-sponsoredbyProvinceandMinistry,PharmacyCollege,ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137，China)

Aim To discuss protective effects and the mechanism of benzoinum against permanent focal cerebral ischemia (pMCAO) injury in rats. Methods sixty-five adult male Sprague-Dawley rats, weighing 230～270g were randomly divided into five groups: sham, pMCAO, pMCAO+vehicle, pMCAO+nimodipine, pMCAO+benzoinum groups. The rats were subjected to permanent focal cerebral ischemia. Neurological deficit testing was performed with Longa’s Scale, and ischemic brain tissue water content as well as brain edema rate was calculated. Cerebral infarction rate was tested by TTC-staining. Serum content of VEGF and TNF-α was detected by ELISA. Results Compared with pMCAO+ vehicle group, benzoinum had a tendency to improve the neurological deficit, and could significantly decrease the water content of ischemic brain tissue, brain edema rate and cerebral infarction rate (P<0.01). Benzoinum also could increase serum levels of VEGF (P<0.01) and decrease serum levels of TNF-α (P<0.05) in pMCAO model rats. Conclusions Benzoinum can reduce the ischemic brain tissue water content, brain edema rate and cerebral infarction rate, playing a role in cerebral protection, which may be the biological basis for inducing resuscitation. Its mechanism may be correlated with the up-regulation of VEGF and down-regulation of TNF-α.

benzoinum； permanent focal cerebral ischemia； neurological score； ischemic brain tissue water content； cerebral infarction rate； VEGF； TNF-α

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.020.html

2016-07-22,

2016-09-06

國家自然科學(xué)基金面上資助項目(No 81473371)

文 靜(1988-)，女，博士生，研究方向：中藥藥性理論學(xué)，E-mail：wenjing2340@qq.com； 王 建(1959-)，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥理論及應(yīng)用，通訊作者，E-mail：jianwang08@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.010

A

1001-1978(2016)12-1683-05

R-322；R284.1；R322.81；R743.330.1