大蒜活性成分DATS抑制血小板激活因子介導的黑色素瘤轉移的實驗研究

沈 穎，劉玉萍，王 旭，沈培亮，祝娉婷，陳文星,2，王愛云,2，陸 茵,2

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

大蒜活性成分DATS抑制血小板激活因子介導的黑色素瘤轉移的實驗研究

沈 穎1，劉玉萍1，王 旭1，沈培亮1，祝娉婷1，陳文星1,2，王愛云1,2，陸 茵1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的 探討大蒜的重要活性成分二烯丙基三硫化物(DATS)對血小板激活因子(PAF)介導的黑色素瘤的轉移的影響及其機制。方法 ① 采用MTT的方法檢測DATS對B16F10和A375兩種黑色素瘤細胞生長數(shù)目的影響；② 分別采用劃痕法及Transwell法檢測DATS對細胞遷移運動能力的影響；③ 采用 Western blot的方法分別檢測了DATS對PAF誘導的細胞MMP-2、ERK、p38等相關轉移蛋白的影響；④ 采用尾靜脈注射腫瘤轉移模型，檢測DATS體內抑制PAF介導的黑色素瘤轉移。結果 DATS濃度達50、100 μmol·L-1時，B16F10細胞的相對生長率分別降至73.21%、48.78%。DATS對PAF誘導的黑色素瘤B16F10細胞的水平遷移和垂直遷移有明顯的抑制作用，能夠明顯抑制PAF誘導的B16F10細胞的MMP-2、樁蛋白、局部黏著斑激酶(FAK)等遷移相關蛋白的表達。結論 DATS能夠明顯抑制PAF誘導的腫瘤轉移，且與使MAPKs失活有關。

大蒜素；黑色素瘤；腫瘤轉移；DATS；PAF；MAPK

炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了至關重要的作用。國內外研究學者的報道多數(shù)集中于炎癥和腫瘤之間的關系，具體研究包括炎性細胞、炎性介質及腫瘤相關的信號通路等[1-3]。血小板激活因子(platelet-activating factor，PAF)是一種活性磷脂，目前認為是一種第二信使，由內皮細胞、巨噬細胞、血小板等產(chǎn)生，能夠參與細胞活化、信號轉導以及炎癥反應的磷脂介質[4]。PAF是一種對磷脂酶 A2較為敏感，與花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 代謝密切相關的磷脂，是過敏反應和炎癥反應中起非常重要作用的炎癥因子[5]。

有研究顯示，腫瘤相關的細胞因子，如血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及抗凋亡的因子(Bcl-2和Bcl-xL)參與了腫瘤的生長及腫瘤轉移，是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵因子。研究指出，PAF能夠促進黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞的增殖和轉移，且作用的機制與其激活核轉錄因子NF-κB有關，可能促進了NF-κB依賴性的血管生成因子VEGF等上述因子的表達[6-7]。提示PAF所介導的炎癥在促進腫瘤方面具有關鍵作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其信號通路包括三級激酶模式，是真核細胞最廣泛的調控信號，含有ERK、p38、JNK和ERK5 4個亞族。大量的文獻研究顯示，MAPKs促進細胞的遷移、增強促存活基因以及增殖基因的表達，能夠促進基質金屬降解酶的表達，MAPKs信號通路在多種人類腫瘤中都能檢測到，包括結直腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌等。腫瘤細胞的遷移與腫瘤細胞的運動能力密切相關，腫瘤細胞在運動的過程中往往需要伸出片狀偽足，而在此過程中最重要的調控蛋白被認為是局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)，其調控的下游分子樁蛋白(paxillin)起到了錨定的作用。大量研究表明，MAPK、FAK等信號能夠受到很多細胞膜表面的生長信號受體所調控，其中包括PAFR[8]。

大蒜二烯丙基三硫化物(DATS)是大蒜的有機硫化物成分中最有效的抗癌成分。DATS也具有良好的抗炎活性。研究報道明確了大蒜素能夠有效地抑制皮膚癌，但其具體的機制尚不明確。近年來，國內外學者在DATS對腫瘤的治療方面進行了深入的研究和探索，并且報道DATS不但具有癌化學預防的作用，而且能夠抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。這些效應與其干擾了MAPKs信號，如p38和JNK等有關[9-10]。因此，本研究旨在證明MAPKs在PAF誘導的腫瘤轉移中的重要作用及DATS能夠抑制PAF誘導的腫瘤轉移，為中醫(yī)臨床防治腫瘤轉移提供重要指導。

1 材料與方法

1.1 細胞株 小鼠的黑色素瘤高轉移細胞株B16F10及A375購于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。本實驗采用37℃、5%的CO2孵箱條件孵育，用含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。

1.2 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，鼠齡為4～5周，體質量為18～22 g。

1.3 試劑與材料 RPMI 1640培養(yǎng)液：Gibco產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)購自以色列Biological Industries公司(貨號：1418110)；Matrigel購自美國B&D公司(貨號：356234)；胰蛋白酶：美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)板：美國BD公司；Transwell小室購自美國Costar公司(貨號：3422)；兔源性GAPDH多克隆抗體購自美國Bioworld公司(貨號：BSAP0063)；兔源性MMP-2單克隆抗體購自美國CST公司(貨號：4022S)；兔源性Paxillin單克隆抗體購自SAB公司(貨號：21107)；兔源性Akt單克隆抗體購自SAB公司(貨號：11054)；兔源性p38單克隆抗體購自CST公司(貨號：8690p)；兔源性FAK單克隆抗體購自SAB公司(貨號：21076)；兔源性JNK單克隆抗體購自美國Bioworld公司(貨號：AP0370)；兔源性ERK單克隆抗體購自美國CST公司(貨號：4695p)。

1.4 MTT法 取處在對數(shù)生長期的B16F10和A375細胞，常溫下1 000 r·min-1離心3 min，倒去上清液，接著用含10%FBS的RPMI l640完全培養(yǎng)基將細胞配制成相應的懸液備用，濃度調整為4×108·L-1，接種于96孔板，放入CO2細胞培養(yǎng)箱，細胞貼壁之后加藥。給予不同濃度的DATS(0～200 μmol·L-1)作用，加藥后，將96孔板放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，用1 mL注射器的針頭小心吸去上清液，換入新鮮的培養(yǎng)基200 μL，并在每孔加20 μL MTT溶液，避光孵育4 h后，用注射器小心吸走上清液，每孔加入200 μL的DMSO，避光震蕩10 min，酶標儀于490 nm下測定每孔吸光度(OD值)，計算出相對增殖率。

1.5 劃痕愈合實驗 取處在對數(shù)生長期 B16F10、A375細胞，用不含EDTA的胰酶消化細胞，調整細胞的濃度為5.0×108·L-1，接種于6孔板中，將6孔板置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待到細胞長到融合率達到80%～90%后，加入終濃度25 μg的絲裂霉素C作用2 h后，撤去培養(yǎng)基，并用10 μL的無菌槍頭在每個孔的中央垂直劃入一條直線，劃完后用PBS洗2次，盡量將細胞碎片洗干凈，每孔加入2 mL用含5% FBS的完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的藥物，于給藥0 h時置于顯微鏡下拍照，后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出，于倒置顯微鏡下拍照。

1.6 Transwell垂直遷移實驗 將B16F10、A375細胞用不含EDTA的胰酶進行消化(之前用無血清的培養(yǎng)基饑餓過夜)，并用無血清的RPMI 1640進行重懸，調整密度為1×109·L-1，備用。取出Transwell小室，在上室中加入無血清的細胞懸液100 μL，并加入100 nmol·L-1的PAF及不同濃度的DATS，設空白對照組；在下室中加入含有20%的FBS的完全培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽小心擦去上室沒有遷移的細胞，用95%的乙醇固定30 min，用結晶紫進行染色，置于超凈臺風干，于200倍的倒置顯微鏡下拍照穿膜細胞，隨機選5個視野，計算平均數(shù)。

1.7 Western blot實驗 常規(guī)培養(yǎng)B16F10細胞，消化后離心，接種細胞于10 cm培養(yǎng)皿中(接種細胞密度為106個/皿)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，待細胞貼壁后換液，用PBS洗滌3次，加入100 nmol·L-1的PAF及含DATS 1、5、10、25 μmol·L-1的RPMI 1640完全培養(yǎng)基作用細胞24 h。用體積比為100 ∶1的RIPA細胞裂解液裂解后，提取蛋白樣品，-80 ℃凍存12 h，13 000×g、4 ℃離心，上清液則為蛋白樣品。蛋白濃度測定采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)測定法。100 ℃水浴使蛋白樣品變性10 min。SDS-PAGE分離蛋白，根據(jù)目的蛋白的相對分子質量配制相應的分離膠濃度(8%和10%)。分離蛋白采用橫流電泳，恒壓進行分離蛋白轉膜。5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h后，分別加入一抗、二抗及GAPDH多克隆抗體(內參)(稀釋倍數(shù)參見各抗體的操作說明書)，一抗孵育4 ℃過夜。TBST洗膜5次，每次10 min；依據(jù)一抗的種屬選擇相應的二抗(羊抗兔或羊抗鼠IgG，用含5% BSA的封閉液稀釋二抗，體積稀釋比例為1 ∶10 000)室溫反應2 h。采用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocTMXRS+)及 Image Lab 4.1軟件檢測目的蛋白的表達情況[11]。

1.8 體內移植瘤實驗 體外培養(yǎng)B16F10細胞，并將細胞消化，PBS混懸，制成細胞懸液，調整細胞濃度，每只小鼠尾靜脈注射200 μL細胞懸液。100 nmol·L-1PAF尾靜脈注射給予，DATS灌胃給予，21 d后處死小鼠，取出肺臟進行分析。

2 結果

2.1 DATS對鼠黑色素瘤B16F10和人黑色素瘤細胞A375生長數(shù)目的影響 MTT檢測結果顯示(Fig 1A)，DATS作用24 h后，可以劑量依賴性地抑制B16F10和A375黑色素瘤細胞的增殖。與相同時間內的對照組比較，當DATS劑量達到50 μmol·L-1時有明顯差異(P<0.01)。同時，DATS濃度達50、100 μmol·L-1時，B16F10細胞的相對生長率分別降至73.21%、48.78%。而對于A375細胞的增殖，DATS展現(xiàn)出了更好的抑制作用。DATS對B16F10細胞及A375細胞的IC50分別為76.54、21.61 μmol·L-1。見Fig 1B。

2.2 DATS對黑色素瘤細胞運動遷移的影響

2.2.1 DATS對PAF誘導的黑色素瘤B16F10細胞水平遷移的影響(劃痕愈合實驗) 觀察不同濃度的DATS作用不同時間點對PAF(100 nmol·L-1)誘導的黑色素瘤B16F10(Fig 2A)和A375(Fig 2B)細胞劃痕愈合能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，PAF(100 nmol·L-1)刺激24 h后，能夠有效誘導細胞遷移，而給予DATS后，隨著DATS濃度的提高，細胞劃痕的愈合程度呈遞減趨勢。Fig 2結果以0 h和24 h兩個時間點為例，呈現(xiàn)對照組和DATS作用不同時間點黑色素瘤細胞的劃痕愈合情況，發(fā)現(xiàn)24 h時，對照組劃痕區(qū)域的黑色素瘤細胞發(fā)生明顯遷移，而隨著DATS給藥濃度的增加，劃痕區(qū)域細胞遷移的數(shù)目呈降低趨勢。

Fig 1 Effect of DATS on the proliferation of melanoma cells

A:Effect of different concentrations of DATS on B16F10 and A375 melanoma cell growth number; B: Effect of DATS on B16F10 and A375 melanoma cell relative proliferation.**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of different concentrations of DATS on PAF-induced migration of B16F10 (A) and A375 (B) cells

2.2.2 DATS對PAF誘導的黑色素瘤細胞垂直遷移的影響(Transwell小室實驗) 不同濃度DATS對PAF誘導的B16F10(Fig 3A)和A375(Fig 3B)黑色素瘤細胞Transwell小室遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，隨著 DATS濃度的提高，細胞侵襲能力呈遞減趨勢。100×顯微鏡觀察B16F10和A375細胞遷移情況，由Fig 3可見對照組細胞遷移數(shù)目較多， DATS各濃度組處理24 h后，細胞遷移數(shù)目與對照組比較呈降低趨勢。

2.3 DATS對PAF介導的黑色素瘤B16F10細胞相關蛋白的影響 因為觀察到了DATS能夠有效地抑制100 nmol·L-1的PAF誘導的黑色素瘤細胞的遷移和運動，而研究顯示，DATS能抑制NF-κB及VEGF蛋白的表達[12]，同時研究發(fā)現(xiàn)PAF誘導黑色素瘤的轉移可能通過增加了基質金屬蛋白酶、激活MAPK信號傳導等方式增強了黑色素瘤的轉移。因此，我們考察了DATS對PAF介導的黑色素瘤細胞MMP-2的表達，ERK、p38等相關轉移蛋白的影響。結果顯示，100 nmol·L-1的PAF能夠激活MMP-2、樁蛋白、FAK；而DATS能夠劑量依賴性的降低這些蛋白的表達。見Fig 4。

2.4 DATS對PAF介導的B16F10黑色素瘤體內實驗性轉移的影響 為了考察DATS對PAF誘導的B16F10黑色素瘤體內轉移情況，我們構建了黑色素瘤實驗性轉移模型。通過尾靜脈注射B16F10細胞，同時給予PAF和25、50 mg·kg-1的DATS，21 d后小鼠處死，取出肺臟，進行拍照及稱量肺重。Fig 5結果顯示，100 nmol·L-1的PAF能夠促進B16F10的轉移，而灌胃給予50 mg·kg-1的DATS能有效減少肺轉移結節(jié)，并降低肺重。

Fig 3 Effect of different concentrations of DATS on PAF-induced vertical migration of B16F10 (A) and A375 (B) cells

Fig 4 Effects of DATS on the expression of metastasis-related proteins MMP-2(A), Paxillin (B), FAK, Akt (C) and ERK, p38, JNK (D)

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the internal control.*P<0.05,**P< 0.01vsPAF 100 nmol· L-1alone

A:The lung size; B: The lung weight.#P<0.05vscontrol;**P< 0.01vsPAF 100 nmol· L-1group

3 討論

腫瘤轉移是惡性腫瘤最明顯的生物學特性之一。具有浸潤性的腫瘤，不僅可以在原發(fā)部位生長和蔓延，還能夠通過各種途徑擴散到身體其他部位，稱之為腫瘤轉移，是臨床腫瘤病人的主要死因。腫瘤細胞的遷移和侵襲是貫穿了腫瘤轉移整個過程的關鍵步驟。而黑色素瘤在發(fā)病早期轉移率高，致死性強[13]。在微環(huán)境中，有很多促進腫瘤轉移的因子，主要來源于機體宿主細胞如血小板、內皮細胞等等。其中，PAF能夠內源性地激活血小板，使得血小板活化。目前，對PAF的研究發(fā)現(xiàn)，PAF在炎癥、心腦血管疾病、腫瘤中起著很重要的作用[14]。本文將PAF作為誘導劑，選取皮膚癌為研究對象，因眾多文獻報道PAF能夠誘導皮膚癌、黑色素瘤的轉移。PAF發(fā)揮其作用主要通過與其受體PAFR結合，激活了下游的信號傳導，活化多種核轉錄因子如NF-κB、CREB等，從而調控了腫瘤細胞的惡性生物學行為。我們的研究發(fā)現(xiàn)100 nmol·L-1PAF能夠促進腫瘤細胞的遷移、運動能力，而動物實驗也表明給予PAF之后，小鼠B10F10黑色素瘤實驗性轉移模型中肺轉移灶明顯高于不給予PAF組。因此，研究PAF介導的腫瘤轉移能夠探尋有效的治療轉移的藥物。

目前尚無有效的治療腫瘤轉移的藥物，研究表明，具有藥食同源的食材藥物大蒜是最有潛力的抗癌藥物，其是百合科的蔥屬植物的鱗莖，大蒜的有機硫化物是大蒜中活性成分。臨床上廣泛用于治療深部真菌、霉菌感染[15]，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅具有抗炎、抗病毒、心血管保護等多種生物學功能，而且能夠抗腫瘤。DATS 是目前發(fā)現(xiàn)的大蒜素中活性最強、也是研究最熱的成分，化學名為三硫化二丙烯(二烯丙基三硫)，分子質量是178.33。前期的研究發(fā)現(xiàn)，DATS對多種腫瘤包括乳腺癌、皮膚癌等具有抑制作用，但是，其具體的機制尚不明確[16]。B16黑色素瘤細胞是1954年在C57BL/6小鼠耳根皮膚上發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性黑色素瘤，B16F10實驗性轉移模型是目前較常用的轉移實驗模型。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DATS濃度達50、100 μmol·L-1時，可以明顯抑制B16F10細胞的生長。同時，DATS對PAF誘導的黑色素瘤B16F10細胞的水平遷移和垂直遷移也有明顯的抑制作用。

細胞外基質的降解，可以降低細胞與細胞之間的黏連，促進腫瘤的遷移。其中，發(fā)揮關鍵作用的是MMP-2及MMP-9等蛋白。研究顯示，MMP-2等的蛋白表達增加，可以促進乳腺癌等多種腫瘤的轉移[17]。本文通過劃痕實驗及Transwell實驗初步證明了DATS是可以抑制PAF誘導的黑色素瘤細胞B16F10、A375的遷移，這是否與 MMP-2等蛋白的表達有關呢？有研究報道指出，PAF誘導黑色素瘤的轉移可能通過增加基質金屬蛋白酶、激活MAPK信號傳導等方式，增強了黑色素瘤的轉移。因此，我們進一步研究了DATS對PAF介導的黑色素瘤細胞MMP-2的表達，ERK、p38等相關轉移蛋白的影響。Western blot 結果表明，DATS抑制PAF誘導的B16F10細胞的遷移可能與MMP-2、樁蛋白、FAK等蛋白的降低有關。DATS能夠劑量依賴性地降低這些蛋白的表達，其機制有待于我們進一步研究。

(致謝：本實驗在南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室完成，感謝實驗參與者對實驗的幫助指導！)

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Experimental research of inhibitory effects of garlic active ingredients DATS on PAF-mediated melanoma metastasis

SHEN Ying1, LIU Yu-ping1,WANG Xu1, SHEN Pei-liang1,ZHU Ping-ting1, CHEN Wen-xing1,2, WANG Ai-yun1,2, LU Yin1,2

(1.JiangsuKeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicinePreventionandTreatmentofTumor，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Aim To discuss the impact of important active ingredient of garlic diallyl sulfide——DATS on platelet activating factor(PAF) mediated melanoma metastasis and its mechanisms.Methods ① MTT was used to test the effect of different concentrations of DATS on B16F10 and A375 melanoma cell growth number;② Scratch test and transwell were employed to test the effect of different concentrations of DATS on B16F10 and A375 melanoma cell migration;③ Western blot was used to test the effect of DATS on expression of MMP-2,ERK,p38 induced by PFA;④ Intravenous injection of tumor metastasis model was used to check the inhibition of DATS in PAF-mediated melanoma metastasis.Results B16F10 cells relative growth rate fell to 73.21% and 48.78%, respectively, when DATS concentration reached 50 and 100 μmol·L-1.DATS inhibited the levels of PAF-induced migration of melanoma cells B16F10 and vertical migration significantly, and inhibited B16F10 cells migration induced by PAF through inhibiting the expression of MMP-2, paxillin protein, FAK and other proteins.Conclusion DATS can significantly inhibit PAF-induced tumor metastasis, which is related to the inactivation of MAPKs.

allicin; melanoma; tumor metastasis; DATS；PAF；MAPK

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.016.html

2016-07-18,

2016-09-19

國家自然科學基金資助項目(No 81403260，81573859)；中國博士后科學基金(No 2014M551639)；江蘇省自然科學基金資助項目(No 1401138C);2013年江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊計劃[蘇教科(2013)10號文];江蘇高校品牌專業(yè)建設工程資助項目(No PPZY2015A070); 江蘇高校中藥學優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)[蘇政辦發(fā)(2014)37號文]

沈 穎(1992-)，女，碩士生，研究方向：活血化瘀中藥對腫瘤轉移的影響，E-mail：1004824062@qq.com； 陸 茵(1963-)，女，教授，博士生導師，研究方向：活血化瘀中藥對腫瘤轉移的影響，通訊作者，E-mail：luyingreen@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.008

A

1001-1978(2016)12-1670-07

R-332；R284.1；R329.24；R341；R73-37；R739.502.2