狗肝菜多糖通過(guò)抗炎抗氧化抑制酒精高糖高脂引起的大鼠肝損傷

高 雅，張可蘭，鐘明利，曹后康，黃思茂，張可鋒

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所，廣西 桂林 541004；2.甘肅省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，甘肅 蘭州 730050)

狗肝菜多糖通過(guò)抗炎抗氧化抑制酒精高糖高脂引起的大鼠肝損傷

高 雅1，張可蘭2，鐘明利1，曹后康1，黃思茂1，張可鋒1

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所，廣西 桂林 541004；2.甘肅省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，甘肅 蘭州 730050)

目的 基于抗炎、抗氧化研究狗肝菜多糖(Diclipterachinensispolysaccharide，DCP)對(duì)大鼠酒精性脂肪肝(AFLD)的作用及機(jī)制。方法 將60只大鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、水飛薊賓組及DCP高、中、低劑量組。正常組喂普通飼料，其余各組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，并每天從5%酒精開(kāi)始以5 mL·kg-1灌胃，濃度每周遞增5%，于第7周末造成大鼠AFLD模型；繼續(xù)35%酒精和高糖高脂飼料處理，受試藥物干預(yù)5周后，取血和收集肝組織。檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白-膽--------------------

狗肝菜多糖；酒精性脂肪肝；自由基損傷；炎癥；TGF-β1；NF-κB

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指由于長(zhǎng)期攝入過(guò)量酒精而導(dǎo)致的肝臟損害病變。慢性嗜酒者約有60%導(dǎo)致AFLD，其中30%可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化[1]。在肝臟疾病中，AFLD死亡率僅次于肝癌，居第2位，并且酒精性肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[2-3]。因此，對(duì)AFLD 及其臨床藥物的研發(fā)工作具有十分重要的意義。

藥材狗肝菜是爵床科華九頭獅子草屬狗肝菜Diclipterachinensis(L.)Nees.的全草，其化學(xué)成分主要為多糖、有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)[4]。近年來(lái)，本課題組已證實(shí)狗肝菜多糖(Diclipterachinensispolysaccharide，DCP)對(duì)化學(xué)性肝損傷、肝纖維化呈現(xiàn)出良好的保護(hù)作用[5-6]。但檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)DCP抗AFLD的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用灌胃酒精聯(lián)合喂養(yǎng)高脂飼料的方法建立大鼠AFLD模型，并經(jīng)DCP干預(yù)，擬從抗炎、抗氧化方面探討DCP對(duì)AFLD的藥效及機(jī)制，為DCP的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量180 g～220 g，♀♂各半，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK2007-0001)。

1.2 藥品與試劑 DCP制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。ALT、AST、AKP、MDA、SOD、GSH試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；TG、TC、LDL-C、HDL-C試劑盒購(gòu)于北京北華康泰臨床試劑有限公司；TNF-α、IL-6試劑盒購(gòu)于Elabscience公司；TGF-β1購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；NF-κB抗體購(gòu)于A(yíng)bcam公司；水飛薊賓膠囊為天津天士力制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20140224；紅星牌二鍋頭白酒，北京釀酒總廠(chǎng)出品，酒精度55%。

1.3 儀器 TGL-16K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)廠(chǎng)； AU600全自動(dòng)生化檢測(cè)儀，奧林巴斯生產(chǎn)；Olympus BX51顯微鏡，奧林巴斯生產(chǎn)；BS1105電子天平、AUW220D電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Tanon電泳儀，上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 將60只大鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、水飛薊賓組(100 mg·kg-1)及DCP高、中、低劑量組(300、200、100 mg·kg-1)。正常組喂普通飼料，其余各組以高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料68.8%、10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、膽固醇1%、膽鹽0.2%)喂養(yǎng)，并每天從5%酒精開(kāi)始以5 mL·kg-1灌胃，濃度每周遞增5%，于第7周末造成大鼠AFLD模型；繼續(xù)35%酒精和高糖高脂飼料處理，并受試藥物干預(yù)5周后，眼球取血和收集肝組織[8]。

2.2 指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)于第12周末結(jié)束，禁食、不禁水18 h后，眼球取血和收集肝組織。參照試劑盒的說(shuō)明，生物化學(xué)法檢測(cè)血清中ALT、AST、AKP、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平；測(cè)定肝組織中MDA、SOD、GSH水平或活性； ELISA法檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-6和TGF-β1含量；Western blot法檢測(cè)肝組織NF-κB蛋白表達(dá)情況[9-10]。

2.3 肝臟病理學(xué)檢查 取大鼠肝左葉，固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 DCP對(duì)AFLD大鼠血清中ALT、AST和AKP水平的影響 由Tab 1結(jié)果可見(jiàn)，模型組與正常組相比較，ALT、AST和AKP差異有顯著性(P<0.01)；與模型組比較，水飛薊賓和DCP均能明顯抑制ALT、AST和AKP活性(P<0.01，P<0.05)，且成量效關(guān)系。因此，可判斷DCP對(duì)受損的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

GroupDose/mg·kg-1ALT/U·L-1AST/U·L-1AKP/U·L-1Normal- 40±5 49±4 50±6Model-198±12**221±15**123±13**Silybin100 80±8##110±12## 69±7##DCP300 73±6##108±10## 71±7##200 83±8##123±11# 78±8##100124±10#136±14#87±9#

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.2 DCP對(duì)AFLD大鼠血清中LDL-C、HDL-C、TG 和TC的影響 模型對(duì)照組TG、TC和LDL-C含量升高，HDL-C 水平降低(P<0.01)，水飛薊賓對(duì)TC含量無(wú)明顯影響(P>0.05)；DCP能明顯提高模型鼠HDL-C 含量, 降低TG、TC、LDL-C 含量(P<0.05或0.01)，可判斷DCP對(duì)AFLD大鼠的血清血脂具有明顯的調(diào)節(jié)作用，見(jiàn)Tab 2。

3.3 DCP對(duì)AFLD大鼠肝組織中MDA、GSH和SOD的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝中MDA含量明顯升高，SOD活性降低且GSH含量減少(P<0.01)；DCP能明顯降低AFLD大鼠肝組織中的MDA含量，提高SOD活性及GSH含量(P<0.05或0.01)，表明DCP具有良好的抗氧化能力，見(jiàn)Tab 3。

3.4 DCP對(duì)AFLD大鼠TNF-α、IL-6和TGF-β1水平的影響 Tab 4中 ELISA結(jié)果表明，與正常組 比較，模型組肝組織中TNF-α、IL-6和TGF-β1水平明顯增加(P<0.01)。經(jīng)受試藥物治療后，各組肝組織中TNF-α、IL-6和TGF-β1的水平逐漸減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，表明DCP可通過(guò)抑制肝組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)保肝作用。

GroupDose/mg·kg-1LDL-C/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1TG/mmol·L-1TC/mmol·L-1Normal-0.36±0.041.31±0.120.31±0.042.67±0.23Model-0.77±0.08**0.76±0.07**0.57±0.06**3.89±0.30**Silybin1000.57±0.05##0.91±0.08##0.41±0.05##3.51±0.19DCP3000.52±0.05##1.01±0.10##0.39±0.03##2.99±0.23##2000.55±0.07##0.95±0.07##0.41±0.03##3.20±0.19##1000.56±0.08##0.88±0.06#0.44±0.05#3.48±0.32#

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effects of DCP on MDA，GSH

GroupDose/mg·kg-1MDA/nmol·g-1ProGSH/mg·g-1ProSOD/IU·g-1ProNormal-1.89±0.142.25±0.122.12±0.17Model-4.65±0.37**1.01±0.09**1.30±0.14**Silybin1003.31±0.21##1.37±0.13#1.75±0.19#DCP3002.99±0.31##1.59±0.18##1.85±0.19##2003.28±0.28##1.42±0.14##1.74±0.15#1003.69±0.38#1.33±0.11#1.71±0.09#

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 4 Effects of DCP on TNF-α，IL-6 and TGF-β1

GroupDose/mg·kg-1TNF-α/ng·g-1IL-6/ng·g-1TGF-β1/ng·g-1Normal-18.99±2.3423.89±4.3110.20±1.12Model-67.52±6.98**68.39±6.37**30.27±2.87**Silybin10047.61±5.66##55.38±5.92##15.57±1.88##DCP30041.30±4.81##50.27±6.33##14.37±1.15##20044.39±4.60##54.99±5.12##16.38±1.88##10049.86±5.87#58.31±5.45#19.91±2.51#

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.5 DCP對(duì)AFLD大鼠肝臟組織中NF-κB 蛋白表達(dá)的影響 由Fig 1數(shù)據(jù)可見(jiàn)，DCP能明顯下調(diào)NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.01)。提示DCP對(duì)AFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)NF-κB蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

3.6 肝組織病理學(xué)變化 經(jīng)HE染色，在光鏡下觀(guān)察，正常大鼠肝細(xì)胞均勻整齊，胞質(zhì)豐富，未見(jiàn)脂肪病變，匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索和肝竇均清晰可辨。模型組肝組織肝細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)明顯脂肪變性，出現(xiàn)不同程度的水腫，中央靜脈出現(xiàn)明顯點(diǎn)灶狀壞死和淤血現(xiàn)象。 而經(jīng)受試藥物DCP和水飛薊賓干預(yù)后，與模型組比較，炎癥反應(yīng)明顯減輕，細(xì)胞索狀排列較整齊，肝內(nèi)淤血和點(diǎn)灶狀壞死明顯減少，肝細(xì)胞數(shù)量增加，脂肪變性細(xì)胞減少。HE組織病理學(xué)檢查提示DCP能夠有效改善AFLD大鼠的肝組織的病變，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 Effect of DCP on expression of

A:Normal group；B:Model group；C: Silybin group(100 mg·kg-1)；D: DCP(300 mg·kg-1) group；E: DCP(200 mg·kg-1) group；F: DCP(100 mg·kg-1) group.**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

4 討論

酒精性肝損傷的代謝產(chǎn)物引發(fā)的肝臟氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，表現(xiàn)為SOD活性降低、MDA過(guò)量產(chǎn)生、GSH系統(tǒng)功能紊亂和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞增多等[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)DCP干預(yù)后，MDA、SOD和GSH生化指標(biāo)明顯改善，提示DCP對(duì)大鼠AFLD保護(hù)作用與其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、清除自由基的作用相關(guān)，具有較好的抗氧化應(yīng)激作用。此外，DCP能降低大鼠AFLD血脂，減少脂肪在肝臟的沉積，抑制脂肪肝的形成。同時(shí)，DCP能下調(diào)AFLD大鼠TGF-β1的表達(dá)，體現(xiàn)其有助于抑制肝細(xì)胞凋亡和肝星狀細(xì)胞的激活，從而延緩或阻止向肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

Fig 2 Effect of DCP on hepatic histopathology in rats with NAFLD(HE×200)

A:Normal group；B: Model group；C: Silybin group(100 mg·kg-1)；D: DCP(300 mg·kg-1) group；E: DCP(200 mg·kg-1) group；F:DCP(100 mg·kg-1) group

NF-κB是多種炎癥介質(zhì)的上游信號(hào)分子，可促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，處于炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[13]。NF-κB通過(guò)調(diào)控各種急性反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，直接參與肝臟的急、慢性炎癥[14]。NF-κB激活后可刺激TNF-α、IL-1等的產(chǎn)生，而這些物質(zhì)又作為激動(dòng)劑進(jìn)一步作用于NF-κB，形成NF-κB活化的正反饋[15]。TNF-α作為引起急、慢性肝損傷的重要因子之一，可直接或間接引起肝細(xì)胞的免疫損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)TNF-α本身、IL-1、IL-6和IL-8等細(xì)胞炎癥因子的持續(xù)大量分泌，加重肝臟損傷[16-17]。氧化應(yīng)激在NF-κB的活化過(guò)程中也起著重要的作用，機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，便通過(guò)一個(gè)或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而活化NF-κB[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組NF-κB蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6水平明顯高于正常組，經(jīng)DCP干預(yù)后，NF-κB蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6水平明顯降低，提示DCP對(duì)大鼠AFLD的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，阻止炎癥反應(yīng)。此外，DCP是否直接抑制NF-κB活性或通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少NF-κB的產(chǎn)生，其交互關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所和廣西自治區(qū)生藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的，感謝實(shí)驗(yàn)室全體老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的大力支持和幫助。)

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Effects of DCP on alcoholic fatty liver disease in rats via anti-inflammation and antioxidation

GAO Ya1, ZHANG Ke-lan2,ZHONG Ming-li1,CAO Hou-kang1,HUANG Si-mao1,ZHANG Ke-feng1

(1.InstituteofMedicine,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004,China；2.IntensiveCareUnit,GansuProvincialHospitalofTCM,Lanzhou730050,China)

Aim To study the effects ofDiclipterachinensispolysaccharide(DCP) on alcoholic fatty liver disease(AFLD)in rats based on anti-inflammation and antioxidation.Methods 60 rats were randomly divided into six groups: control group, model group，silybin group and DCP of high,medium and low dose groups. The control group was fed with normal diet, other groups were fed with high sugar and high fat diet, and given 5% alcohol 5 mL·kg-1by gavage. The alcohol consistency increased 5% every week until AFLD models in rats were made after 7 weeks. Except control group, other groups were fed with high sugar and high fat diet, and given 35% alcohol 5 mL·kg-1and DCP. All rats were killed after five weeks, and blood and liver tissues were collected. The activity of alanine aminotransaminase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), alkaline phosphatase(AKP), triglyceride(TG), total cholesterol(TC), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C) in serum were detected by using biochemical method. The contents of malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD)，reduced glutathione(GSH) in liver tissues were detected. The contents of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6)and transforming growth factor-β1(TGF-β1) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) in liver tissues. The liver tissues were obtained and histologic analysis was done through HE.Results DCP reduced the activity or content of ALT, AST, AKP, TG, TC, LDL-C, HDL-C, TNF-α，IL-6，TGF-β1 in serum and liver tissues of rats(P<0.05), and increased the activity or content of HDL-C,SOD and GSH(P<0.05). DCP could remarkably inhibit the NF-κB expression in liver tissues(P<0.01). The pathological examination indicated that DCP could obviously alleviate the inflammation and fat denaturation of the liver cells.Conclusion DCP can inhibit the development of AFLD.The mechanism may be related to antioxidation, free radical scavenging, inhibition of lipidperoxidation, anti-inflammation, and inhibition of the TGF-β1 and NF-κB expression.

Diclipterachinensispolysaccharide(DCP); alcoholic fatty liver disease(AFLD); free radical injury; inflammation; TGF-β1; NF-κB

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.007

A

1001-1978(2016)12-1665-05

R-332；R284.1；R322.47；R392.12；R575.502.2

2016-07-18,

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81360685);廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(No 桂科攻14124004-2-13);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2013GXNFBA019179,2014GXNSFBA118149); 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥科技專(zhuān)項(xiàng)(No GZBZ16- 15)

高 雅(1985-)，女，碩士，講師，研究方向：生藥質(zhì)量及藥效，E-mail:svidy@163.com； 張可鋒(1982-)，男，碩士，副教授，研究方向：肝病藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:xueshengcailiao@163.com

固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平；測(cè)定肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肝組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)含量；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝組織NF-κB蛋白表達(dá)情況；HE染色進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 DCP可抑制或降低AFLD大鼠血清或組織中ALT、AST、AKP、TG、TC、LDL-C、MDA、TNF-α、IL-6、TGF-β1的活性或含量(P<0.05)，升高HDL-C、SOD和GSH的活性或含量(P<0.05 )；明顯抑制肝臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.01)；病理檢查顯示，DCP可使肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥反應(yīng)得到明顯改善。結(jié)論 DCP可抑制大鼠AFLD形成, 其作用機(jī)制可能與抗氧化，清除自由基代謝產(chǎn)物，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抗炎及抑制TGF-β1、NF-κB的表達(dá)有關(guān)。