轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因玉米株系的獲得及其抗旱性研究

張彥琴，董春林，楊麗莉，梁改梅，李潔，楊睿，常建忠，趙巧紅，張明義

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因玉米株系的獲得及其抗旱性研究

張彥琴，董春林，楊麗莉，梁改梅，李潔，楊睿，常建忠，趙巧紅，張明義

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌發(fā)種子轉(zhuǎn)化方法，將海藻糖合酶基因（TPS）導(dǎo)入玉米自交系昌7-2中。PCR和Southern blot檢測結(jié)果表明，目的基因已導(dǎo)入轉(zhuǎn)化植株并整合到受體基因組上。田間抗旱性鑒定和生理生化指標結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株（株系）的抗旱性明顯高于對照。說明海藻糖合酶基因具有抗旱功能，利用植物基因工程技術(shù)對其進行玉米抗旱育種是切實可行的。

玉米；海藻糖合酶基因；抗旱性；遺傳轉(zhuǎn)化

干旱是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因子之一，其不僅會影響植物的正常生長發(fā)育，造成農(nóng)作物減產(chǎn)，而且還會使生態(tài)環(huán)境日益惡化[1]。創(chuàng)制作物抗旱新種質(zhì)，培育抗旱、耐旱新品種，是當(dāng)前作物品種改良中的一個重要研究方向。在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物抗旱性研究方面，有許多成功的報道。Kavi等[2]將P5CS基因?qū)霟煵?，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量是對照的11～19倍，間接證明轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性有了提高。楊東歌等[3]利用基因槍轟擊法將擬南芥脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF4基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并證明轉(zhuǎn)化株的抗旱能力得到增強。海藻糖是植物抵御各種脅迫環(huán)境的保護劑[4]，廣泛存在于酵母、藻類和一些低等維管植物中，最高含量可達10%以上[5]。海藻糖的作用機理是高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境下，在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程的生物特征，以至于使生物體表現(xiàn)出較強的抗旱、抗寒能力[6]。因此，許多生物育種學(xué)家嘗試利用海藻糖合酶基因培育抗逆性植物?，F(xiàn)已有報道，將合成海藻糖的基因轉(zhuǎn)入煙草[7]、馬鈴薯[8]等植物中，增強了植物的抗旱性和抗寒性。

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法，將海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)化到玉米優(yōu)良自交系昌7-2中，以期獲得抗旱性顯著提高的轉(zhuǎn)基因種質(zhì)材料。

1 材料和方法

1.1 植物材料和待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化受體材料為昌7-2玉米自交系，為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心保存材料。

轉(zhuǎn)化供體質(zhì)粒是p3UbiTPS，目的基因為TPS，植物篩選標記為bar基因，均由玉米Ubiquitin基因啟動子驅(qū)動。農(nóng)桿菌菌株為EHA101，由北京大學(xué)生命科學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取各代植株于5葉期取樣約200mg，在液氮中迅速冷凍，并于-40℃保存。之后按王關(guān)林等[9]的方法提取植物總DNA；質(zhì)粒DNA的提取采用堿性裂解法[10]，純化用PCR Fragment Recovery Kit進行。

1.2.2 轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌發(fā)種子轉(zhuǎn)化方法[11]，即取玉米優(yōu)良自交系昌7-2的飽滿種子，室溫下吸水膨脹8～12 h，吸脹種子于超凈工作臺上用解剖刀劃胚至胚輕微致傷，致傷種子與事先培養(yǎng)好的帶質(zhì)粒菌株（菌液OD600為0.3～0.7，菌液加入濃度為5%；培養(yǎng)液中附加200 μmol/L乙酰丁香酮）共培養(yǎng)24～48 h，以種子露白為培養(yǎng)終止點。露白種子播種于苗床上，并用除草劑Basta溶液（PPT有效成分0.15%）澆灌，以便進行初步標記基因（bar基因）篩選。初篩成活苗于3～4葉期移栽到大田，于5葉期取樣進行分子檢測，田間植株自交授粉收獲種子。

1.2.3 分子檢測PCR檢測：TPS基因的PCR擴增引物序列由Prime Primer V5軟件設(shè)計，由太原市來寶生物工程技術(shù)有限公司合成。上游引物序列：5′-GGATCAGGTGAGGAAGGACTTGC-3′，下游引物序列：5′-TCTTCCACATCTCCACGACTTGG-3′，擴增片段長度1.6 kp。擴增體系20 μL，取植物DNA150 ng，擴增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離，并于SYN成像系統(tǒng)觀察照相。

Southern blot檢測：取轉(zhuǎn)化植株DNA（15 μg）、對照植株DNA（15 μg）和質(zhì)粒DNA配制酶切體系。用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切緩沖液Buffer加20 μL（上海生工），反應(yīng)體系50 μL，加入限制性內(nèi)切酶各15 μL，輕微離心后于37℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后進行DNA變性、轉(zhuǎn)移到尼龍膜上、固定、雜交。分析用DIG DNA Labling and Detection Kit和CSPD熒光染色盒（購自Roche公司）。TPS基因雜交探針制備按試劑說明書進行，雜交染色后用放射自顯影曝光。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性鑒定將2個T3轉(zhuǎn)化株系（9001，9004）和對照種子分別種植在直徑為25 cm的花盆中，每個株系種12盆，各分4組進行干旱脅迫處理，設(shè)3次重復(fù)。出苗后每盆留苗6株，生長至5葉期進行脅迫處理：第1組為正常管理，每天灌水50 mL；第2組為不灌水干旱脅迫；第3組為鹽脅迫，用NaCl 60 mL溶液澆灌植株，濃度從50 mmol/L開始，每天提高50 mmol/L，處理第10天濃度至500 mmol/L；第4組為PEG模擬干旱脅迫，連續(xù)10 d用15%PEG溶液50 mL澆灌。

抗旱和耐鹽性鑒定：分別測定上述盆栽苗在脅迫處理前和處理13 d后的株高，得出脅迫處理期間株高增長數(shù)據(jù)，用株高增長百分率表示植株抗脅迫生長情況。

1.3 測定項目及方法

葉片脯氨酸含量測定：取經(jīng)水分干旱脅迫處理13 d后的植株葉片（第5葉中部），采用磺基水楊酸法[12]測定葉片中游離脯氨酸含量。

葉綠素含量測定：參照彭運生等[13]方法，取經(jīng)PEG模擬干旱脅迫處理15 d后的植株第5片葉中部，用0.000 1 g天平精確稱取鮮質(zhì)量（W），剪碎，置于20 mL試管中，采用丙酮、無水乙醇（2∶1）混合液浸提，每個樣品加18 mL混合液，在黑暗條件下浸提24 h。倒取提取液于721型分光光度計中，分別在波長663，645 nm下讀取其OD值，按以下公式計算葉綠素a（Ca）和葉綠素b（Cb）的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化植株的獲得

劃玉米幼胚約6 000粒，經(jīng)Basta溶液（0.2%）初步篩選得到擬似轉(zhuǎn)化植株734株，這些植株在8～9葉期取樣經(jīng)PCR檢測有293株為標記基因陽性株，通過嚴格自交授粉，收獲種子播種出苗為T2株系材料，對這些材料5葉期取樣進行分子檢測。播種的T2為從T1分子檢測陽性結(jié)果材料中挑選的10個抗旱性較好的株系；T3為從T2挑選的6個轉(zhuǎn)化純合株系材料，同樣都于5葉期取樣進行分子檢測。

2.2 分子檢測結(jié)果

2.2.1 PCR檢測結(jié)果對已轉(zhuǎn)化植株、陰性對照植株和質(zhì)粒提取的DNA均進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)T1的PCR擴增陽性結(jié)果率約為45%，T2提高到76%～86%，T3達到96%。表明轉(zhuǎn)基因材料在逐代純化，遺傳分離逐代減少。各代材料的PCR擴增結(jié)果列于表1。

表1 轉(zhuǎn)化植株的PCR和Southern blot雜交檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)化植株擴增產(chǎn)物的電泳分離條帶與陽性對照一致，所有陰性對照皆表現(xiàn)為PCR陰性結(jié)果，證明PCR擴增方法正確，結(jié)果可靠。圖1是部分T3材料的PCR擴增產(chǎn)物電泳分離結(jié)果。

2.2.2 Southern blot雜交分析各代材料的雜交分析結(jié)果列于表1。從表1可以看出，隨著代數(shù)增加，雜交分析的陽性結(jié)果率明顯提高。特別是T3，發(fā)現(xiàn)株系9001和9004已為純合的轉(zhuǎn)基因株系。Southern blot雜交分析結(jié)果同時證明，目的基因已被整合到轉(zhuǎn)化植株的基因組上，而且目的基因可在轉(zhuǎn)化植株中穩(wěn)定遺傳和表達。

圖2是T3部分轉(zhuǎn)化植株的Southern blot雜交分析結(jié)果。一條雜交條帶證明目的基因是以單拷貝單位點方式整合到植物基因組上的。

2.3 轉(zhuǎn)化植株的抗旱性鑒定

2.3.1 轉(zhuǎn)化植株中游離脯氨酸含量的測定脯氨酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的細胞內(nèi)用來保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，其在植物體內(nèi)的含量與植物自身的抗旱性成正比，在植物受到水分脅迫時脯氨酸可大量積累。為了鑒定本研究所獲得轉(zhuǎn)基因株系的抗旱能力，對T1經(jīng)除草劑涂抹表現(xiàn)抗旱性的并且經(jīng)PCR分子檢測陽性的1個轉(zhuǎn)基因株系所獲得的種子（T2）在溫室花盆中種植，通過除草劑涂抹結(jié)合PCR分子檢測的方法篩選到11個陽性植株，這11個陽性植株經(jīng)干旱處理，然后進行了脯氨酸含量的測定。從表2可以看出，5號轉(zhuǎn)基因植株與對照的脯氨酸含量分別為77.82，82.91 μg/g，比較低，其余轉(zhuǎn)基因植株均比對照高，其中，7號與11號植株的脯氨酸含量較高，分別達到196.19，162.28 μg/g，為對照的2.0～2.5倍，測定結(jié)果間接說明，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力高于非轉(zhuǎn)基因植株。

表2 植株中脯氨酸和葉綠素含量測定結(jié)果

2.3.2 轉(zhuǎn)化植株中葉綠素含量的測定葉綠素含量是影響光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。在一定范圍內(nèi)，葉綠素含量與光合作用呈正相關(guān)關(guān)系，葉綠素含量越高，光合作用越強。當(dāng)植物受到干旱脅迫后，葉綠素結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠體膜系統(tǒng)受到了傷害，光合效率降低，抗旱性表現(xiàn)差的株系葉綠素含量就低，反之葉綠素含量高，表明其抗旱性強。由表2可知，干旱處理后，有的轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量遠高于對照，本試驗中7號株系葉綠素含量高達2.327 mg/g，是對照的2倍多，表明部分轉(zhuǎn)基因植株的葉綠體傷害程度輕于非轉(zhuǎn)基因植株，可見，部分轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力增強。

2.3.3 轉(zhuǎn)化植株的抗旱性和耐鹽性鑒定選取6株轉(zhuǎn)基因植株和6株非轉(zhuǎn)化植株進行鹽脅迫和PEG脅迫試驗，記錄植株生長狀況，7葉期時測定植株株高并稱量單株質(zhì)量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米生長勢強于未轉(zhuǎn)基因的對照，株高比對照提高了4～7 cm，單株質(zhì)量均高于對照，增幅為28%～34%；NaCl和PEG脅迫之間差異不明顯（表3）。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米植株的抗旱及耐鹽性測定結(jié)果

3 討論

海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，從而能使轉(zhuǎn)化該合成基因的生物體具有較強的抗旱、抗凍能力[14-15]。在體外，海藻糖同樣具有穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性，它在食品保鮮和防腐方面也有巨大潛力[16-17]。Holmstrom等[18]將酵母海藻糖合酶基因?qū)霟煵?，證明了海藻糖合酶基因在轉(zhuǎn)基因植株中積累并使其抗旱性提高。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌發(fā)種子轉(zhuǎn)化方法，將來自釀酒酵母的海藻糖合酶基因?qū)胗衩撞?-2自交系，獲得了一批再生植株，經(jīng)PCR和Southern blot檢測，海藻糖合酶基因已被整合到玉米昌7-2自交系中；在干旱處理條件下，脯氨酸與葉綠素含量測定結(jié)果均間接表明，部分轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力有所增強；研究結(jié)果證明，海藻糖合酶基因?qū)胗衩字仓旰?，不僅能夠穩(wěn)定表達和遺傳，而且賦予轉(zhuǎn)基因玉米植株抗旱性提高等功能。這為今后的玉米抗旱育種工作提供了一些依據(jù)。

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Study on Transformation of Trehalose Synthase Gene TPS to Maize and Their Drought Resistance

ZHANG Yan-qin，DONG Chun-lin，YANG Li-li，LIANG Gai-mei，LI Jie，YANG Rui，CHANG Jian-zhong，ZHAO Qiao-hong，ZHANG Ming-yi
（Research Center of Arid Farming，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Using Agrobacerium-mediated transformation method of maize germination seed,trehalose synthase gene TPS was transformed to maize inbred Chang 7-2.The putative transgenic plants were verified by PCR amplification and Southern blot hybridization.The results showed that TPS gene had been transformed into maize plants and further integrated into the genome of transgenic plants.The results of drought-resistant investigation in greenhouse confirmed that the drought-resistant transgenic plant was better than non-transformed plants.In brief,developing drought-resistant breeding by gene engineering technique was a practicable way.

maize（Zea mays L.）;trehalose synthase gene（TPS gene）;drought resistance;genetic transformation

S513

A

1002-2481（2016）01-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.01

2015-10-30

山西省自然基金項目（2014011030-2）；山西省財政支農(nóng)項目（015zzcx-23，2014ZYFZ-11）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種工程項目（11yzgc149）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種基礎(chǔ)項目（Yyzgc1317）

張彥琴（1964-），女，山西靈石人，副研究員，主要從事草類輻射育種及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究工作。