超聲波輔助響應面法提取藜麥多酚及抗氧化性研究

陳樹俊，胡潔，王振文，龐震鵬，劉曉娟，徐曉霞，儀鑫，石玥，李樂

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

超聲波輔助響應面法提取藜麥多酚及抗氧化性研究

陳樹俊，胡潔，王振文，龐震鵬，劉曉娟，徐曉霞，儀鑫，石玥，李樂

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

以山西靜樂藜麥為原料，采用超聲波輔助響應曲面法對藜麥多酚提取工藝進行優(yōu)化，并測定其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，以多酚得率為指標，考慮提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度4個單因素的影響，在單因素試驗的基礎上進行響應面實驗優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲波提取藜麥多酚的最佳條件為：提取時間23 min，乙醇體積分數(shù)71%，料液比1∶23（g/mL），提取溫度52℃；在此條件下，多酚提取量為3.33 mg/g。采用超聲波輔助提取藜麥多酚，方法簡便，大大縮短了提取時間，增加了提取效率；同時，藜麥多酚提取液具有很強的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、羥自由基（·OH）清除能力，其半抑制濃度（IC50）分別為1.62，21.27 μg/mL，均強于抗壞血酸；此外，藜麥多酚還具有很強的還原能力且其質(zhì)量濃度與抗氧化活性具有良好的量效關(guān)系。說明藜麥富含多酚并且具有良好的抗氧化能力。

藜麥；多酚；響應面；提??；抗氧化性

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）原產(chǎn)于印第安地區(qū)，為雙子葉植物，由于其豐富的營養(yǎng)價值和獨特的功能特性，被印第安人稱為“糧食之母”[1-2]。藜麥的營養(yǎng)價值在國際上也得到了認可，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）認為，藜麥是唯一一種單體植物，是可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物，正式推薦藜麥為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”[3]。藜麥中含有大量的多酚類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)是植物在生長發(fā)育中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、莖、皮、葉及果實內(nèi)。多酚類物質(zhì)具有清除自由基[4]和抗氧化[5-6]、抗腫瘤[7]以及預防心血管疾病[8]等生理功能。目前，國外對藜麥多酚的研究相對較多[9-11]，著重于藜麥與其他“假谷物”含量及抗氧化性的對比分析，但國內(nèi)對其研究相對較少。

超聲波法經(jīng)常被應用于對生物活性物質(zhì)的提取，此方法相比一般提取方法，提取效率高，能大大縮短提取時間，在提取工藝研究中起到了至關(guān)重要的作用。多酚提取經(jīng)常使用水浴提取法和超聲波法，盧宇等[12]研究表明，水提法提取藜麥，多酚得率為（226.77±1.94）mg/100 g，闕淼琳等[13]通過提取藜麥種子多酚含量以及分析品種間差異得出，品種“PI596293”的多酚含量最高，達2.72mg/g。

本試驗通過單因素試驗和響應面實驗探索一種提取藜麥多酚的最佳工藝條件，并對其抗氧化性進行分析，旨在為藜麥進一步加工利用及深入研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

供試材料藜麥（福林酚）購自山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司。Folin-Ciocalteu、沒食子酸、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器及設備

磨粉機，永康市小寶電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；JA1203N型精密電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；UV-2800型紫外分光光度計，美國尤尼柯儀儀器有限公司；SB5200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；TDL-5型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；HRHS24 Haier電熱恒溫水浴鍋，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理將新鮮藜麥除雜后置于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機打磨10 min，過0.230mm篩網(wǎng)，備用。

1.3.2 藜麥多酚的提取準確稱取藜麥粉1.00 g，置于25 mL具塞試管中，按一定比例加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，在特定溫度下超聲波輔助提取一定時間，提取完畢后，于3 500 r/min下離心15 min，取上清液作為待測液。

1.3.3 多酚含量的測定根據(jù)Folin-Ciocalteu法[12]測定（稍作修改）。精確吸取1.00 mL的樣品液于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻，4～6 min內(nèi)加入1 mL 7%的Na2CO3溶液，充分搖勻后用蒸餾水定容，避光放置1 h，在波長760 nm下測定其吸光度值。以沒食子酸為標準樣品制作標準曲線，得到線性回歸方程為：y＝0.0389x＋0.020 9（R2＝0.997 6）。根據(jù)標準曲線計算多酚得率。

式中，A為樣液多酚含量（μg/mL）；V為樣液體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 超聲提取時間對多酚得率的影響在乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶15（g/mL）、提取溫度60℃的條件下，設置不同提取時間為10，15，20，25，30 min，考察超聲提取時間對多酚得率的影響，以選擇最佳超聲提取時間范圍。

1.3.4.2 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響在超聲提取時間20 min、料液比1∶15（g/mL）、提取溫度60℃的條件下，設置乙醇體積分數(shù)梯度為50%，60%，70%，80%，90%，考察乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響，以選擇最佳乙醇體積分數(shù)范圍。

1.3.4.3 料液比對多酚得率的影響在超聲提取時間20 min、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度60℃的條件下，設置不同料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL），考察料液比對多酚得率的影響，以選擇最佳料液比范圍。

1.3.4.4 超聲提取溫度對多酚得率的影響在超聲提取時間20 min、乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶15（g/mL）的條件下，設置不同超聲提取溫度為30，40，50，60，70℃，考察超聲提取溫度對多酚得率的影響，以選擇最佳超聲提取溫度范圍。

1.3.5 響應面優(yōu)化設計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，依照Box-Behnken中心組合實驗設計原理，選取超聲提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲提取溫度4個因素為試驗因素，以多酚得率為響應值，設計4因素3水平共29個試驗組的響應面實驗，采用Design Expert 8.05軟件進行分析，得到模型回歸方程，以確定藜麥多酚含量的最佳提取工藝參數(shù)。響應面因素水平列于表1。

表1 響應面實驗因素水平

1.3.6 藜麥多酚體外抗氧化活性分析

1.3.6.1 清除DPPH自由基能力測定其參照文獻[15]的方法稍加改進。精確吸取2.00 mL不同濃度的樣品液于10 mL試管中，加入2.00 mL DPPH溶液，搖勻，室溫避光放置30 min后，于517 nm處測定吸光度值?？瞻捉M用蒸餾水替代樣品，每個樣品重復測定3次。

式中，Ai為2 mL DPPH溶液＋2 mL樣品液的吸光度值；Aj為2 mL樣品液＋2 mL無水乙醇的吸光度值；Ac＝2 mLDPPH溶液＋2 mL無水乙醇的吸光度值。

1.3.6.2 清除羥自由基能力測定其采用Fenton反應方法[16]進行。在試管中分別加入不同濃度樣品液各2 mL，然后分別加入2 mL6 mmol/L硫酸亞鐵溶液和2 mL6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，最后加入2 mL6 mmol/L雙氧水進行反應，將反應液置于37℃下水浴30 min，以蒸餾水作參比，在510 nm下測定吸光度值，用抗壞血酸作對照。每個樣品重復測定3次。

式中，A0為不加樣液的吸光度值；Ai為加入不同濃度樣品液的吸光度值。

1.3.6.3 還原能力測定其參考文獻[17]進行。分別吸取不同濃度樣品液2.5 mL，加入0.2 mol/L pH值為6.6的PBS溶液2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻后于50℃條件下水浴20 min，迅速冷卻，立即加入2.5 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，將該混合物于3 000 r/min離心10 min。然后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液混合均勻，反應10 min后，測定700 nm處吸光度值，每個樣品重復測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 6.0，Excel軟件分析數(shù)據(jù)、作圖，數(shù)據(jù)用平均值±SD值表示。采用Design Expert 8.05分析處理響應曲面模型回歸方程及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

由圖1可知，在其他條件一定時，多酚得率隨著超聲提取時間的增加逐漸增加，當達到20 min時，多酚得率達到最大，表明在此條件下多酚得到了充分提取；之后，隨著時間的增加多酚得率又呈現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于長時間超聲波發(fā)出機械振動破壞了多酚結(jié)構(gòu)[18]。所以，選擇15～25 min作為超聲提取時間考察范圍。

由圖2可知，在其他條件一定時，多酚得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加逐漸增加，當達到70%時，多酚得率達到最大；之后，當乙醇體積分數(shù)再增加時多酚得率反而減少，說明高濃度乙醇會影響多酚的溶出[19]。所以，選擇60%～80%作為乙醇體積分數(shù)考察范圍。

由圖3可知，其他條件一定時，料液比在（1∶10）～（1∶20）范圍內(nèi)，多酚得率隨著料液比增大而逐漸增大；之后，當繼續(xù)增加料液比時，多酚得率呈現(xiàn)減少的趨勢，說明溶解的多酚達到飽和狀態(tài)，從節(jié)約資源的角度考慮，選擇（1∶15）～（1∶25）為料液比考察范圍。

從圖4可以看出，在其他條件一定的情況下，多酚得率隨著超聲提取溫度的增加逐漸增加，當達到50℃時，多酚得率達到最大；之后，隨著溫度的繼續(xù)增加，多酚得率呈現(xiàn)減小的趨勢，可能是由于高溫破壞了多酚的化學結(jié)構(gòu)，從而導致多酚含量的減小，而且高溫使得溶劑蒸發(fā)，導致料液比發(fā)生變化[20]。所以，選擇40～60℃作為超聲提取溫度考察范圍。

2.2 響應面優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)表2的試驗設計和結(jié)果，采用Design Expert 8.05對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到響應面二次多項式模型方差分析表（表3）及交互作用響應曲面圖（圖5）。以藜麥多酚得率為響應值，得到擬合二次回歸方程模型如下。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果

從表3可以看出，本試驗模型達到極顯著水平（P＜0.0001），失擬項P＝0.7839＞0.05，不顯著，R2＝0.966 2，說明本試驗回歸模型與實際擬合較好，可以用于藜麥多酚提取工藝的預測，并可用回歸方程對試驗結(jié)果進行分析。

表3 響應面二次多項式模型方差分析

2.3藜麥多酚體外抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基能力測定DPPH自由基在517 nm波長附近有最大吸收峰，當DPPH自由基與自由基清除劑反應后，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色，自由基清除能力越大，褪色程度越大[19-21]。從表4可以看出，藜麥多酚提取物對DPPH自由基清除效果非常明顯，半抑制濃度（IC50）達到1.62 μg/mL，遠遠強于抗壞血酸（9.76 μg/mL），并且隨著質(zhì)量濃度的增加自由基清除率增加。

表4 清除DPPH自由基能力

從圖6可以看出，藜麥多酚提取物質(zhì)量濃度與對DPPH·自由基清除率呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，由于清除DPPH·自由基能力是表征抗氧化性的一個重要指標，所以藜麥多酚具有良好的抗氧化活性。

2.3.2 清除羥自由基能力測定羥自由基（·OH）是生命活動氧化代謝過程中體內(nèi)最為活潑的活性氧，它能殺死紅細胞，可介導許多病理變化，如引起脂質(zhì)過氧化、造成細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞等。因此羥自由基的產(chǎn)生與衰老和許多疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-23]。從表5、圖7可以看出，藜麥多酚提取物和抗壞血酸清除羥自由基能力都隨著濃度的增加逐漸增強，當清除率達到50%時藜麥樣品濃度為21.27 μg/mL，而抗壞血酸為217.84 μg/mL，說明藜麥多酚對羥自由基的清除效果遠優(yōu)于抗壞血酸。

表5 清除羥自由基能力

2.3.3 還原能力測定還原能力是表征物質(zhì)抗氧化的重要特征，也是用來評價物質(zhì)抗氧化性能的常用方法。一般情況下，樣品的還原力越強，說明其抗氧化能力越強[26-27]。從表6、圖8可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，藜麥多酚提取物的還原能力隨著樣品濃度的增加而增大，并且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；當吸光度達到0.5時，藜麥樣品與抗壞血酸的濃度分別為7.58，34.50 μg/mL，說明與抗壞血酸相比，藜麥多酚具有良好的還原能力。

表6 清除羥自由基能力

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和響應面實驗優(yōu)化，采用超聲波輔助法探索提取藜麥多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件，利用Design Expert 8.05軟件中Box-Behnken中心組合實驗對結(jié)果進行優(yōu)化分析。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取時間23 min，乙醇體積分數(shù)71%，料液比1∶23（g/mL），提取溫度52℃；在此條件下，多酚提取量為3.33 mg/g，本試驗的工藝條件適于藜麥多酚的提取。另外，通過清除DPPH·、羥自由基能力和還原能力的測定，分析結(jié)果得出，藜麥多酚與3項指標均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，而且抗氧化活性均強于抗壞血酸，說明藜麥多酚具有良好的抗氧化活性。作為一種天然抗氧化植物，藜麥具有很好的發(fā)展前景與潛力。

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Study on Extraction Process by Ultrasonic-assisted Response Surface Method and Antioxidant Activity of Quinoa Polyphenol

CHENShujun，HUJie，WANGZhenwen，PANGZhenpeng，LIUXiaojuan，XUXiaoxia，YI Xin，SHI Yue，LI Le
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Ultrasonic-assisted response surface method was adopted to explore the optimum extraction of polyphenols from Shanxi Jingle quinoa seed,and antioxidant activity in vitro was measured.The paper took polyphenols yield as index,considering the effect on extraction time,ethanol concentration,solid-liquid ratio,extraction temperature four factors.Response surface test was applied based on the single factor experiment.The results showed that the best conditions for ultrasonic extraction of quinoa polyphenols was as follows: extraction time 23 min,ethanol concentration 71%,solid-liquid ratio 1∶23（g/mL）,extraction temperature 52℃,under these conditions,the yield of polyphenols was 3.33 mg/g.The ultrasonic assisted method was used to extract quinoa polyphenols which was simple,greatly shorten the extraction time and increased extraction efficiency.At the same time,the polyphenols extracted from quinoa showed strongradical scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazxyl（DPPH·）and hydroxyl（·OH）which were stronger than ascorbic acid,and half inhibitory concentration（IC5）0of them were 1.62,21.27 μg/mL,respectively.Besides,quinoa polyphenol also had strong reducing power and in a concentration-dependent manner with antioxidant activity.These results illustrated that quinoa was rich in polyphenols and had good antioxidant abilities.

quinoa;polyphenol;response surface;extraction;antioxidant activity

TQ914.1

A

1002-2481（2016）11-1708-08

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.32

2016-05-16

陳樹?。?964-），男，山西定襄人，副教授，主要從事食品新工藝及功能食品研究工作。