蒼術(shù)組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

安曉寧，左靜靜，閆貴云，劉少翔，霍利光

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

蒼術(shù)組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

安曉寧1，左靜靜2，閆貴云2，劉少翔2，霍利光2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

蒼術(shù)為菊科多年生草本植物，是使用最廣泛的野生中藥材之一，其莖和根均可以入藥，用途廣、用量大、且不可替代。目前，蒼術(shù)資源已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)，因此研究如何快速擴(kuò)繁蒼術(shù)不僅僅是滿足醫(yī)療上對(duì)中藥材的需求問題，而且還涉及這一物種存在的問題。就目前蒼術(shù)組織培養(yǎng)中外植體、培養(yǎng)基以及外源激素等方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，為進(jìn)一步建立和完善蒼術(shù)再生體系和轉(zhuǎn)化體系提供參考。

蒼術(shù)；組織培養(yǎng)；外源激素

蒼術(shù)（Atractylodes japonica）為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物[1]。蒼術(shù)又名關(guān)蒼術(shù)，是常用的中藥材之一，具有祛風(fēng)散寒、燥濕健脾和明目的功效[2]，市場(chǎng)需求量大[3]。蒼術(shù)有北蒼術(shù)（華蒼術(shù)）（A.chinensis（DC.）Koidz）和南蒼術(shù)（茅蒼術(shù)）（Atractylodeslancea（Thunb.）DC）之分[4]。茅蒼術(shù)主產(chǎn)于江蘇、安徽、湖北、河南，其中，江蘇省所產(chǎn)茅蒼術(shù)為著名的道地藥材[5]。北蒼術(shù)，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、寧夏、青海等省、自治區(qū)[6-7]，在山西省中條山和太行山一帶分布著北蒼術(shù)的優(yōu)良資源。蒼術(shù)是使用最廣泛的野生中藥材之一，蒼術(shù)作為在中藥材中用途最廣、用量最大的品種之一，具有不可替代性。蒼術(shù)作為中藥材的年需求量在3 000～4 000 t，在日本和韓國，蒼術(shù)的漢方制劑也很受歡迎。近年來，蒼術(shù)價(jià)格成倍增長，而市場(chǎng)供應(yīng)完全依賴野生，過度地挖采導(dǎo)致蒼術(shù)野生資源日趨枯竭，江蘇省已經(jīng)將蒼術(shù)列為省二級(jí)瀕危中藥材[8-9]。所以，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注蒼術(shù)的組織培養(yǎng)和人工栽培。2000年前后，以巢建國、劉海萍為代表的學(xué)者們開始了對(duì)茅蒼術(shù)組織培養(yǎng)方面的研究[10]，直到2013年以劉少翔為代表的學(xué)者們才開始了對(duì)北蒼術(shù)組織培養(yǎng)和快速繁殖方面的研究。

筆者查閱了大量相關(guān)的文獻(xiàn)資料，結(jié)合蒼術(shù)的生物學(xué)特性和植物組織培養(yǎng)原理，對(duì)蒼術(shù)組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為蒼術(shù)組織培養(yǎng)研究和資源的人工保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 蒼術(shù)組織培養(yǎng)中外植體的選擇

植物組織培養(yǎng)時(shí)，首先要選擇離體培養(yǎng)的材料，這些被選來的植物器官或組織的片段就是外植體。外植體的選擇非常關(guān)鍵，影響外植體選擇的主要因素有：外植體的取材部位、采樣時(shí)間、發(fā)育階段以及生長環(huán)境等因素，這些因素直接決定植物組織培養(yǎng)能否成功[11]。蒼術(shù)組織培養(yǎng)中的外植體有多種選擇，學(xué)者們使用過并可成功獲得小植株的外植體[12-14]有胚、胚軸、胚根、葉片、葉柄、腋芽、子葉、真葉、根莖、根莖側(cè)芽、莖尖共11種[15]。選擇不同的外植體，組織培養(yǎng)的途徑不同[16]。在蒼術(shù)組織培養(yǎng)時(shí)，不同的外植體對(duì)應(yīng)不同的組織培養(yǎng)分化途徑，一是器官發(fā)生途徑[17]，二是體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)途徑[18]。

1.1 器官發(fā)生途徑

器官發(fā)生途徑分為直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑2種。

1.1.1 直接器官發(fā)生途徑直接器官發(fā)生途徑是指組織培養(yǎng)中通過外植體直接形成愈傷組織，不需要先經(jīng)過脫分化過程，然后再分化成器官的途徑[19]。蒼術(shù)組織培養(yǎng)時(shí)選取胚根、胚軸、子葉、真葉、根莖、腋芽、根莖側(cè)芽、莖尖為外植體獲得再生植株。

2001年，一些學(xué)者開始了對(duì)茅蒼術(shù)的深入研究，劉海萍等[20]、巢建國等[21]通過直接器官發(fā)生途徑獲得再生植株，試驗(yàn)中選取的外植體有胚根、胚軸、子葉、真葉，選出最佳分化培養(yǎng)基MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L＋蔗糖3%和最佳生根培養(yǎng)基1/2 MS＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖3%。

2006年，李西騰等[22]選取根莖側(cè)芽為外植體，根莖側(cè)芽誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L＋蔗糖3%，誘導(dǎo)率達(dá)90%以上；芽繼代（2～3代）時(shí)，用MS＋6-BA3.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋糖3%培養(yǎng)基效果較好；但是當(dāng)繼代到8～10代時(shí)，隨著繼代代數(shù)的增加，激素的濃度則要逐漸降低，用MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋蔗糖3%的激素組合培養(yǎng)基較好；生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基則為1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖3%，在這種培養(yǎng)基中幾乎100%都可以生根。

2010年，石云平等[23]以蒼術(shù)的嫩莖和芽為外植體研究得出，植物生長調(diào)節(jié)劑配比的最佳組合為N68＋6-BA 1.0 mg/L＋KT1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋I(xiàn)BA0.2 mg/L＋蔗糖3%。

2011年，于金玲等[24-25]以蒼術(shù)的根莖為外植體，研究了蒼術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)果得出，MS＋6-BA 0.3 mg/L＋2，4-D 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖3%是根莖愈傷組織生長培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋蔗糖3%是愈傷組織分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L＋I(xiàn)AA 0.3 mg/L＋蔗糖3%是生根培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

1.1.2 間接器官發(fā)生途徑間接器官發(fā)生途徑是指組織培養(yǎng)中外植體要先脫分化形成愈傷組織，愈傷組織上再分化形成器官的途徑[26]。蒼術(shù)組織培養(yǎng)時(shí)選取葉片、葉柄為外植體獲得再生植株。

2005年，劉海萍等[27]選取葉片、葉柄為外植體，對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，得出以葉柄為外植體的最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基激素配比為2，4-D 4.0 mg/L＋KT 0.4 mg/L，誘導(dǎo)率可達(dá)100%；以葉片為外植體的最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基激素配比為2，4-D4.0 mg/L＋KT0.4 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)到89.74%；芽增殖的最佳培養(yǎng)基激素配比為6-BA 2.0 mg/L＋I(xiàn)BA0.4 mg/L或6-BA3.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.4 mg/L；生根培養(yǎng)則以MS＋I(xiàn)AA 0.5 mg/L＋蔗糖3%或MS＋NAA0.5 mg/L＋蔗糖3%配比效果較好。

2007年，袁媛等[28]通過間接器官發(fā)生途徑選取根、葉片、葉柄、子葉為外植體，成功誘導(dǎo)出不定根，其中，根、葉片、葉柄、子葉誘導(dǎo)率分別為38.89%，30%，0，14.28%，根的誘導(dǎo)率最高，葉片次之，葉柄最低。以葉片為外植體，生長較旺盛；以根段為外植體，其誘導(dǎo)不定根時(shí)啟動(dòng)最快、長勢(shì)較弱，有褐化現(xiàn)象；以葉柄為外植體則誘導(dǎo)不出愈傷組織及不定根。

1.2 體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)途徑

由于蒼術(shù)胚的取材和胚成熟期的把握很難，因此，目前對(duì)于蒼術(shù)的胚胎培養(yǎng)研究甚少。2007年開始，趙玉國等[29]通過試驗(yàn)證實(shí)，茅蒼術(shù)胚誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋蔗糖3%，且生長快；最佳增殖培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋蔗糖3%，通過45 d的增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.5；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA0.5 mg/L+蔗糖3%。

2 蒼術(shù)組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基及外源激素的選擇

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基和外源激素的選擇以及環(huán)境和營養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)直接影響植物器官的變態(tài)[30]，植物器官變態(tài)的發(fā)生和發(fā)育是通過脫分化和再分化完成的。影響這一過程的因子有內(nèi)因和外因2種，其中，內(nèi)因是指植物的遺傳特性和生理狀態(tài)；而外因是指植物細(xì)胞的營養(yǎng)條件和環(huán)境[31]。

2.1 培養(yǎng)基

在植物離體組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基提供植物生長所需要的全部營養(yǎng)成分，因此，選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的必要條件[32]。在蒼術(shù)的組織培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基有：N68，B5，MS，1/2 MS，1/4 MS，ER，VW，White和LS共9種。其中MS培養(yǎng)基主要用于誘導(dǎo)和繼代，1/2 MS，1/4 MS培養(yǎng)基則用于生根誘導(dǎo)[33]，N68則用于增殖培養(yǎng)[34]。除此之外，培養(yǎng)基中還需要加入植物生長必需的碳源——蔗糖以及用來固定的瓊脂，大部分學(xué)者選擇蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為4%～8%[35]。

2.2 外源激素

在植物生命活動(dòng)中，激素是一種不可或缺的活性物質(zhì)，它不僅可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長發(fā)育，而且也是植物細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物形成的主要物質(zhì)[36]。蒼術(shù)組織培養(yǎng)中不同的蒼術(shù)品種及選取不同的外植體，在其形態(tài)建成過程中所需的激素種類、濃度以及培養(yǎng)條件各不相同[37]。在外源激素的選擇上，學(xué)者們用到的激素有6-BA，NAA，IBA，IAA，2，4-D和KT共6種[38-40]。不同的激素配比在蒼術(shù)組織培養(yǎng)中的作用如表1所示。

表1 培養(yǎng)基和外源激素在蒼術(shù)組織培養(yǎng)中的作用

近年來，對(duì)蒼術(shù)藥材的供求不平衡導(dǎo)致天然蒼術(shù)資源嚴(yán)重不足，甚至瀕臨滅絕[41]。因此，通過組織培養(yǎng)手段來解決蒼術(shù)的需求問題也越來越受到關(guān)注，但這方面的研究還不夠深入，且大都集中在對(duì)茅蒼術(shù)的研究上。目前，對(duì)于茅蒼術(shù)的研究，學(xué)者們則大多集中在快速繁殖和擴(kuò)大繁殖系數(shù)方面，研究范圍比較狹窄。山西是北蒼術(shù)的主要產(chǎn)區(qū)之一，在山西境內(nèi)分布著優(yōu)質(zhì)的北蒼術(shù)資源，但目前對(duì)北蒼術(shù)的研究甚少，因此，特別要關(guān)注北蒼術(shù)的研究。今后蒼術(shù)組織培養(yǎng)中應(yīng)加強(qiáng)研究：（1）蒼術(shù)的生理性研究。為了解決蒼術(shù)資源匱乏的問題，學(xué)者們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)蒼術(shù)生長發(fā)育的研究，包括蒼術(shù)生長發(fā)育所需的營養(yǎng)、新陳代謝規(guī)律、最佳生態(tài)環(huán)境，并將這些指標(biāo)與蒼術(shù)的田間栽培緊密結(jié)合起來。（2）選育優(yōu)良的蒼術(shù)品種。通過生物技術(shù)的應(yīng)用，進(jìn)行蒼術(shù)優(yōu)良品種的選育和提純復(fù)壯，選育出高品質(zhì)的蒼術(shù)品種，保護(hù)種質(zhì)資源。（3）建立蒼術(shù)快繁體系。建立一套完善、實(shí)用、有效的快速繁殖體系，實(shí)現(xiàn)蒼術(shù)優(yōu)良植株或優(yōu)良種子的規(guī)?；?、商品化生產(chǎn)。

綜上所述，研究蒼術(shù)組織培養(yǎng)、選育蒼術(shù)優(yōu)良品種和建立蒼術(shù)快速繁殖體系應(yīng)當(dāng)成為科學(xué)技術(shù)工作者今后研究的方向和重點(diǎn)。

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Research Advance on Tissue Culture ofAtractylodes japonica

ANXiaoning1，ZUOJingjing2，YANGuiyun2，LIUShaoxiang2，HUOLiguang2
（1.Institute of Horticulture，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Institute of Crop Sciences，Shanxi Academy o fAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Atractylodes japonica is asteraceae perennial herbaceous plants,and it is an famous wild medicinal herbs.It's rhizoma and root widely are used to be traditional Chinese medicine.The Atractylodes japonica resources are endangered now,so research advance in tissue culture of Atractylodes japonica not only solves the problem of requirement for traditional Chinese medicine,but aslo protects species.The paper reviews the current research situation and advance of tissue culture of Atractylodes japonica.Efficient systems of the Atractylodes japonica embryo culture and transformation will remarkably promote Atractylodes japonica genetic engineering improvement and functional genomics study.

Atractylodes japonica;tissue culture;exogenous hormone

S567.21＋1

A

1002-2481（2016）11-1743-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.39

2016-08-16

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140313010-4）

安曉寧（1984-），男，山西晉中人，助理研究員，碩士，主要從事生物技術(shù)與園藝種苗研究工作。左靜靜為通信作者。