耐酸產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌菌株的篩選及其生料固體發(fā)酵豆粕效果評價

■董偉潔 朱永明 姜軍坡王梓竹 王世英 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

發(fā)酵豆粕富含小分子肽、游離氨基酸、乳酸、益生菌等多種營養(yǎng)成分，日益被飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶所青睞(張連慧等，2017)。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)較為簡單，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，且能耗低、廢液污染較少，投資成本與生產(chǎn)成本相對較低，是發(fā)酵豆粕適宜的方式(朱平軍，2011)。北方地區(qū)冬季氣候寒冷，若豆粕發(fā)酵過程所需溫度越低，則越有利于節(jié)省能耗，降低生產(chǎn)成本。關(guān)于以混菌的方式發(fā)酵豆粕，國內(nèi)研究人員做了大量工作。如王德培等(2011)利用枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、乳酸桿菌發(fā)酵豆粕，當(dāng)枯草芽孢桿菌與乳酸菌之比為2.2∶1、發(fā)酵溫度30℃、外加水量46.5%、總接種量15 ml（在豆粕72 g、麩皮8 g的發(fā)酵基質(zhì)中）、拌料水pH值自然，發(fā)酵84 h后，發(fā)酵豆粕中三氯乙酸可溶性氮含量可達(dá)12.78%?；炀l(fā)酵的原理主要是利用芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶，酵母菌和曲霉菌可降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，乳酸菌可調(diào)節(jié)pH值，通過協(xié)調(diào)各個菌株之間的作用來提高豆粕的營養(yǎng)價值。若是能篩選出一株能在酸性環(huán)境中生長，可在胞外產(chǎn)生蛋白酶并降解豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的菌株，則可事半功倍。芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌可在胞外產(chǎn)生多種消化酶，耐受酸性環(huán)境，極具開發(fā)潛力(潘迪子等，2016)。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的發(fā)酵豆粕質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，發(fā)酵豆粕中粗蛋白質(zhì)含量不得低于45%，酸溶蛋白占粗蛋白質(zhì)的含量（即酸溶蛋白相對含量）不得低于8.0%。因此，本研究擬以酸性脫脂牛奶培養(yǎng)基為限制性培養(yǎng)基，結(jié)合透明圈法進行初篩，以酸性蛋白酶活力為指標(biāo)進行復(fù)篩；通過菌落及菌體形態(tài)觀察、生理生化特性測定、16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法鑒定供試菌株種屬；通過室溫18℃下固體發(fā)酵豆粕試驗，探索供試菌株低溫下降解大分子抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高酸溶蛋白相對含量的可行性，并以酸溶蛋白相對含量為指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計考察料水比、玉米粉含量、硫酸銨含量、菌株接種量4個因素，優(yōu)化固體發(fā)酵豆粕的條件，為供試菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

土壤樣品采集于保定市生態(tài)園和保定市植物園中各類植物根際土壤（地面10 cm以下）。酸菜樣品購于保定市沃爾瑪超市、惠友超市。糞便樣品采集于保定市固德生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司特種野豬繁育中心、保定市謝莊村永生養(yǎng)殖場、保定市滿城區(qū)睿德養(yǎng)殖場。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基與試液

膨化豆粕：粗蛋白質(zhì)≥(43.0±0.5)%，水分≤13.0%，由中儲糧油脂（唐山）有限公司生產(chǎn)。

NB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基的配制方法參見周德慶等(2013)。

富集培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基：脫脂牛奶100 ml、酵母浸粉5.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液900 ml。

NB培養(yǎng)基（pH值5.0）：除以pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液代替水外，其余組分同NB培養(yǎng)基。

豆粕培養(yǎng)基（pH值5.0）：豆粕含量5.0 g、葡萄糖1.0 g、MgCl20.1 g、硫酸銨2.0 g、pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制100 ml。

10 mmol/l 2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液：稱取0.031 2 g的TPTZ，用0.04 mol/l的鹽酸溶液定容至10 ml，4 ℃保存。

TPTZ工作液：將10 mmol/l TPTZ溶液、20 mmol/l FeCl3溶液、0.2 mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照10∶1∶1的比例混合，35℃水浴孵化60 min。

1%脫脂牛奶（pH值5.0）：取伊利脫脂牛奶33.3 ml，加入100 ml容量瓶中，用pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 ml，即得。

1.1.3 固體發(fā)酵容器

8 L食品級塑料桶（壓扣蓋）：上口直徑225 mm，下口直徑210 mm，高235 mm。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養(yǎng)

取樣品10.0 g置于無菌水中，裝瓶量為100 ml/250 ml，于180 r/min振蕩20 min后再靜置5 min，取上清待用。按10%的接種量接種于NB培養(yǎng)基，37℃于180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 耐酸產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

將富集培養(yǎng)得到的菌液于80℃水浴20 min后，梯度稀釋。分別取10-4、10-5、10-6梯度稀釋液100 μl，涂布于初篩培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取生長良好、有明顯透明圈的單菌落，NA斜面保藏，即為初篩菌株。

1.2.3 耐酸產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩

將初篩菌株接種于豆粕培養(yǎng)基，37℃下于180 r/min培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液離心（10 000 r/min，4 ℃）10 min，取上清作為粗酶液，參考GB/T 28715—2012方法測定酸性蛋白酶活性，其中底物采用1%脫脂牛奶（pH值5.0）。以復(fù)篩菌株中酸性蛋白酶活力最高者為供試菌株。

1.2.4 供試菌株的菌落、菌體形態(tài)觀察

采用平板劃線法將供試菌株于37℃下培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)。采用革蘭氏染色觀察供試菌株的菌體形態(tài)。

1.2.5 供試菌株生理生化特性測定

對供試菌株的生理生化特性進行測定，參照車秀珠等(2001)方法。

1.2.6 16S rDNA序列測定

參考呂紀(jì)濤(2015)的方法提取供試菌株DNA并擴增其16S rDNA序列。擴增產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司測序。將測得序列提交到GenBank中進行BLAST比對，利用Mega 5.04按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 供試菌株固體發(fā)酵豆粕效果評價

1.2.7.1 固體發(fā)酵豆粕基礎(chǔ)條件

刮取供試菌株斜面菌苔，接種NB培養(yǎng)基中，裝瓶量100 ml/250 ml，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，即得供試菌液。

稱取12.00 kg豆粕，平鋪于地面，加入0.48 kg玉米粉、0.30 kg硫酸銨，混合均勻；對照組僅加水，水的體積按料水比1∶0.6量??；試驗組加入水與供試菌液的混合物，水的體積按料水比1∶0.6量取，菌液體積按接種量6.0%量取；pH值自然。對照組、試驗組分別混勻后，分裝入置于8 L塑料桶內(nèi)的塑料袋中，裝滿并壓實密封，盡可能排出氣體；室溫18℃下發(fā)酵30 d，塑料桶周圍不覆蓋保溫物質(zhì)。觀察并記錄發(fā)酵豆粕的感官指標(biāo)，并測定試驗組在0、30 d及對照組在30 d時對應(yīng)的水分、pH值、粗蛋白質(zhì)含量、酸溶蛋白相對含量、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布、抗氧化活性等指標(biāo)。

（1）水分含量測定：稱取發(fā)酵豆粕3.0 g于平皿中，置于50℃的烘箱中干燥至恒重，計算發(fā)酵豆粕的水分含量（x，%）：

式中：M1——干燥前發(fā)酵豆粕與平皿的總質(zhì)量（g）；

M2——干燥后發(fā)酵豆粕與平皿的總質(zhì)量（g）；

m——發(fā)酵豆粕質(zhì)量（g）。

（2）發(fā)酵物pH值測定：稱取發(fā)酵豆粕3.0 g于50 ml離心管中，加入30 ml蒸餾水，振蕩60 min后，于5 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，測量pH值。

（3）粗蛋白質(zhì)含量測定：參考GB/T 500.9—2016方法。計算發(fā)酵豆粕經(jīng)干燥后的粗蛋白質(zhì)含量(P，%)：

式中：p——發(fā)酵豆粕未干燥時的粗蛋白含量（%）；

x——發(fā)酵豆粕含水量（%）。

（4）酸溶蛋白含量測定：稱取發(fā)酵豆粕4.0 g置于離心管中，按照1∶5的比例加入15%的三氯乙酸20 ml，振蕩60 min。5 000 r/min離心10 min。吸取3 ml上清加入消解管，其余操作同粗蛋白質(zhì)含量測定方法。計算發(fā)酵豆粕經(jīng)干燥后的酸溶蛋白含量（PAS，%）：

式中：pAS——發(fā)酵豆粕未干燥時的酸溶蛋白含量(%)；

x——發(fā)酵豆粕含水量（%）。

酸溶蛋白含量與粗蛋白質(zhì)含量的比值即為酸溶蛋白相對含量（PAS/P，%）。

（5）蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布測定：稱取樣品1.0 g，加入20 ml的0.03 mol/l Tris-HCl（pH值 8.0），在室溫下浸提60 min（每隔10 min振蕩1 min），10 000 r/min下離心10 min，取上清液40 μl，加入5×上樣緩沖液 10 μl，進行沸水浴 10 min，12 000 r/min下離心5 min，離心后即得樣品液。采用SDS-PAGE法測定樣品液的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布情況(王章存等，2013)。

（6）抗氧化活性測定方法(米書梅等，2013；Benzie等，1996)：分別取不同濃度（0、25、50、100、150、200、250、300、350、400 mmol/l）的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μl，加入TPTZ工作液3 ml，混合均勻后于35℃水浴孵化30 min，在597 nm測定吸光度。以水代替維生素C溶液同法操作，所得孵化液用來調(diào)零。維生素C濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.292 7x-0.035 2（R2=0.999 4）[y——597 nm下吸光度；x——維生素C濃度（mmol/l）]。

稱取用研缽碾碎的樣品1.0 g，加入5 ml 15%三氯乙酸浸提60 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液100 μl，加入 TPTZ 工作液3 ml，混合均勻后35℃水浴孵化30 min，于597 nm下測定吸光度。取水100 μl，加入TPTZ工作液3 ml，混合均勻后35 ℃水浴孵化30 min，所得孵化液用來調(diào)零。發(fā)酵豆粕抗氧化活性以mg AEAC/100 g[與每100 g發(fā)酵豆粕的抗氧化能力相當(dāng)?shù)木S生素C的質(zhì)量（以mg計）]表示。計算發(fā)酵豆粕經(jīng)干燥后的抗氧化活性（Y，mg AEAC/100 g）：

運用混合式學(xué)習(xí)模式的整本書閱讀不只在課堂上進行閱讀和討論，而是將閱讀延展到家庭、社區(qū)等任意空間，且靈活采用線上、線下的學(xué)習(xí)方式，至少一部分是在線討論、探究，至少一部分是在實體課堂上由教師介人指導(dǎo)的閱讀學(xué)習(xí)，還有至少一部分是學(xué)生的自由自主閱讀。課堂學(xué)習(xí)、在線互動、非課堂非在線自主閱讀，至少這三個模塊整合在一起，形成完整的整本書閱讀體驗課程。

式中：y——發(fā)酵豆粕未干燥時的抗氧化活性（mg AEAC/100 g）；

x——發(fā)酵豆粕含水量(%)。

1.2.7.2 正交試驗優(yōu)化固體發(fā)酵豆粕條件

以酸溶蛋白相對含量為指標(biāo)，按照正交試驗表L9（34）設(shè)計4因素3水平的正交試驗考察料水比、玉米粉含量、硫酸銨含量、菌株接種量等因素對供試菌株固體發(fā)酵豆粕效果的影響。正交試驗的因素水平表如表1所示。

表1 耐酸產(chǎn)蛋白酶菌株固體發(fā)酵豆粕正交優(yōu)化試驗因素水平設(shè)計

采用供試菌株固體發(fā)酵豆粕15、30 d時，于發(fā)酵豆粕的頂部、中部和底部分別劃十字，每個十字于端點及交叉點取樣；將所有樣品充分混勻，取混合物按前述方法測定水分含量、pH值、粗蛋白質(zhì)含量、酸溶蛋白相對含量和抗氧化活性。

以酸溶蛋白相對含量為指標(biāo)，對豆粕發(fā)酵15 d和30 d的正交試驗結(jié)果分別進行極差分析，比較發(fā)酵15 d和30 d時各自最優(yōu)組合的發(fā)酵效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸生長產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩（見表2）

表2 耐酸生長產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果

經(jīng)過初篩，共篩選出可在初篩培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生透明圈的菌株133株，其中透明圈直徑大于0.80 cm的菌株共21株（如表2所示）。由表2可知，透明圈直徑在0.80～2.00 cm之間的菌株共有17株；而透明圈直徑＞2.00 cm的菌株共有4株，分別是菌株SD47、SD48、SD56和SD62，其中最高者為SD48菌株。故以菌株SD47、SD48、SD56和SD62作為復(fù)篩菌株。

2.2 耐酸生長產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩

圖1 復(fù)篩菌株蛋白酶活力測定的結(jié)果

2.3 SD48菌株種屬鑒定

2.3.1 SD48菌株形態(tài)觀察結(jié)果

SD48菌株的菌落形態(tài)如圖2（a）所示，呈白色，圓形，火山口狀，四周隆起，邊緣整齊，中央凹陷，凹陷區(qū)域表面光滑。

圖2 SD48菌株菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果

SD48菌株菌體形態(tài)如圖2（b）所示，菌體呈桿狀，為革蘭氏陽性菌，芽孢中生。

2.3.2 SD48菌株生理生化特性的測定結(jié)果（見表3）

由表3可知，SD48菌株具有運動性，產(chǎn)接觸酶，能利用檸檬酸鹽，可水解淀粉、酪朊、牛奶，可利用D-葡萄糖、D-甘露醇產(chǎn)酸，可還原硝酸鹽，生長不需要Na?Cl和KCl，但能在2%～10%的NaCl中生長，在10～50 ℃范圍內(nèi)可生長。故SD48菌株具有典型的芽孢桿菌屬菌株特性，綜合其菌落形態(tài)和菌體形態(tài)，可初步判斷SD48菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.3.3 SD48菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將SD48菌株和與其高同源性的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（見圖3），并進行相似性比較（見表4）。由結(jié)果可知，SD48菌株與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacil?lus methylotrophicus）同源性最高，且相似性為100.00%。故確定SD48菌株屬于B.methylotrophicus。2.4B.methylotrophicusSD48菌株固體發(fā)酵豆粕效果評價

2.4.1 基礎(chǔ)條件發(fā)酵效果評價

2.4.1.1 感官指標(biāo)（見圖4）

表3 SD48菌株生理生化試驗的結(jié)果

圖3 耐酸生長產(chǎn)蛋白酶菌株SD48的系統(tǒng)進化樹

表4 SD48菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比較

發(fā)酵30 d后，對照組發(fā)酵豆粕色澤呈淺黃色，酸味較淡，有結(jié)塊現(xiàn)象，染有霉菌；試驗組的發(fā)酵豆粕色澤金黃，具有濃郁酸香味，無結(jié)塊現(xiàn)象。

2.4.1.2 豆粕發(fā)酵效果

圖4 基礎(chǔ)條件下SD48菌發(fā)酵豆粕30 d時的表觀情況

B.methylotrophicusSD48菌株在基礎(chǔ)條件下發(fā)酵豆粕的效果見表5。由表5可知，與對照組相比，發(fā)酵30 d時試驗組的pH值更低，含水量、粗蛋白質(zhì)含量無顯著差異（P＞0.05），酸溶蛋白含量、酸溶蛋白相對含量、抗氧化活性更高。就試驗組而言，發(fā)酵30 d后pH值顯著下降（P＜0.05），含水量、粗蛋白質(zhì)含量無明顯變化（P＞0.05），酸溶蛋白含量顯著增加（P＜0.05），酸溶蛋白相對含量顯著增加（P＜0.05），抗氧化活性顯著增加（P＜0.05）。故SD48菌株可使發(fā)酵豆粕pH值降低，提高其酸溶蛋白含量和抗氧化活性。

表5 B.methylotrophicusSD48菌株發(fā)酵豆粕的效果

2.4.1.3 發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布分析

發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可知，試驗組發(fā)酵0 d時，β-伴大豆球蛋白（7S）的主要亞基（72 kDa的α亞基、83 kDa的α?亞基和50 kDa的β亞基）以及大豆球蛋白（11S）的主要亞基（34 kDa的酸性多肽鏈和20 kDa的堿性多肽鏈）均清晰可見。發(fā)酵30 d時，對照組對應(yīng)的95 kDa以上組分含量略有降低，但不明顯；對照組對應(yīng)的β-伴大豆球蛋白含量和大豆球蛋白含量均顯著下降，但并未消失，這說明豆粕中存在的微生物也能降解β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。發(fā)酵30 d時，試驗組僅在50～80 kDa間可看到5個清晰的蛋白條帶；95 kDa以上組分消失，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白對應(yīng)條帶也基本消失。故SD48菌株可有效去除豆粕中的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。

圖5 基礎(chǔ)條件下發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布

2.4.2B.methylotrophicusSD48菌株固體發(fā)酵豆粕條件的正交優(yōu)化

2.4.2.1 豆粕發(fā)酵15 d時的正交優(yōu)化試驗結(jié)果

豆粕發(fā)酵15 d時的正交優(yōu)化試驗結(jié)果和極差分析如表6、表7所示。分析極差R可知，對酸溶蛋白相對含量影響最大的因素是硫酸銨含量，其次是料水比，再次是玉米粉含量，影響最小的因素是菌株接種量。通過均值分析可知，最佳組合為A3B1C3D3，該組合未在正交試驗中出現(xiàn)。故將其與正交試驗中表現(xiàn)最佳的組合A3B1C3D2進行比較，結(jié)果見表8。由表8可知，與A3B1C3D3相比，A3B1C3D2對應(yīng)的酸溶蛋白相對含量更高，即組合A3B1C3D2對應(yīng)的發(fā)酵效果更好，此條件下發(fā)酵豆粕的粗蛋白質(zhì)含量為49.42%，酸溶蛋白含量為10.53%，酸溶蛋白相對含量為21.30%，抗氧化活性為135.42 mg AEAC/100 g。

表6 SD48菌株固體發(fā)酵豆粕15 d時的正交試驗結(jié)果

表7 豆粕發(fā)酵15 d時正交試驗結(jié)果的極差分析

表8 豆粕發(fā)酵15 d時正交優(yōu)化結(jié)果的驗證

2.4.2.2 豆粕發(fā)酵30 d時的正交優(yōu)化試驗結(jié)果

豆粕發(fā)酵30 d時的正交優(yōu)化試驗結(jié)果和極差分析如表9、表10所示。分析極差R可知，影響酸溶蛋白相對含量因素的主次排序與發(fā)酵15 d時相同，硫酸銨含量＞料水比＞玉米粉含量＞菌株接種量。通過均值分析可知，最佳組合為A3B1C3D1，將其與正交試驗中表現(xiàn)最佳的組合A3B1C3D2進行比較，結(jié)果見表11。由表11可知，與A3B1C3D1相比，A3B1C3D2對應(yīng)的酸溶蛋白相對含量更高，即組合A3B1C3D2為對應(yīng)的發(fā)酵效果更好，此條件下發(fā)酵豆粕的粗蛋白質(zhì)含量為51.33%，酸溶蛋白為13.47%，酸溶蛋白相對含量為26.24%，抗氧化活性為409.63 mg AEAC/100 g。

表9 SD48菌株固體發(fā)酵豆粕30 d時的正交試驗結(jié)果

表10 豆粕發(fā)酵30 d時正交試驗結(jié)果的極差分析

表11 豆粕發(fā)酵30 d時正交優(yōu)化結(jié)果的驗證

綜上，B.methylotrophicus SD48菌株固體發(fā)酵豆粕的最優(yōu)條件為料水比1∶1，玉米粉含量10.0%，硫酸銨含量6.0%，接種量8.0%，發(fā)酵時間30 d。與基礎(chǔ)發(fā)酵條件下發(fā)酵30 d的結(jié)果相比，在最優(yōu)條件下酸溶蛋白相對含量提高了127.6%，抗氧化活性提高了185.8%。

3 討論

限于技術(shù)條件和成本約束，大規(guī)模的豆粕發(fā)酵一般采用生料發(fā)酵。生料發(fā)酵過程中當(dāng)氧氣耗盡時，隨著兼性厭氧菌的大量繁殖，伴隨著pH值的急劇降低(林文輝等，2010)，故發(fā)酵菌種若能在酸性條件下存活，則有利于發(fā)酵過程的進行。本研究采用酸性條件初篩芽孢桿菌，既保證了菌株對酸性條件的適應(yīng)性，又保證了菌株可在厭氧條件下生長繁殖。而篩選出的SD48菌株在酸性條件下可產(chǎn)生75.40 U/ml的蛋白酶活力，這為豆粕中蛋白質(zhì)的降解奠定了基礎(chǔ)。

B.methylotrophicus最早發(fā)現(xiàn)于田間水稻的根際土壤(Munusamy等，2010)；該種細(xì)菌可在胞外產(chǎn)生纖維素酶(吳晶晶等，2014；董丹等，2015)、脂肪酶(徐偉芳等，2017)、蛋白酶(熊濤等，2014)等消化酶。國內(nèi)已有研究人員篩選出該種屬菌株并將其應(yīng)用于發(fā)酵豆粕。熊濤等以透明圈法從豆豉中篩選出1株可在厭氧條件下產(chǎn)生蛋白酶的B.methylotrophicus菌株B-1，采用熟料發(fā)酵的方式，可使豆粕中小肽含量達(dá)到28.37%。唐曉星(2014)篩選到1株兼性厭氧、產(chǎn)蛋白酶的B.methylotrophicus菌株NCU507，發(fā)現(xiàn)與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵時可提高粗蛋白含量，但是會導(dǎo)致小肽含量的降低。

按生產(chǎn)模式，發(fā)酵豆粕可分為淺層發(fā)酵和深層發(fā)酵。淺層發(fā)酵所需發(fā)酵面積大，只能采用淺盤架式生產(chǎn)，機械化難度高，深層發(fā)酵可克服這些缺點，更具研究價值。深層發(fā)酵過程多采用混合菌種，工藝一般較為復(fù)雜。朱平軍采用分階段發(fā)酵模式研究了黑曲霉、枯草芽孢桿菌、酵母菌和植物乳桿菌多菌種固態(tài)生料仿生發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)價值的影響，前48 h用黑曲霉、枯草芽孢桿菌和酵母菌30℃好氧發(fā)酵，后48 h用植物乳桿菌和瘤胃微生物37℃厭氧仿生發(fā)酵，好氧發(fā)酵階段料水比為1∶0.9，厭氧仿生發(fā)酵階段料水比為1∶1.2，發(fā)酵后酸溶蛋白含量可達(dá)20.06%，粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)52.03%。王國強等(2016)采用正交試驗設(shè)計，優(yōu)化了復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕的條件，當(dāng)異常漢遜酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶干酪乳桿菌為2∶2∶1，接種量5%，發(fā)酵時間為48 h時，抗原蛋白降解徹底，酸溶蛋白含量提高了73.9%，有益活菌總數(shù)達(dá)到8.5×108cfu/g。也有單菌株發(fā)酵豆粕粉生料的研究。何勇錦等(2009)采用黏紅酵母發(fā)酵豆粕粉生料，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵坯含水量為50%，厚度為1 cm，添加糖蜜量為5%，發(fā)酵時間為40～44 h時，發(fā)酵豆粕中的小肽含量約為27%。何勇錦等(2012)采用乳酸短桿菌KLDS-1菌株發(fā)酵豆粕生料，當(dāng)發(fā)酵坯含水量為50%、糖蜜3%、接種量35%，于37℃下厭氧發(fā)酵48 h時，發(fā)酵豆粕中的小肽含量達(dá)26.12%。本研究采用B.methylotrophicusSD48菌株深層發(fā)酵豆粕生料，在最優(yōu)條件下，酸溶蛋白相對含量可達(dá)26.24%。

發(fā)酵溫度除影響豆粕發(fā)酵效果外，還會影響到發(fā)酵的成本。本研究篩選的B.methylotrophicusSD48菌株具有可在10℃下生長繁殖的特性，發(fā)酵啟動溫度僅為室溫18℃，發(fā)酵過程未采取保溫措施，可極大的降低生產(chǎn)成本，但發(fā)酵15 d時酸溶蛋白相對含量可達(dá)到21.30%，發(fā)酵30 d時酸溶蛋白相對含量可達(dá)到26.24%，說明可通過提高發(fā)酵溫度及保溫措施來挖掘該菌株的應(yīng)用潛力。

豆粕中含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子會阻礙營養(yǎng)成分的消化、吸收和利用(高美云，2010)。楊玉娟等(2016)抽取了市售的65批次豆粕和54批次發(fā)酵豆粕，采用ELISA法對抗?fàn)I養(yǎng)因子含量進行分析，發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白含量最高，其次是β-伴大豆球蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵豆粕可有效去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(馬靜，2016)。魏鳳仙等(2016)比較了膨化法和微生物發(fā)酵法處理豆粕對抗?fàn)I養(yǎng)因子去除效果的影響，發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵法更適宜于豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除。本研究中SD48菌株可有效去除豆粕中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。

大豆抗氧化肽具有抗疲勞，延緩機體衰老，調(diào)節(jié)機體免疫等多種功能(徐聰聰，2013)。本研究中采用FRAP法測定豆粕的抗氧化活性。FRAP法操作簡便，測定不需要昂貴儀器，該法反映的是樣品總的抗氧化活性(陳玉霞，2011)。本研究采用SD48菌株發(fā)酵豆粕，在最優(yōu)條件下，抗氧化活性為409.63 mg AEAC/100 g，即100 g發(fā)酵豆粕的抗氧化能力相當(dāng)于409.63 mg的維生素C。

4 結(jié)論

篩選出能在酸性條件下生長并在胞外產(chǎn)酸性蛋白酶的B.methylotrophicus菌株SD48，該菌株可極大地提高發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)價值，是一株性能優(yōu)良的發(fā)酵豆粕用菌株。