■毛建紅 富麗霞 周 艷 解 彪 黃文琴 陶 蓮 刁其玉*
(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)
玉米秸稈作為反芻動(dòng)物重要的粗飼料來(lái)源之一,在反芻動(dòng)物日糧中占據(jù)很大的比例,具有來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉的特點(diǎn)。但因其自身復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),直接作為飼料,適口性差、利用率低,在瘤胃中的降解率也較低[1]。近年來(lái),如何提高秸稈類(lèi)低質(zhì)飼草的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和利用率已成為畜牧業(yè)的研究熱點(diǎn)[2-3]。生物制劑作為一種環(huán)保、高效的飼料添加劑深受畜牧業(yè)養(yǎng)殖者的青睞[4-5]。玉米秸稈經(jīng)酶、菌制劑單獨(dú)處理的研究報(bào)道較多,但是對(duì)酶制劑和菌制劑復(fù)合處理玉米秸稈的報(bào)道甚少,為了提高秸稈飼料的利用效率,有效發(fā)揮反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)潛能,有必要對(duì)復(fù)合生物制劑(酶菌)處理后的玉米秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行科學(xué)、有效的評(píng)定[6]。
體外產(chǎn)氣法和半體內(nèi)法是評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值常用的兩種試驗(yàn)方法,但兩種方法在測(cè)定不同的飼料對(duì)象時(shí)各有利弊。半體內(nèi)法也叫尼龍袋法,可以將飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與瘤胃內(nèi)微生物活動(dòng)緊密聯(lián)系起來(lái),充分體現(xiàn)了反芻動(dòng)物的動(dòng)態(tài)消化生理特性,但并不適用于大批量樣品的測(cè)定[7]。體外產(chǎn)氣量在一定程度上代表飼料中可以被動(dòng)物利用的有機(jī)物的含量,由于操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,可進(jìn)行大批量樣品的測(cè)定,是目前國(guó)際上用來(lái)評(píng)定粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法之一。
本文旨在探索不同酶菌制劑處理玉米秸稈,對(duì)干物質(zhì)及粗纖維的降解率;同時(shí)也利用體外產(chǎn)氣法和半體內(nèi)法對(duì)其干物質(zhì)降解率評(píng)定,并進(jìn)行相關(guān)性分析,以期探討利用體外產(chǎn)氣法替代半體內(nèi)法評(píng)定粗飼料干物質(zhì)降解率的可能性,為優(yōu)化評(píng)價(jià)方法提供理論依據(jù)。
原料為玉米秸稈,取自河北省保定市,品種為金玉99,于2016年9月收貨籽實(shí)后收割。采集的玉米秸稈經(jīng)65℃烘干48 h后,一部分粉碎至40目用于營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定和體外產(chǎn)氣試驗(yàn),另一部分粉碎至2 mm粒度后均勻混合,用于半體內(nèi)試驗(yàn)。
酶制劑:復(fù)合酶制劑[纖維素酶(cellulase)+木聚糖酶(xylanase)+β-葡聚糖酶(β-glucanase)]、果膠酶(pectinase)、漆酶(laccase),試驗(yàn)所用復(fù)合酶制劑及酶均購(gòu)自夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,粉末狀,常溫貯存。
菌制劑:植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、布什乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri),菌種保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,菌制劑凍干粉于4℃冰箱保存。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品編號(hào)
本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)處理組,一個(gè)酶制劑處理組(CPL),兩個(gè)酶菌制劑混合處理組(CPLP組和CPLB組),同時(shí)設(shè)置原料對(duì)照組(CON)和青貯對(duì)照組(CS)。
1.3.1 青貯制作
玉米秸稈刈割后,用青貯切碎揉搓機(jī)切短至1~2 cm,按表1的處理組及添加劑量溶于蒸餾水,攪拌,均勻噴灑在粉碎的玉米秸稈上,將水分調(diào)節(jié)至65%~70%。樣品均裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm),每袋1 kg,用真空包裝機(jī)(DZ-280/2SD)抽真空并封口,室溫(25~37℃)貯藏45 d后開(kāi)封取樣。青貯對(duì)照組直接添加蒸餾水,不添加任何生物制劑。另取玉米秸稈原料樣品置于冰盒中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,-20℃貯藏,待檢。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),3個(gè)用于樣品測(cè)定,1個(gè)為備用。
1.3.2 營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定
玉米秸稈的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)參照張麗英[8]的方法測(cè)定,每個(gè)樣品兩個(gè)平行;中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)的測(cè)定參照Van Soest[9]的方法,每個(gè)樣品3個(gè)平行。
1.3.3 體外產(chǎn)氣試驗(yàn)
選用3只體況正常、健康、體重(52.0±2.3)kg、裝有永久瘺管的杜泊×小尾寒羊F1代雜交羯羊,預(yù)飼期7 d,試驗(yàn)期4 d。羊單欄飼喂,自由飲水,每天飼喂2次(8:00和17:00)。于晨飼前1 h通過(guò)瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物,用4層紗布過(guò)濾于已預(yù)熱的39℃保溫瓶?jī)?nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。
體外產(chǎn)氣法參照Menke[10](1988)方法。發(fā)酵采用DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器裝置,稱(chēng)取約200.00 mg樣品,使用長(zhǎng)紙條送入已涂抹凡士林的玻璃注射器中進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗(yàn),每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),并設(shè)置3支空白管。采用Menke[10]的方法配制人工瘤胃液,并將人工瘤胃液與瘤胃液按體積比2∶1混合,作為培養(yǎng)液。通入CO2,同時(shí)用分液器向培養(yǎng)管中分裝30.00 ml培養(yǎng)液,排除氣泡,放置39℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并計(jì)時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)至0、6、12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)時(shí),取培養(yǎng)管快速讀取活塞所處的刻度值并記錄。
1.3.4 半體內(nèi)試驗(yàn)(尼龍袋技術(shù))
選用6只體況正常、健康、體重(52.0±2.3)kg、裝有永久瘺管的杜泊×小尾寒羊F1代雜交羯羊,隨機(jī)分為2組,每組3只羊,每只羊?yàn)?個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)羊單圈飼養(yǎng),每日基礎(chǔ)日糧供給量日糧精粗比為40∶60。每日于8:00和17:00飼喂兩次,共1 200 g,自由飲水,預(yù)試期7 d?;A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g不同處理的玉米秸稈青貯粉末,裝入已知重量的10 cm×6 cm尼龍袋(孔徑48 μm)中,每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行,放置72 h后取出[11]。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只羊。
1.4.1 體外法產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)
a.某一時(shí)間段培養(yǎng)管累計(jì)凈產(chǎn)氣量
凈產(chǎn)氣量=某一時(shí)間段產(chǎn)氣量-對(duì)應(yīng)時(shí)間段內(nèi)3支空白管的平均產(chǎn)氣量。
表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
b.體外法瘤胃干物質(zhì)降解率計(jì)算
瘤胃干物質(zhì)降解率(%)=(樣本干物質(zhì)重-殘?jiān)晌镔|(zhì)重+空白干物質(zhì)重)÷樣本干物質(zhì)重×100。
c.產(chǎn)氣模型計(jì)算公式
Y=B(1-e-ct)。
式中:Y——t時(shí)間點(diǎn)200.00 mg干物質(zhì)樣本累積產(chǎn)氣量(ml);
B——200.00 mg干物質(zhì)樣本的理論最大產(chǎn)氣量(ml);
c——200.00 mg干物質(zhì)樣本的產(chǎn)氣速度(h)。
1.4.2 半體內(nèi)法瘤胃降解率測(cè)定及降解參數(shù)的計(jì)算方法
a.DM不同時(shí)間點(diǎn)的降解率
A(%)=(B-C)/B×100。
式中:A——待測(cè)飼料的某種營(yíng)養(yǎng)成分瘤胃消失率(%);
B——待測(cè)樣品中某種營(yíng)養(yǎng)成分含量(g);
C——待測(cè)樣品尼龍袋殘?jiān)心撤N營(yíng)養(yǎng)成分含量(g)[12]。
b.DM降解參數(shù)及有效降解率
參照Фrskov等[13]提出的瘤胃動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型,計(jì)算降解率:
dP=a+b(1-e-ct)。
式中:dP——待測(cè)飼料的DM瘤胃某一時(shí)間的降解率(%);
a——快速降解部分(%);
b——慢速降解部分(%);
c——慢速降解部分的降解速率常數(shù)(%/h);
t——瘤胃內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間(h)。
有效降解率(ED,%)=a+bc/(k+c)。
式中:k——瘤胃外流速率,本試驗(yàn)中k值取0.031/h[14]。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel 2007初步整理以后,采用SPSS19.0的One-way ANOVA程序?qū)τ衩捉斩挼臓I(yíng)養(yǎng)成分、產(chǎn)氣量及瘤胃降解率進(jìn)行方差分析,P<0.05表示差異顯著。
表3 玉米秸稈及玉米秸稈生物處理后的營(yíng)養(yǎng)成分
表3為不同處理的有效成分含量,可以看出DM含量以青貯對(duì)照組(CS)最低,各酶菌復(fù)合制劑組均顯著高于青貯對(duì)照組(P<0.05),其中以CPLB組的DM含量最高。與CON組相比,各處理組均顯著降低了NDF、ADF的含量,CS組、CPL組、CPLP組和CPLB組的NDF含量分別降低了21.97%、21.83%、31.35%、31.55%,ADF含量分別降低了20.65%、22.07%、31.06%、31.30%,其中CS組與CPL組差異不顯著(P>0.05),CPLP組與CPLB組差異不顯著,CPLB組與CPLP組顯著低于CS組和CPL組(P<0.05)。
表4 玉米秸稈及玉米秸稈生物處理后的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)及體外干物質(zhì)降解率
從表4可以看出,各處理組0~72 h各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。CPLP組在各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均是最大,CPLB組次之,但二者差異不顯著(P>0.05)。CPL組在0~12 h的產(chǎn)氣量顯著高于CS組(P<0.05)。各處理組72 h的累計(jì)產(chǎn)氣量從多到少依次為CPLP>CPLB>CPL>CS>CON,產(chǎn)氣量分別為52.33、50.17、44.33、42.50、32.17 ml。理論最大產(chǎn)氣量也以CPLP組最高(50.10 ml),與CPLB組(48.54 ml)差異不顯著(P>0.05),與CPL組、CS組、CON組差異顯著(P<0.05),體外產(chǎn)氣速度由快至慢依次為CPLB>CPLP>CPL>CS>CON。
各酶菌處理組IVDMD24h和IVDMD48h均顯著高于CON組(P<0.05),CPLB組最高,其與CPLP組差異不顯著(P>0.05)。CPLP組和CPLB組顯著高于CS組、CPL組和CON組(P<0.05),CS組與CPL組的IVDMD24h差異不顯著(P>0.05),但CS組IVDMD48h顯著高于CPL組(P<0.05)。
表5 玉米秸稈及玉米秸稈生物處理后的干物質(zhì)降解率及有效降解率(%)
從表5可以看出,各處理組的DM降解率隨著在瘤胃中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。CPLB處理組的DMD72h比CON、CS、CPL的降解率依次提高了41.80%、15.26%、23.69%,CPLB組和CPLP組的DMD72h、瘤胃有效降解率互相接近(P>0.05),均顯著高于CPL組、CS組、CON組(P<0.05);CPL組與CS組的瘤胃有效降解率差異均不顯著(P>0.05)。0~6 h時(shí),CPLB組的瘤胃降解率最大,為37.15%,顯著高于CPL組、CS組、CON組(P<0.05),與CPLP組差異不顯著。在6~48 h,CON、CS、CPL、CPLP組降解變化明顯,72 h時(shí)基本穩(wěn)定。
表6 瘤胃干物質(zhì)降解率與產(chǎn)氣量及體外干物質(zhì)降解率的相關(guān)性
從表6可以看出,各處理組的DMD24h和DMD48h與 GP24h、GP48h、IVDMD24h及 IVDMD48h均具有極顯著的相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。比較分析表明,DMD24h與GP24h相關(guān)系數(shù)為0.827;DMD24h與IVDMD24h的相關(guān)系數(shù)為0.751;DMD24h與GP48h的相關(guān)系數(shù)為0.847;DMD24h與IVDMD48h的相關(guān)系數(shù)為0.745;DMD48h與GP24h的相關(guān)系數(shù)為0.804;DMD48h與IVDMD24h的相關(guān)系數(shù)為0.828;DMD48h與GP48h的相關(guān)系數(shù)為0.842;DMD48h與IVDMD48h的相關(guān)系數(shù)為0.830。
由于秸稈細(xì)胞壁復(fù)雜的抗降解結(jié)構(gòu),往往單一的降解酶系或菌對(duì)秸稈的降解時(shí)間較長(zhǎng)且不徹底,應(yīng)用酶菌復(fù)合制劑處理秸稈,可以較大程度的發(fā)揮生物制劑的協(xié)同作用,達(dá)到快速降解秸稈纖維的目的[15]。本研究中,經(jīng)過(guò)復(fù)合生物處理后,各處理組均不同程度的降低了玉米秸稈中的NDF和ADF的含量。Wang等[16]研究報(bào)道,添加外源纖維素酶可以增加瘤胃微生物的活性,提高飼料消化率和動(dòng)物生產(chǎn)性能。植物乳酸菌和布氏乳桿菌可以提高青貯過(guò)程中活菌數(shù)量,有利于青貯發(fā)酵品質(zhì)。李靜[17]研究發(fā)現(xiàn),青貯水稻秸稈中添加乳酸菌和纖維素酶復(fù)合制劑,處理效果優(yōu)于單獨(dú)添加乳酸菌或纖維素酶處理,可使NDF和ADF含量分別降低3.61%和3.05%。飼料中的粗蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。本研究中,經(jīng)過(guò)生物處理后的玉米秸稈,CP含量均有下降,這可能是由于青貯發(fā)酵過(guò)程中消耗了一部分CP導(dǎo)致。陶蓮等[11]認(rèn)為玉米秸稈青貯后CP含量下降是由于NH3-N含量提高所致。王玉榮[4]應(yīng)用復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理水稻秸稈,其測(cè)定的CP含量明顯低于對(duì)照組,本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。
通常情況下,體外產(chǎn)氣量可以在某種程度上反映飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中的降解特性。本研究中,72 h產(chǎn)氣量和理論最大產(chǎn)氣量以CPLP組最大,顯著高于CON組、CS組和CPL組,與CPLB組差異不顯著。飼料中可利用的有機(jī)物含量越多,瘤胃的產(chǎn)氣量就越高。經(jīng)過(guò)生物處理,秸稈的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被有效地保存下來(lái),酶菌復(fù)合制劑作用于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),破壞了纖維素-半纖維素-木質(zhì)素形成的頑固的抗降解結(jié)構(gòu),增加了瘤胃微生物附著的比表面積[15]。CON對(duì)照組的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率都明顯低于其他處理組,這是由于秸稈在自然保存的狀態(tài)下,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失,可發(fā)酵利用的有機(jī)物質(zhì)較少導(dǎo)致。但是產(chǎn)氣量并不能直接衡量飼料之間的降解程度,還需結(jié)合DM和NDF降解率等指標(biāo)綜合評(píng)定飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[18]。體外干物質(zhì)消失率可以反映飼料消化的難易程度[19]。本研究中,24 h和48 h的體外干物質(zhì)降解率均為CPLB組高于其他處理組,但與CPLP組差異不顯著。CPL組體外干物質(zhì)降解率在24 h時(shí)與CS組差異不顯著,在48 h顯著低于CS組,但是產(chǎn)氣速率明顯高于CS組,這可能是由于底物中可利用的有機(jī)物質(zhì)在發(fā)酵前期與瘤胃微生物充分反應(yīng)導(dǎo)致。Salem等[20]研究表明,纖維素酶和木聚糖酶混合處理玉米青貯,可以提高體外產(chǎn)氣量和體外干物質(zhì)降解率。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈青貯中添加植物乳桿菌,可以提高青貯發(fā)酵品質(zhì)并且提高了體外干物質(zhì)降解率,本研究結(jié)果與其一致。
瘤胃DM降解率是影響干物質(zhì)采食量(DMI)的一個(gè)主要因素,且DM降解率與DMI存在正相關(guān)關(guān)系。DM降解率高,則有利于生產(chǎn)性能的發(fā)揮,同一種飼料在瘤胃中停留時(shí)間長(zhǎng),則降解率較高,反之,則降解率較低[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)酶菌復(fù)合制劑處理組(CPLP、CPLB組)處理后的玉米秸稈DM瘤胃降解率顯著高于復(fù)合酶制劑處理組(CPL)及玉米秸稈青貯對(duì)照組(CS)。Patel等[23]研究報(bào)道,添加外源纖維素酶可以破壞細(xì)胞壁的β-1,4糖苷鍵,提高纖維飼料的瘤胃降解率。門(mén)宇新[24]利用尼龍袋法測(cè)定水稻青貯的DM降解率,發(fā)現(xiàn)隨著乳酸菌制劑用量的增加,水稻青貯飼料的DM降解率呈上升趨勢(shì)。王玉榮[4]研究表明,尼龍袋試驗(yàn)中添加復(fù)合酶菌制劑可以顯著提高水稻秸稈72 h DM降解率,原因是酶菌復(fù)合處理玉米秸稈,使其纖維結(jié)構(gòu)破壞,秸稈軟化,使得微生物更易利用。
體外產(chǎn)氣法測(cè)得的產(chǎn)氣量是基于秸稈中可發(fā)酵物質(zhì)所得的結(jié)果,底物中碳水化合物越多,產(chǎn)氣量越高;尼龍袋法測(cè)定的DM降解率與秸稈飼料中可消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在一定的相關(guān)性,兩種試驗(yàn)方法在評(píng)定飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)存在一致性。本試驗(yàn)中,通過(guò)半體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定的DM降解率和體外產(chǎn)氣試驗(yàn)測(cè)定的產(chǎn)氣量綜合分析,CPLB組與CPLP組效果最好。經(jīng)相關(guān)性分析,玉米秸稈DMD24h、DMD48h分別與GP24h、GP48h、IVDMD24h、IVDMD48h存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。洪金鎖等[25]對(duì)青海燕麥青干草飼養(yǎng)價(jià)值的研究中也表明,半體內(nèi)法和體外產(chǎn)氣法測(cè)得的干物質(zhì)降解率呈正相關(guān)關(guān)系,得出相關(guān)系數(shù)R2=0.98。本試驗(yàn)中,DMD24h與IVDMD24h、IVDMD48h的相關(guān)系數(shù)為0.751、0.745,DMD48h與IVDMD24h、IVDMD48h的相關(guān)系數(shù)為0.828、0.830。靳玲品[26]研究表明,粗飼料24 h體外消化率與其24 h瘤胃消失率呈顯著正相關(guān)關(guān)系,但結(jié)果偏低,可能是因?yàn)闃悠房扇艿牟糠只蝾w粒過(guò)小從尼龍袋逃逸導(dǎo)致。謝春元等[27]研究表明,半體內(nèi)試驗(yàn)和體外產(chǎn)氣試驗(yàn)各有利弊,彼此的相關(guān)性受飼料類(lèi)型的影響。本研究中發(fā)酵底物均為玉米秸稈,所以?xún)煞N試驗(yàn)方法測(cè)得的結(jié)果相關(guān)性較高。張文璐等[28]運(yùn)用體外產(chǎn)氣法和半體內(nèi)法評(píng)定玉米秸稈干物質(zhì)降解率的研究中表明,體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)干物質(zhì)降解率呈高度正相關(guān)。本研究中,DMD24h與GP24h和GP48h的相關(guān)系數(shù)為0.827、0.847,DMD48h與 GP24h和 GP48h的相關(guān)系數(shù)為0.804、0.842,呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明可以用體外產(chǎn)氣法替代半體內(nèi)法來(lái)評(píng)價(jià)玉米秸稈品質(zhì)。
①玉米秸稈經(jīng)過(guò)酶菌生物制劑處理后,有效降低了秸稈中NDF、ADF的含量,有效地改善了玉米秸稈的品質(zhì)。
②酶菌復(fù)合制劑處理后(CPLP、CPLB)的玉米秸稈,體外產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)降解率、半體內(nèi)干物質(zhì)降解率均顯著高于青貯對(duì)照組(CS),說(shuō)明酶菌復(fù)合制劑處理后,玉米秸稈中可利用的有機(jī)物增多,秸稈利用率得到提高。
③ DMD24h、DMD48h分別與GP24h、GP48h、IVDMD24h、IVDMD48h存在極顯著正相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明體外產(chǎn)氣法和半體內(nèi)法測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果存在高度相關(guān)性,用體外產(chǎn)氣法替代半體內(nèi)法來(lái)評(píng)價(jià)玉米秸稈的有效成分降解率是可行的。