固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法同時測定海洋沉積物中16種除草劑

徐英江，韓典峰，黃會，喬丹，董曉曉，張華威，劉慧慧，張秀珍*

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006； 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法同時測定海洋沉積物中16種除草劑

徐英江1，韓典峰1，黃會1，喬丹2，董曉曉1，張華威1，劉慧慧1，張秀珍1*

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006； 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

建立了同時測定海洋沉積物中16種除草劑的固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯-二氯甲烷(3∶2；V/V)混合溶液提取，濃縮，甲醇復(fù)溶，加入純水稀釋，過HLB固相萃取柱富集、凈化，洗脫液氮吹濃縮，乙酸乙酯定容上機，用氣相色譜質(zhì)譜儀(GC/MS)選擇離子監(jiān)測模式定性定量分析，外標(biāo)法定量。方法中二甲戊樂靈、草凈津檢出限為1.5 μg/kg，其余14種除草劑檢出限均為0.8 μg/kg；二甲戊樂靈、草凈津線性范圍為4.0～200.0 μg/L，其余14種除草劑線性范圍均為2.0～100.0 μg/L；方法加標(biāo)回收率為74.2%～97.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.83%～11.6%。該方法靈敏準(zhǔn)確，適用于海洋沉積物中16種除草劑的定性定量檢測，對加強漁業(yè)生態(tài)環(huán)境保護提供技術(shù)支持。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(3):34-40]

除草劑；沉積物；固相萃??；氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)

除草劑是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的一種農(nóng)藥。自首例化學(xué)合成除草劑2,4-D問世以來，有機除草劑種類不斷增加，中國農(nóng)藥市場也先后有近百種除草劑產(chǎn)品，其中主要以三嗪類、酰胺類、磺酰脲類和苯氧羧酸類為主[1]。除草劑的大規(guī)模使用，可對漁業(yè)水質(zhì)、沉積物和生物體造成不利影響，甚至引發(fā)生態(tài)安全和食品安全問題。有研究表明水體和土壤中的丁草胺、乙草胺和芐嘧磺隆的殘留可對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和生態(tài)環(huán)境造成破壞[2-3]；三氮苯類除草劑阿特拉津可在環(huán)境水體和土壤中長期殘留，對貝類神經(jīng)毒性指示物乙酰膽堿酯酶等有一定影響[4]，并可顯著降低大葉藻幼苗的總?cè)~綠素含量[5]；二硝基苯胺類除草劑二甲戊樂靈[6-7]可對大馬哈魚抗氧化體系和免疫系統(tǒng)造成破壞。

目前，國內(nèi)外對除草劑的檢測方法主要有氣相色譜法[8]、液相色譜法[9-10]、氣相色譜質(zhì)譜法[11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12]等，常用的提取凈化方法有液液萃取[13]、固相萃取[14-15]、凝膠色譜凈化[16-17]等方法。相對于傳統(tǒng)的氣相色譜法和液相色譜法，質(zhì)譜分析方法前處理條件簡單，選擇性好，檢測限低，而其中氣相色譜質(zhì)譜儀維護簡單，使用成本較低，廣泛用于痕量檢測中。本研究經(jīng)超聲提取和固相萃取凈化，采用氣相色譜質(zhì)譜法測定海洋沉積物中16種除草劑含量，方法操作簡單，靈敏準(zhǔn)確，能滿足海洋沉積物中除草劑殘留檢測的要求，可為加強漁業(yè)生態(tài)環(huán)境保護，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

6890 N/5973 N氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；ASPEC GX-274自動固相萃取儀(法國Gilson公司)；N-EVAPTM112氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；Milli-Q Gradient超純水儀(美國Millipore公司)；KQ-600E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、丙酮、正己烷(均為色譜級，德國Merck公司)；HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)；C18固相萃取柱(500 mg/3 mL，美國Varian公司)；石墨化碳柱(500 mg/6 mL，美國Agilent公司)；氨基柱(500 mg/3 mL，德國CNW公司)；實驗用水均為超純水。

撲滅津(propazine)、阿特拉津(atrazine)、特丁津(terbuthylazine)、西瑪津(simazine)、乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、環(huán)草津(cyprazine)、敵草凈(desmetryn)、撲草凈(prometryn)、莠滅凈(ametryn)、異丙甲草胺(me-tolachlor)、西草凈(simetryn)、二甲戊樂靈(pendimethalin)、丁草胺(butachlor)、草凈津(cynazine)和丙草胺(pretiachlor)等16種標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.010 g 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容至100 mL，配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用前用乙酸乙酯稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2 樣品的前處理

實驗用沉積物樣品采自黃河口鄰近海域，為粉砂質(zhì)。稱取3.0 g(精確至0.01 g)冷凍干燥后的樣品于50 mL離心管中，加入乙酸乙酯-二氯甲烷(3∶2，V/V)混合溶液25 mL，漩渦混勻30 s，超聲提取20 min，4 500 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)至150 mL雞心瓶中，再加入乙酸乙酯-二氯甲烷(3∶2，V/V)混合溶液20 mL重復(fù)提取一次，合并上清液。將提取液于40 ℃下旋蒸至干，加入甲醇1 mL復(fù)溶，再加入純水20 mL混勻，用自動固相萃取儀過HLB小柱(甲醇3 mL、純水5 mL活化)進行富集，然后用純水5 mL淋洗，正己烷-丙酮(1∶1，V/V)混合溶液5 mL洗脫，洗脫液于氮吹儀上40 ℃吹至近干，乙酸乙酯1 mL定容，過0.22 μm濾膜后上機。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為J&W DB-17石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣(高純He)流速為1.0 mL/min；進樣口溫度為260 ℃，不分流進樣，進樣量為1 μL；升溫程序：50 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至240 ℃，最后以30 ℃/min升至300 ℃，保持3 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量為70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲10 min；選擇離子監(jiān)測模式(SIM)。

表1 16種除草劑的保留時間、定性離子和定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

氣相色譜法的分離是利用要待測組分在流動相(載氣)和固定相兩相間的分配差異(即不同的分配系數(shù))來實現(xiàn)的，DB-17毛細(xì)管柱固定相為(50% 苯基)-甲基聚硅氧烷，為中等極性，是理想的驗證分析用色譜柱，本研究所檢測的除草劑組分大部分為極性化合物，故嘗試采用DB-17毛細(xì)管柱。

2.1.2 色譜質(zhì)譜條件的確定

在掃描(SCAN)模式下進樣，對每種除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進行掃描，得到每種除草劑的保留時間和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息，選擇干擾少、豐度高、碎片質(zhì)量大的離子作為特征離子(表1)；繼續(xù)使用SCAN模式對16種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行掃描，優(yōu)化每種除草劑的保留時間和特征離子，再根據(jù)樣品基質(zhì)干擾情況對所選擇的特征離子進一步優(yōu)化，以豐度高、沒有干擾的離子作為定量離子，建立選擇離子監(jiān)測(SIM)方法(圖1)；SIM模式可在特定時間區(qū)間內(nèi)只對目標(biāo)化合物的特征離子進行掃描，用于定量分析，可有效提高方法的靈敏度。

圖1 16種除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(40.0 μg·L-1)選擇離子監(jiān)測總離子流圖Fig.1 Total ions chromatogram of 16 herbicides standard solutions (40.0 μg·L-1) in SIM mode

2.2 提取試劑的選擇

已有研究[18-21]表明，用于除草劑的提取試劑主要有乙酸乙酯、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等，不同的樣品基質(zhì)、不同的目標(biāo)物，提取劑的種類也不同。沉積物樣品成分復(fù)雜，用極性溶劑乙腈或丙酮提取，提取液中會含有較多雜質(zhì)，后期凈化困難，因此選用弱極性的乙酸乙酯、二氯甲烷進行提取實驗。結(jié)果表明，乙酸乙酯對三嗪類除草劑提取效果好，但部分酰胺類除草劑的回收率不能滿足要求；二氯甲烷對酰胺類和二硝基苯胺類除草劑提取效果較好，而部分三嗪類除草劑回收率低。因此，嘗試采用乙酸乙酯、二氯甲烷混合溶劑進行提取，經(jīng)實驗，采用乙酸乙酯-二氯甲烷(3∶2，V/V)混合溶液提取得到了很好的效果。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

固相萃取是一種基于色譜分離的樣品前處理技術(shù)，通過選擇適當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈斑^柱方法，使目標(biāo)物得到有效的富集和凈化。本方法對C18柱、HLB柱、石墨化碳串聯(lián)氨基柱3種固相萃取柱萃取沉積物中16種除草劑的效果進行比較。3種固相萃取柱對16種除草劑均有保留；但C18柱對部分除草劑的回收率較低，石墨化碳串聯(lián)氨基柱使用不方便且成本較高；而HLB固相萃取柱填料是一種新型大孔聚合物，既有親脂性的官能團，具有反相吸附特性，又有親水性的官能團，具備保留極性化合物的能力，對本研究中的16種除草劑均有較好的吸附和回收，故選作本方法固相萃取柱。甲醇是反相柱良好的洗脫劑，可以在三嗪類除草劑的檢測中用作固相萃取的洗脫劑，因此樣品復(fù)溶后過HLB柱時，較高比例的甲醇會使目標(biāo)物在過柱過程中損失，本實驗加入一定量的純水稀釋，使甲醇的含量為1%～5%[22]，保證了目標(biāo)物的回收率。

2.4 線性關(guān)系

分別配制不同質(zhì)量濃度的16種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中二甲戊樂靈、草凈津標(biāo)準(zhǔn)系列濃度依次為4.0、10.0、50.0、100.0和200.0 μg/L，其余14種除草劑標(biāo)準(zhǔn)系列濃度依次為2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L。將標(biāo)準(zhǔn)序列用優(yōu)化后的SIM方法上機測定，得到16種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液序列的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(表2)。

2.5 方法的檢出限、回收率和精密度

在空白沉積物樣品中添加除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用本研究中確定的方法進行檢測分析，以GC/MS信噪比≥3作為檢出限，得出本方法檢出限：二甲戊樂靈、草凈津為1.5 μg/kg，其余14種除草劑均為0.8 μg/kg。

采用本研究所建立的方法，分別在二甲戊樂靈、草凈津為2.0、10.0和50.0 μg/kg 3個水平，其余14種除草劑為1.0、5.0和25.0 μg/kg 3個水平下進行空白樣品加標(biāo)回收實驗，每個水平設(shè)5個平行。結(jié)果顯示，16種除草劑平均回收率在74.2%～97.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.83%～11.6%(表3)。沉積物空白樣品和加標(biāo)樣品譜圖見圖2。

表2 16種除草劑的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

表3 16種除草劑加標(biāo)水平、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

續(xù)表3 Tab.3 continued

圖2 沉積物樣品空白譜圖(A)和加標(biāo)(15.0 μg·kg-1)譜圖(B)1：撲滅津；2：阿特拉津；3：特丁津；4：西瑪津；5：乙草胺；6：甲草胺；7：環(huán)草津；8：敵草凈；9：撲草凈；10：莠滅凈；11：異丙甲草胺；12：西草凈；13：二甲戊樂靈；14：丁草胺；15：草凈津；16：丙草胺。Fig.2 Chromatograms of blank (A) and spiked (B, 15.0 μg·kg-1) sample of sediment1: Propazine; 2: Atrazine; 3: Terbuthylazine; 4: Simazine; 5: Acetochlor; 6: Alachlor;7: Cyprazine; 8:Desmetryn; 9: Prometryn; 10: Ametryn; 11: Me-tolachlor; 12: Simetryn; 13: Pendimethalin;14: Butachlor; 15:Cynazine; 16: Pretiachlor.

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定海洋沉積物中撲滅津、阿特拉津、特丁津、西瑪津、環(huán)草津、敵草凈、撲草凈、莠滅凈、異丙甲草胺、西草凈、草凈津、二甲戊樂靈、甲草胺、乙草胺、丁草胺和丙草胺的固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜檢測方法。二甲戊樂靈、草凈津檢出限為1.5 μg/kg，其余14種除草劑檢出限均為0.8 μg/kg；二甲戊樂靈、草凈津線性范圍為4.0～200.0 μg/L，其余14種除草劑線性范圍均為2.0～100.0 μg/L；方法平均回收率在74.2%～97.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.83%～11.6%。該方法操作簡單，快速準(zhǔn)確，適用于海洋沉積物中16種除草劑的定性定量檢測。

[1] 梁麗娜，郭平毅，李奇峰. 中國除草劑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、面臨問題及發(fā)展趨勢[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21(10): 321-323.

[2] 徐蔣來，胡乃娟，張政文，等. 兩種除草劑對稻田土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響[J]. 水土保持通報，2015，35(4): 168-171.

[3] 羅方方，王艷君，葉玫，等. 氣相色譜質(zhì)譜法測定漁業(yè)水質(zhì)中8種除草劑的殘留量[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，2015，36(4): 132-138.

[4] Campillo J A, Albentosa M, Valdes N J, et al. Impact assessment of agricultural inputs into a mediterranean coastal lagoon on transplanted clams by biochemical and physiological responses [J]. Aquat Toxicol, 2013, 142～143: 365-379.

[5] Gao Y, Fang J, Zhang J, et al. The impact of the herbicide atrazine on growth and photosynthesis of seagrass,zosteramarina, seedlings [J]. Mar Pollut Bull, 2011, 62: 1628-1631.

[6] Danion M, Floch S L, Lamour F, et al. Effects ofinvivochronic exposure to pendimethalin/ prowl 400?on sanitary status and the immune system in rainbow trout [J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2014, 99: 21-27.

[7] Danion M, Floch S L, Kanan R, et al. Effects ofinvivochronic exposure to pendimethalin on erod activity and antioxidant defenses in rainbow trout [J]. Sci Total Environ, 2012, 424: 143-152.

[8] 李衛(wèi)建，聶志強，蔡彥明，等. 氣相色譜法同時測定土壤中13種三嗪類除草劑殘留量的方法研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28(1): 211-215.

[9] 李愛強，陳軍，張宗祥. 高效液相色譜法測定土壤中三嗪類除草劑[J]. 環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2008，20(3): 44-46.

[10] 楊志富，高川，韋婧，等. 固相萃取-高效液相色譜法同時檢測土壤中4種咪唑啉酮類除草劑殘留[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2014，16(4): 433-438.

[11] Camino-S F J, Zafra-G A Z, Perez-T J P, et al. Validation of a GC-MS/MS method for simultaneous determination of 86 persistent organic pollutants in marine sediments by pressurized liquid extraction followed by stir bar sorptive extraction [J]. Chemosphere, 2011, 84: 869-881.

[12] 平華，馬智宏，王紀(jì)華，等. 分散固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定土壤中12種除草劑殘留[J]. 農(nóng)藥，2015， 54(2): 122-125.

[13] 王曉春， 劉慶龍， 楊永亮. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定土壤中31種三嗪類除草劑殘留[J]. 分析化學(xué)研究報告，2014， 42(3): 390-396.

[14] Xu X, Yang H, Wang L, et al. Analysis of chloroacetanilide herbicides in water samples by solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry [J]. Anal Chim Acta, 2007, 591: 87-96.

[15] 任傳博， 田秀慧， 張華威， 等. 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水中13種三嗪類除草劑殘留[J]. 質(zhì)譜學(xué)報， 2013， 34(6): 353-361.

[16] 張華威， 劉慧慧， 田秀慧， 等. 凝膠色譜-固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中9種三嗪類除草劑[J]. 質(zhì)譜學(xué)報， 2014，35(4): 379-386.

[17] 陳溪， 劉夢遙， 曲世超， 等. 海產(chǎn)品、底泥、海水中撲草凈藥物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測[J]. 化學(xué)通報， 2013，76(2): 183-186.

[18] Song L J, Xu M J. Detection of sulfonylurea and sulfamide herbicide in soil by LC-MS/MS [J]. Forensic Sci Technol, 2015, 40(5): 382-387.

[19] 王鐵龍， 胡繼業(yè). 土壤和水體中20種除草劑的氣相色譜質(zhì)譜法多殘留分析[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報， 2012，14(6): 629-634.

[20] 張新忠， 馬曉東， 張偉國， 等. 氣相色譜化學(xué)電離二級質(zhì)譜法測定土壤中16種三嗪類除草劑殘留[J]. 分析化學(xué)， 2008，36(6): 781-787.

[21] Rodrigue G N, Gonzalez C M J, Beceiro G E, et al. Determination of triazine herbicides in seaweeds: development of a sample preparation method based on matrix solid phase dispersion and solid phase extraction clean-up [J]. Talanta, 2014, 121: 194-198.

[22] 陳小華， 汪群杰. 固相萃取技術(shù)與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2010：136-137.

Simultaneous determination of 16 herbicides in marine sediments by SPE-GC/MS

XU Yingjiang1, HAN Dianfeng1, HUANG Hui1, QIAO Dan2, DONG Xiaoxiao1,ZHANG Huawei1, LIU Huihui1, ZHANG Xiuzhen1*

(1. Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute,Yantai 264006, China;2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A method for determination of 16 herbicides in marine sediments by solid phase extraction-gas chromatography mass spectrometry was established. The samples were extracted with ethyl acetate and dichloromethane (3∶2,V/V). The extracts were evaporated to dry, dissolved by 1 mL methanol, and diluted by 20 mL water. Then the diluents were loaded to the HLB solid phase extraction cartridges, and the elutions were evaporated to dry at 40 ℃ by nitrogen blow. The analytes were dissolved with 1 mL ethyl acetate and determined by GC/MS in selected ion monitoring (SIM) mode. Pendimethalin and cynazine showed good linearity in the range of 4.0～200.0 μg/L, and the detection limits were 1.5 μg/kg. The other 14 herbicides showed good linearity in the range of 2.0～100.0 μg/L, and the detection limits are 0.8 μg/kg. The average recoveries ranged from 74.2%～97.3% with relative standard deviations from 5.83%～11.6%. In conclusion, the method is sensitive and accurate, suitable for the determination of 16 herbicides in marine sediments, and can provide technical support for the protection of fishery environment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(3):34-40]

herbicides; sediments; solid phase extraction (SPE); gas chromatography mass spectrometry (GC/MS)

ZHANG Xiuzhen, zxz0535501@126.com

2016-01-16；接收日期：2016-03-25

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(SDAIT-19，SDAIT-26)；山東省水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位項目(2007—2012)

徐英江(1979-)，男，碩士，副研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全和海洋環(huán)境監(jiān)測研究，xuyingjiang@yeah.net 通信作者：張秀珍，研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)化，zxz0535501@126.com

S94

A

2095-1833(2016)03-0034-07