高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留

鄒紅梅, 左舜宇，黃東仁，牛曰華，康建平，張?zhí)炻?/p>

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留

鄒紅梅, 左舜宇，黃東仁，牛曰華，康建平，張?zhí)炻?

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

建立了同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品用乙酸乙酯提取，經(jīng)凈化、濃縮和定容后，以水、乙腈為流動(dòng)相，用Kinetex -C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 2.6 μm)分離，采用ESI源、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。方法的定量限為0.728～2.140 μg/kg。在10～100 μg/kg加標(biāo)水平范圍內(nèi)，回收率為75%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.49%～9.92%。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高，可用于水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留的定量檢測(cè)。 [中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(2):45-50]

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；雄激素；糖皮質(zhì)激素；水產(chǎn)品；殘留

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，水產(chǎn)品在人們生活中所占比例越來(lái)越大，激素化合物由于能提高飼料轉(zhuǎn)化率并促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)而被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[1-3]，然而殘留在水產(chǎn)品中的激素對(duì)人體健康具有潛在的致癌性等危害[3]，同時(shí)這些激素在體內(nèi)可以通過(guò)不同的酶相互轉(zhuǎn)化，作用到人體各個(gè)神經(jīng)和組織，然后通過(guò)調(diào)節(jié)各種組織細(xì)胞的代謝活動(dòng)來(lái)影響人體的生理活動(dòng)[4]。雄激素和糖皮質(zhì)激素為最主要的兩大類(lèi)激素，其中雄激素是一類(lèi)含有環(huán)戊烷多氫菲基本骨架的化合物[1]，在養(yǎng)殖業(yè)中用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高蛋白轉(zhuǎn)化率。研究表明，雄激素間接被人攝入后，會(huì)干擾人體內(nèi)自然激素的平衡，因此中國(guó)、歐盟明確規(guī)定在飼料中禁止使用雄激素藥物[5]。糖皮質(zhì)激素為類(lèi)固醇類(lèi)化合物[3]，具有很好的抗炎作用，但長(zhǎng)期食用會(huì)破壞機(jī)體的防衛(wèi)系統(tǒng)和抑制免疫反應(yīng)能力，并可直接危及人的生命，中國(guó)規(guī)定了糖皮質(zhì)激素化合物在動(dòng)物性源性食品中的最大殘留量[6]。

目前，雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留常用的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-16]。其中，酶聯(lián)免疫法容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)及假陽(yáng)性；液相色譜法抗干擾能力差，且靈敏度不能滿(mǎn)足檢測(cè)要求；GC-MS法具有高靈敏度和選擇性，但通常需要進(jìn)行耗時(shí)長(zhǎng)的衍生化處理才能進(jìn)行測(cè)定；LC-MS/MS法所涉及的檢測(cè)樣品主要是牛肉[12]、雞肉[16]、血清[15]、廢水[14]，而且檢測(cè)激素種類(lèi)少，只有對(duì)雄激素或糖皮質(zhì)激素某一類(lèi)激素的檢測(cè)，沒(méi)有雄激素和糖皮質(zhì)激素同時(shí)檢測(cè)方法的研究。因此，綜合考慮靈敏度、穩(wěn)定性、工作效率等各種因素，選用LC-MS/MS作為本實(shí)驗(yàn)的首選檢測(cè)方法，建立了同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素殘留的新方法，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，且前處理簡(jiǎn)單，同時(shí)也為其他動(dòng)物源性食品中的獸藥多殘留分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀Agilent 1200-Agilent 6410，配備電噴霧離子源(ESI源)；3-30K高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS5渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)等。

標(biāo)準(zhǔn)品：睪酮( Testosterone, TS )，CAS號(hào)58-22-0；甲基睪酮( Methoxytestosterone，MTS)，CAS號(hào)58-18-4；諾龍(Nandrolone，NT)，CAS號(hào)434-22-0；地塞米松(Dexamethasone，DX)，CAS號(hào)50-02-2；醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate，DXA)，CAS號(hào)1177-87-3；醋酸可的松( Cortisone acetate，CSA)，CAS號(hào)50-04-4；醋酸潑尼松(Prednisone acetate，PA-45)，CAS號(hào)125-10-0；醋酸潑尼松龍(Prednisolone acetate，PA-46)，CAS號(hào)52-21-1；睪酮-D3(Testosterone-D3，TS-D3)，CAS號(hào)77546-39-5；甲基睪酮-D3( Methoxytestosterone，MTS-D3)，CAS號(hào)58-18-4；純度均大于98.0%，購(gòu)于德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈(色譜純，美國(guó)Merck 公司)；凈化劑(500 mg中性氧化鋁+200 mg PSA)(上海安譜公司)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán))，650 ℃灼燒4 h后儲(chǔ)存于干燥器中備用；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃冰箱保存，用甲醇逐級(jí)稀釋成10.0和1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)標(biāo)化合物，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃冰箱保存，用甲醇逐級(jí)稀釋成1.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Kinetex-C18(2.1 mm×100 mm, 2.6 μm，美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.3 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序
Tab.1 Gradient elution programs of mobile phase

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子摸式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣溫度350 ℃；霧化氣流速10.0 L/min；霧化氣壓力45.0 psi；雄激素和糖皮質(zhì)激素優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)及其保留時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 雄激素和糖皮質(zhì)激素化合物的HPLC-MS/MS儀器參數(shù)
Tab.2 HPLC-MS/MS parameters for androgens and glucocorticoids

1.4 樣品前處理

水產(chǎn)品取可食部分，充分勻漿，稱(chēng)取5.0 g樣品(精確至0.01 g)，加入0.1 mL 1.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)和15 mL乙酸乙酯，渦漩混勻1 min，超聲提取10 min，5 000 r/min離心5 min。殘?jiān)?5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上清液。加入凈化劑(500 mg中性氧化鋁+200 mg PSA)振蕩，渦漩混勻1 min，10 000 r/min離心5 min。上清液過(guò)無(wú)水硫酸鈉，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，1.0 mL H2O+CH3CN(3︰1，V/V)定容，過(guò)0.22 μm聚四氟乙稀微孔濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

取空白草魚(yú)樣品，加一系列不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按1.4方法處理后，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理中提取劑的選擇

分別選用甲醇、乙酸乙酯、乙腈等作為提取劑，對(duì)陰性草魚(yú)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)表明，在3種試劑中，甲醇、乙腈兩種提取劑對(duì)地塞米松(DX)、醋酸潑尼松龍(PA-46)、諾龍(NT)、醋酸潑尼松(PA-45)、醋酸可的松(CSA)、睪酮(TS)、醋酸地塞米松(DXA)、甲基睪酮(MTS)的提取效率無(wú)明顯差異，甲醇、乙腈對(duì)醋酸地塞米松(DXA)的提取效率高于乙酸乙酯；但乙酸乙酯對(duì)大部分目標(biāo)化合物的提取效率高于甲醇、乙腈，故本方法選用乙酸乙酯做為提取溶劑。且乙酸乙酯與水不互溶，使得后續(xù)濃縮處理工作簡(jiǎn)單、易行。

圖1 3種試劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率縱坐標(biāo)數(shù)值表示為乙酸乙酯提取率的倍數(shù)。DX：地塞米松；PA-46：醋酸潑尼松龍；NT：諾龍；PA-45：醋酸潑尼松；CSA：醋酸可的松；TS：睪酮；DXA：醋酸地塞米松；MTS：甲基睪酮。Fig.1 Extraction efficiency of androgens and glucocorticoids by three different solvents Values of ordinate were expressed as extraction rate based on ethyl acetate．DX：Dexamethasone：PA-46：Prednisolone acetate：NT：Nandrolone；PA-45：Prednisone acetate；CSA：Cortisone acetate；TS：Testosterone；DXA：Dexamethasone acetate；MTS：MethoxVtestosterone.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在質(zhì)譜中，分別取雄激素和糖皮質(zhì)激素化合物的單標(biāo)溶液直接以蠕動(dòng)泵的注入(10 μL/min)方式引入離子源，選用電噴霧離子源(ESI)，對(duì)MS和MS-MS中產(chǎn)生的主要離子分別在正離子的模式下進(jìn)行鑒定，對(duì)各個(gè)化合物的霧化氣壓力、干燥氣溫度、干燥氣流速、碎裂電壓、碰撞能量等一系列參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)值最高的子離子作為定量離子，次強(qiáng)的子離子做為定性離子進(jìn)行分析，優(yōu)化后的化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、回收率與精密度

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

圖2為0.01 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖。由圖2可以看出，雄激素和糖皮質(zhì)激素化合

圖2 0.01 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of standard of 0.01 μg·mL-1 androgens and glucocorticoids

物實(shí)現(xiàn)了良好分離，無(wú)雜質(zhì)干擾峰。地塞米松(DX)、醋酸潑尼松龍(PA-46)、諾龍(NT)、醋酸潑尼松(PA-45)、醋酸可的松(CSA)和醋酸地塞米松(DXA)使用外標(biāo)法定量；睪酮(TS)以睪酮-D3為內(nèi)標(biāo)，甲基睪酮(MTS)以甲基睪酮-D3為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。8種物質(zhì)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，選擇空白魚(yú)肉樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比S/N≥3作為檢出限，S/N≥10作為定量限，計(jì)算各種激素類(lèi)藥物化合物的檢出限和定量限，檢出限為0.206～0.640 μg/kg，定量限為0.728～2.140 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

選用陰性的草魚(yú)、南美白對(duì)蝦等為空白測(cè)試基質(zhì)，分別添加3個(gè)濃度水平的激素類(lèi)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的平均回收率在75%～115%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49%～9.92%(n=6)，方法的準(zhǔn)確度與精密度均符合實(shí)際分析檢測(cè)的要求。

表3 雄激素和糖皮質(zhì)激素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab.3 Linear ranges, regression equations, related coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs)for androgens and glucocorticoids

表4 樣品中雄激素和糖皮質(zhì)激素的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.4 Spiked recoveries and relative standard deviations of androgens and glucocorticoids in samples

2.4 實(shí)際樣品分析

將采自福建三明、南平、福州等地的50批次水產(chǎn)品樣品，主要包括草魚(yú)、南美白對(duì)蝦、大黃魚(yú)、鮑、鯉等，按照上述方法進(jìn)行處理和檢測(cè)，50批次樣品均未檢出雄激素和糖皮質(zhì)激素。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素的高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法前處理方法簡(jiǎn)單、快速，同時(shí)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，適用于水產(chǎn)品中雄激素和糖皮質(zhì)激素多殘留的測(cè)定。

[1] 劉永華, 楊松. 淺析動(dòng)物性食品中性激素殘留與檢測(cè)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2011,38(7)：239-241.

[2] 李兆新, 冷凱良, 李健, 等. 我國(guó)漁藥質(zhì)量狀況及水產(chǎn)品中漁藥殘留監(jiān)控[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2001,22(2):76-80.

[3] 崔曉亮, 邵兵, 涂曉明. 動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志, 2007，27(9)：1492-1496.

[4] 陸燁. 基于液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定內(nèi)源性激素的方法研究[D]. 上海：復(fù)旦大學(xué)， 2013.

[5] 張峰, 許成保, 藍(lán)芳, 等. 超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定飼料中9種雄性激素類(lèi)藥物[J]. 分析化學(xué), 2012，40(1)：101-106.

[6] 農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[EB/OL]. 2002. http://www.moa.gov.cn/zwllm/nybz/200803/t20080304_1028649.htm.

[7] 胡擁明，王利兵，袁媛，等. 糖皮質(zhì)激素ELISA檢測(cè)方法的建立及群選擇性抗體的篩選[J]. 食品科學(xué), 2009,30(24)：331-336.

[8] 江潔, 林洪, 付曉婷, 等. 水產(chǎn)品中多種激素殘留測(cè)定的高效液相色譜法[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2007,28(6)：67-71.

[9] 何笑榮， 鄒定， 劉文芳, 等. 高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)分析測(cè)定11種糖皮質(zhì)激素[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2008，28(2)：109-111.

[10] 陳捷， 秦燕， 張美金. 氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中殘留的甾類(lèi)同化激素[J]. 色譜, 2006,24(1)：19-22.

[11] 金偉， 黃斌， 王彬, 等. 氣相色譜/質(zhì)譜法測(cè)定水和沉積物中雄激素與孕激素[J]. 分析化學(xué), 2013，41(2)：205-209.

[12] 許婷婷， 戴軍， 陳尚衛(wèi), 等. LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定牛肉中15種同化激素類(lèi)獸藥殘留[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2009，35(8)：110-116.

[13] 李向軍， 于慧娟， 馮兵, 等. 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中24種性激素[J]. 分析試驗(yàn)室 2012，31(5)：62-67.

[14] Schriks M, VAN Leerdam J A, Van Der Linden S C, et al. High-resolution mass spectrometric identification and quantification of glucocorticoid compounds in various wastewaters in the Netherlands [J]. Environ Sci Technol, 2010, 44: 4766-4774.

[15] 郭峰, 史建波, 江桂斌. 全自動(dòng)在線渦流固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接分析血清中4種雄激素[J]. 分析化學(xué), 2014，42(12)：1818-1822.

[16] 徐佳. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞肉中7種糖皮質(zhì)激素殘留量[J]. 福建分析測(cè)試, 2015，24(2)：42-47.

Simultaneous determination of androgen and glucocorticoid residues in aquaticproducts by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZOU Hongmei, ZUO Shunyu, HUANG Dongren, NIU Yuehua, KANG Jianping, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 35003, China)

A method for the simultaneous determination of androgen and glucocorticoid residues in aquatic products was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted with ethyl acetate, followed by clean-up, concentration and other treatments. The chromatographic separation of samples was achieved on Kinetex -C18column (100 mm× 2.1 mm, 2.6 μm) with water/acetonitrile as mobile phase. The target compounds were confirmed and quantified by multiple reaction monitoring (MRM) mode using electrospray ionization source (ESI). Limits of quantification (LOQs) were ranged from 0.728 to 2.140 μg/kg. The average recoveries were between 75% and 115% and the relative standard derivations were in the range of 1.49% - 9.92% in the standard addition levels from 10 to 100 μg/kg. The results showed that the presented method was simple, sensitive, and suitable for quantitative detection of androgen and glucocorticoid residues in aquatic products． [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(2):45-50]

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; androgen; glucocorticoid; aquatic product; residue

Zhang Tianwen, zhangtw1986@163.com

2015-08-15；接收日期：2016-01-20

福建省社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Y0005)

鄒紅梅(1978-)，女，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)，hmzou2000@126.com

張?zhí)炻?，工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)，zhangtw1986@163.com

S94

：A

：2095-1833(2016)02-0045-06