柱前衍生化-氣相色譜法測定水產(chǎn)品中的游離甲醛

湯施展，黃麗，陳中祥，白淑艷，張芳梅，吳松，覃東立，牟振波

(中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

柱前衍生化-氣相色譜法測定水產(chǎn)品中的游離甲醛

湯施展，黃麗，陳中祥，白淑艷，張芳梅，吳松，覃東立，牟振波*

(中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

應用柱前衍生化-氣相色譜(GC)法檢測水產(chǎn)品中游離甲醛含量。野生鯉、鳙、鰱、草魚、鯽和烏蘇里白鮭等樣品經(jīng)超聲萃取、衍生化、正己烷提取，用HP-5毛細管色譜柱分離，電子捕獲檢測器進行檢測，外標法定量。結(jié)果表明，使用優(yōu)化改進后的方法測定的游離甲醛含量在0.1～50 μg/L范圍內(nèi)，標準曲線線性擬合度r2= 0.999，線性良好；在2.0、5.0、10.0 μg/kg 3個水平下加標回收率為83.80%～103.15%，相對標準偏差小于5.0%。方法檢出限為0.38 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg。本研究調(diào)查了查干湖和黑龍江中的野生魚類中游離甲醛的本底含量為1.67 ～7.66 mg/kg，地區(qū)與種間差異不顯著(P>0.05)。優(yōu)化后的方法操作簡便，分析靈敏度高，穩(wěn)定性好，可滿足水產(chǎn)品中微量游離甲醛的檢測需要，對開展水產(chǎn)品中甲醛本底含量及安全限量的研究具有重要的現(xiàn)實意義。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準, 2016, 6(2):51-56]

水產(chǎn)品；游離甲醛；氣相色譜法；柱前衍生化；2,4-二硝基苯肼

甲醛別名蟻醛，35%～40%的甲醛水溶液俗稱福爾馬林。研究表明甲醛具有刺激作用、致敏作用、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性等危害[1]。中國有毒化學品優(yōu)先控制名單上甲醛位居第二，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將其確定為人類致癌物(Group1)和重要的環(huán)境污染物[2]。然而，由于甲醛是活潑的烷化劑，可以使蛋白質(zhì)變性，對寄生蟲、藻類、真菌、細菌、芽孢和病毒均有較強的殺菌效果，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛用于魚類和甲殼類的疾病防治。而且，甲醛具有漂白、防腐作用，能夠延長食品保質(zhì)期，增加食品持水性和韌性，許多不法商販常在水產(chǎn)品或水發(fā)產(chǎn)品中違規(guī)添加甲醛，水產(chǎn)品中甲醛污染問題已引起社會廣泛關(guān)注[3]。此外，甲醛作為一種內(nèi)源性的代謝中間產(chǎn)物在水產(chǎn)品中普遍存在，其本底含量因水產(chǎn)品的生物學類別而異，另有研究表明有些水產(chǎn)品經(jīng)冷凍保鮮后，由于氧化三甲胺酶的作用，甲醛含量會明顯升高[3-4]。因此針對種類繁多且基質(zhì)成分復雜的水產(chǎn)品，建立甲醛快速、靈敏的定性定量檢測方法顯得尤為重要。

水產(chǎn)品中甲醛主要以游離態(tài)、可逆結(jié)合態(tài)和不可逆結(jié)合態(tài)的形式存在，水浸法和蒸餾法提取可得到游離態(tài)和各種結(jié)合態(tài)的甲醛。結(jié)合態(tài)甲醛主要影響水產(chǎn)品的感官性狀，而游離態(tài)甲醛是危害消費者身體健康的主要影響因子，因此有研究者建議測定食品中游離態(tài)的甲醛含量替代食品中總甲醛含量[4-5]。目前，國內(nèi)外報道的檢測甲醛的方法主要有分光光度法[6-9]、色譜法[10-13]、酶法[14]、熒光法[15]、電化學傳感器法[16]和極譜法[17]，其中只有熒光法涉及游離態(tài)甲醛含量檢測，其他均為總甲醛含量檢測，適用于水產(chǎn)品中甲醛檢測的方法主要有紫外法、液相法和氣相法。中國水產(chǎn)行業(yè)標準(SC/T 3025—2006)中規(guī)定的紫外法和液相法的檢出限分別為0.5和0.2 mg/kg。上述方法大都存在樣品前處理過程復雜、檢出限高、抗干擾能力差等不足。為解決上述問題，本研究采用2,4-二硝基苯肼柱前衍生化-氣相色譜法檢測水產(chǎn)品中游離甲醛，并對游離甲醛的萃取和檢測條件進行了優(yōu)化與探討，建立了準確、高效、抗干擾性強的檢測水產(chǎn)品中游離甲醛的氣相色譜法，以期為水產(chǎn)品中甲醛安全限量的制定、游離甲醛含量的檢測及其代謝規(guī)律的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.2.1 試劑

甲醛標準儲備液，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，由 AccuStandard公司生產(chǎn)；2, 4-二硝基苯肼(DNPH)，由上海安普科學儀器有限公司提供，純度(HPLC)≥98.0%。DNPH衍生化試劑配制：分別稱取0.010 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0、0.250 0、0.300 0和0.500 0 g的2, 4-二硝基苯肼溶解于25 mL濃鹽酸中，用超純水定容到100 mL，配置成質(zhì)量濃度為100、500、1 000、2 000、2 500、3 000和5 000 mg/L的2, 4-二硝基苯肼溶液。正己烷(Merck公司)為農(nóng)殘級；實驗用水為超純水電阻率為18.0 Ω。

1.1.2 儀器

7890 B氣相色譜儀(美國Agilent公司)配備電子捕獲檢測器(ECD檢測器)；電子天平(梅特勒-拖利多公司)；電子恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-700E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q公司)；高速離心機(美國熱電公司)。

1.2 實驗方法

1.2.2原理

甲醛在酸性條件下與2,4-二硝基苯肼反應生成2,4-二硝基苯腙，經(jīng)正己烷萃取后用電子捕獲檢測器-氣相色譜儀檢測，間接測得水產(chǎn)品中游離甲醛含量。

1.2.3 儀器條件

色譜柱Aglient: HP-5 (5% Phenyl Methyl Siloxane)，30 m × 320 μm ×0.25 μm；進樣口溫度為200 ℃；載氣為高純氮氣；流速為1.0 mL/min；尾吹流量為 60 mL/min；柱溫箱初始溫度為100 ℃，階升20 ℃/min至240 ℃；檢測器溫度為300 ℃；不分流進樣；進樣量為 1 μL。

1.2.4 標準曲線繪制

準確吸取一定量的甲醛標準儲備液，用純水逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度梯度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/L的甲醛工作曲線，然后加0.5 mL 1 000 mg/L 2,4-二硝基苯肼溶液，在60 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，取出立即用流水冷卻，加10 mL正己烷萃取，取1.0 mL萃取液待測。同時用純水做空白。

1.2.5樣品測定

水產(chǎn)品取背部肌肉組織約200 g左右，置于高速勻漿機中勻漿，制成均勻的糜狀樣品，裝入潔凈的樣品袋內(nèi)，-20 ℃冰箱保存。測定前，樣品在4 ℃冰箱中解凍，準確稱取1 g左右樣品，加10 mL純水，渦旋3 min，超聲20 min，5 000 r/min離心3 min，取5 mL上清液，依照1.2.3方法衍生化后，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波萃取時間的確定

甲醛沸點低，易溶于水。取同一質(zhì)量濃度0.1 mg/L甲醛標準溶液，在相同實驗條件下分別超聲10、20、30、45、60和90 min，重復3次。檢測衍生物生成量的結(jié)果見圖1，萃取20 min時衍生物峰面積最大，說明超聲萃取20 min游離甲醛的提取效果最佳。

圖1 超聲時間對衍生物生成量的影響Fig.1 The effects of ultrasonic time on the derivative production(n=3)

2.2 衍生化時間的選擇

在甲醛與2,4-二硝基苯肼溶液衍生化生成2,4-二硝基苯腙的反應中，如果衍生化時間過短，衍生反應不完全；而衍生化時間過長，會因甲醛揮發(fā)造成較大誤差。為了解衍生化時間對衍生物生成量的影響，本研究取同一濃度的一組甲醛溶液各5 mL，分別加入0.5 mL 1 000 mg/L 2,4-二硝基苯肼溶液，于60 ℃下水浴衍生化0、10、20、30、40、50、60、90和120 min。取出后在流水中快速冷卻，然后用10 mL正己烷分3次(3、3和4 mL)提取，渦旋3 min，5 000 r/min離心3 min，合并提取液，分別定容至10 mL，并取1 mL上機檢測，實驗重復3次。樣品殘留液再用10 mL正己烷重復提取1次，用于樣品提取效率分析。結(jié)果如圖2所示，衍生化40 min時，衍生物生成量最大，隨后逐漸下降，表明40 min時衍生化反應完全，隨著衍生化時間延長衍生物生成量有損失。確定衍生化時間為40 min。從提取情況來看，經(jīng)過3次提取后，樣液中游離甲醛衍生物提取率達到96.67%～97.91%。

圖2衍生時間對衍生物生成量的影響Fig.2 The effects of derivatization time on the derivative production(n=3)

2.3 衍生化試劑濃度的選擇

衍生化試劑濃度對衍生物生成量的影響很大。由于衍生化試劑本身也出色譜峰，如果用量過大，不僅造成浪費，而且會引起色譜柱過載，影響目標峰分離與定量。衍生化試劑量過小，則會導致衍生化不完全。設計0.1、1.0和10 mg/L 3組濃度梯度的甲醛加標樣，分別加入0.5 mL衍生化試劑，樣液中衍生化試劑質(zhì)量濃度分別為10、50、100、200、250、300和500 mg/L，實驗重復3次。衍生化后衍生物生成量結(jié)果見表1。

從表1可知，0.1和1.0 mg/L甲醛溶液在衍生化試劑質(zhì)量濃度為250 mg/L時，衍生物生成量趨于穩(wěn)定；10 mg/L甲醛溶液在衍生化試劑質(zhì)量濃度為200 mg/L時，衍生物生成量最大?？梢钥闯?，3個質(zhì)量濃度的甲醛溶液在衍生化試劑濃度低于250 mg/L時，衍生物峰面積隨著衍生化試劑質(zhì)量濃度的增加而遞增，衍生化試劑質(zhì)量濃度為250～500 mg/L時反應趨于穩(wěn)定。為了衍生化完全，確定最佳衍生化試劑質(zhì)量濃度為300 mg/L。

表1 衍生化試劑質(zhì)量濃度對衍生物生成量的影響

Tab.1 The effects of derivatization reagent concentration on the derivative production

n=3

2.4 分離條件的確定

前期實驗中，根據(jù)甲醛衍生物的特性，分別采用中等極性色譜柱DB-1701和非極性色譜柱HP-5進行實驗，以HP-5的分離效果最佳；在色譜分離條件優(yōu)化時，柱溫和載氣流速對目標峰分離及檢測穩(wěn)定性影響很大。通過改變載氣流速實驗研究發(fā)現(xiàn)，載氣流速為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.9 mL/min時，相應的出峰時間分別為8.78、7.74、7.21、6.87、6.62、6.30 min。為了提高檢測效率，在載氣流速為3.9 mL/min的基礎(chǔ)上，將升溫程序改為：初始溫度為120 ℃，保持0 min；以25 ℃/min升溫速率將溫度爬升至240 ℃，保持3 min；檢測器溫度為300 ℃，進樣口溫度為200 ℃。目標峰出峰時間縮短為4.55 min，總檢測時間為7.8 min，極大地提高了檢測效率。

2.4.1 標準曲線

按1.2.3配制的系列標準曲線，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，測得回歸方程為Y=mX+b，其中，m=619.599 73，b=-220.829 12，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 69。線性范圍為0.1～50 μg/L。重復測定0.3 μg/L樣品7次，標準偏差S=0.006，參照美國環(huán)境保護局(EPA)推薦方法[18]，以取樣量1.00 g計，本方法對樣品的檢出限為0.38 μg/kg(以S/N>3計)，定量限為0.50 μg/kg(以S/N>10計)。為滿足實驗需要，繪制3條標準曲線(表2)和10 μg/L甲醛標準溶液衍生物色譜圖(圖3)。

表2 不同濃度范圍甲醛標準曲線方程
Tab.2 Calibration curves of formaldehyde in different concentration range

圖3 甲醛標準溶液衍生物色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard formaldehyde derivatization

2.4.2 方法準確度和精密度

加標回收實驗中，選取查干湖鳙作為空白加標樣品，分別加入質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10.0 μg/mL的甲醛標準溶液各1.0 mL，按照1.2.3方法步驟1 d內(nèi)測定3次，每樣平行測定6次，計算日內(nèi)精密度，1周連續(xù)測定3次，每樣平行測定6次，計算日間精密度，得到數(shù)據(jù)見表3?？傮w加標回收率為83.80%～103.15%，日內(nèi)和日間精密度的相對標準偏差(RSD)均小于5.0%，表明該方法測定的精密度高，穩(wěn)定性好，適用于水產(chǎn)品中微量游離甲醛的快速測定。

表3 鳙甲醛加標回收率和相對標準偏差

Tab.3 The recoveries and relative standard deviation of spiked formaldehyde inAristichthysnobilis

n=6

表4 野生魚類甲醛本底含量

n=3

2.5 樣品檢測

本研究對查干湖和黑龍江野生魚類肌肉中游離甲醛含量進行測定，樣品前處理采用優(yōu)化后的方法，以1.0 mL/min流量模式進行上機檢測，為保證檢測結(jié)果準確性，每個樣品平行測定3次，同時進行加標回收實驗，樣品加標回收率為90.50%，樣品檢測結(jié)果見表4?？梢钥闯?，6種被檢測的淡水魚甲醛含量在1.67 mg/kg(查干湖草魚)至7.66 mg/kg(黑龍江烏蘇里白鮭)之間，地區(qū)與種間差異不顯著(P>0.05)。從檢測結(jié)果來看，常見野生淡水魚類自身含有一定量的甲醛。劉淑玲[19]采用乙酰丙酮分光光度法檢測中國淡水魚類的甲醛含量范圍為0.25～2.96 mg/kg，中位值為0.25 mg/kg，低于本研究結(jié)果。分析其原因，一方面可能是由于活魚甲醛含量低于冰鮮樣品，冷凍樣品隨時間延長甲醛含量上升[4]；另一方面也可能由于其采用乙酰丙酮分光光度法檢測的檢出限為0.50 mg/kg，低于檢出限的樣品均按0.25 mg/kg計算[19]，導致所檢測樣品含量整體偏低。

另外，同一批次樣品的甲醛衍生液在-20℃冷凍保存15 d后重新測定樣品，發(fā)現(xiàn)其含量相差不大，表明該衍生物在此條件下保存比較穩(wěn)定。本研究同時采用常規(guī)蒸餾法測定了查干湖鳙魚肌肉中總甲醛含量，對比發(fā)現(xiàn)，游離甲醛占總甲醛的40%左右，這與Tai等[5]的研究結(jié)果相近。

3 結(jié)論

與SC/T 3025—2006《水產(chǎn)品中甲醛的檢測》[6]方法相比，本研究在前處理上采用超聲提取法縮短了提取時間，克服了蒸餾操作費時費力的缺點，通過HP-5毛細管色譜柱分離電子捕獲檢測器檢測，提高了檢測靈敏度，柱前衍生化法降低了樣品基質(zhì)干擾。本方法具有檢出限低、穩(wěn)定性強、回收率高、出峰時間穩(wěn)定、信號響應值高和操作簡便等優(yōu)點，為水產(chǎn)品中甲醛殘留及內(nèi)、外源甲醛來源的研究提供技術(shù)支持。另外，本研究檢測了黑龍江和查干湖野生水產(chǎn)品中游離甲醛的本底含量為1.67～7.66 mg/kg，為水產(chǎn)品中甲醛標準限量的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。而關(guān)于水產(chǎn)品中體內(nèi)和體外甲醛的研究工作，有待于下一步開展。

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Quantification of free-formaldehyde in aquatic products by gaschromatography coupled with pro-column derivatization

TANG Shizhan,HUANG Li, CHEN Zhongxiang, BAI Shuyan, ZHANG Fangmei, WU Song, MOU Zhenbo*

(Heilongjiang River Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China)

In this study, the gas chromatography (GC) coupled with pro-column derivatization method was employed to determine free-formaldehyde in aquatic products. Samples ofCyprinuscarpio,Aristichthysnobilis,Hypophthalmichthysmolitrix,Ctenopharyngodonidellus,CarassiusauratusandCoregonusussuriensiswere subjected to ultrasonic extraction, derivatization, n-hexane extraction, and then purified by HP-5 chromatographic column and determined by external standard method with electron capture detector (ECD). The results showed that the optimized method had a good linearity (r2=0.999) when the measured free-formaldehyde was 0.1-50 μg/L, and the limit of detection was 0.38 μg/kg with the relative standard deviations no more than 5.0%. The recoveries of formaldehyde among three different levels (2.0, 5.0, 10.0 μg/kg, respectively) were in the range of 83.80%～103.15%. The baseline of free-formaldehyde in wild fish species from the Chagan Lake and Heilongjiang River were investigated, which ranged from 1.67 - 7.66 mg/kg and without significant differences in regions and species (P> 0.05). The optimized analytical method was rapid and accurate, and suitable for the determination of free-formaldehyde in aquatic products．[Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(2):51-56]

aquatic products; free-formaldehyde; gas chromatography; pro-column derivatization; 2, 4 - dinitrophenyl hydrazine

MOU Zhenbo, mouzb1962@163.com

2015-09-08；接收日期：2015-12-21

水產(chǎn)品中未知危害因子識別與已知危害因子跟蹤評估(GJFP201501001)

湯施展(1987-)，男，學士，研習員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量與安全，tsz2007@163.com

牟振波，研究員，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖，mouzb1962@163.com

S94

：A

：2095-1833(2016)02-0051-06