鰻鱺中甲基睪酮的二維液相色譜檢測方法研究

牛曰華，陳庚，黃東仁，鄒紅梅，康建平，張?zhí)炻?/p>

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

鰻鱺中甲基睪酮的二維液相色譜檢測方法研究

牛曰華，陳庚，黃東仁，鄒紅梅，康建平，張?zhí)炻?

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

針對(duì)鰻鱺樣品中油脂含量較多，采用常規(guī)液相色譜分析時(shí)易產(chǎn)生干擾的狀況，建立了鰻鱺樣品甲基睪酮的在線二維液相色譜檢測方法。樣品用乙醚提取、硅膠固相萃取柱凈化后，用二維液相色譜進(jìn)行檢測。選擇C8柱和C18柱分別作為一維和二維色譜柱，構(gòu)建二維分離體系。通過中心切割技術(shù)將一維色譜柱上的目標(biāo)餾分轉(zhuǎn)移到二維色譜柱上進(jìn)行進(jìn)一步的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)建的二維液相色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，建立的二維液相色譜方法可以實(shí)現(xiàn)甲基睪酮和基質(zhì)干擾物的充分分離，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合鰻鱺樣品中甲基睪酮的測定。本研究解決了用常規(guī)液相色譜法檢測高油脂含量的鰻鱺樣品中甲基睪酮?dú)埩魰r(shí)經(jīng)常出現(xiàn)的干擾問題，是對(duì)現(xiàn)有水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩舻囊合嗌V檢測方法的有益補(bǔ)充。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(2):38-44]

鰻鱺；甲基睪酮；二維液相色譜；中心切割

甲基睪酮(methyltestosterone，MET)是一種人工合成的類固醇類雄性激素，曾被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，可促使苗種向雄性轉(zhuǎn)變[1-2]以及提高飼料的轉(zhuǎn)化率，從而起到促進(jìn)生長和提高產(chǎn)量的作用。但甲基睪酮具有極大的危害性，其在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，可通過食物鏈進(jìn)入人體，擾亂人體的激素平衡，此外還具有影響胎兒發(fā)育、引發(fā)新生兒溶血及黃疸、損害肝臟以及致癌、致畸等作用[3-4]。歐盟等許多國家禁止在養(yǎng)殖中使用甲基睪酮。中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也將甲基睪酮列為禁用藥物，在所有食品動(dòng)物的可食組織中均不得檢出。

水產(chǎn)品中甲基睪酮的檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、液相色譜法[6-7]、酶聯(lián)免疫法[8]等。中國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3029—2006[6]中甲基睪酮?dú)埩袅繖z測方法為液相色譜法，其在水產(chǎn)品藥殘檢測中應(yīng)用廣泛，該方法被用于農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽查中水產(chǎn)品的甲基睪酮?dú)埩魴z測。甲基睪酮由于極性較小，脂溶性較強(qiáng)，提取后雜質(zhì)較多，需要進(jìn)行進(jìn)一步的凈化處理。常用的凈化方法有石油醚和正己烷液液萃取凈化[6-7,9]，HLB柱[10]、C18柱[11-12]、硅膠柱[13]、氧化鋁柱[14]等固相萃取柱凈化以及冷凍離心凈化[15]等。在用液相色譜法進(jìn)行檢測時(shí)，上述凈化方法對(duì)油脂含量較低的水產(chǎn)品如鯽、羅非魚、蝦等凈化效果較好，但對(duì)鰻鱺等一些油脂含量較高的水產(chǎn)品來說，凈化效果往往并不理想，經(jīng)常存在較大干擾，影響了定性和定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)是將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩根色譜柱連接起來構(gòu)成的分離系統(tǒng)。樣品經(jīng)第一維色譜柱初步分離后，通過接口切換技術(shù)進(jìn)入第二維色譜柱中進(jìn)一步的分離。與一維色譜相比，二維色譜的分辨率和峰容量有很大提高，對(duì)于分離復(fù)雜樣品，具有明顯的優(yōu)勢。因此，二維液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)在食品科學(xué)[16-18]、醫(yī)藥衛(wèi)生[19-22]、生命科學(xué)[23-25]等領(lǐng)域取得了較為廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)在線二維液相色譜檢測日本鰻鱺(Anguillajaponica)中甲基睪酮的方法進(jìn)行了研究，通過中心切割技術(shù)將第一維中目標(biāo)物附近不能完全分離的組分轉(zhuǎn)移到第二維中，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物和基質(zhì)的充分分離。相較于傳統(tǒng)的液相色譜法，二維液相色譜可以簡化樣品的前處理過程和提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究解決了用常規(guī)液相色譜檢測高油脂含量的鰻鱺樣品中甲基睪酮?dú)埩魰r(shí)經(jīng)常出現(xiàn)的干擾問題，是對(duì)現(xiàn)有水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩粢合嗌V檢測方法的有益補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

LC-20A二維液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，配備系統(tǒng)控制器(2套)、二元高壓泵(2套)、稀釋泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱(配有2個(gè)六通閥)、紫外檢測器、二極管陣列檢測器；3-30K高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS5渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%，德國Dr公司)；乙醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈，均為HPLC級(jí)；無水硫酸鈉，AR級(jí)，經(jīng)650 ℃灼燒4 h，冷卻后貯存于密封容器中備用；硅膠固相萃取柱，規(guī)格為0.5 g/6 mL，使用前依次用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化，并保持柱體濕潤。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)樣品采自福建省福清市和長樂市相關(guān)養(yǎng)殖基地。

1.2 樣品處理

鰻鱺取可食部分，充分勻漿。稱取5.00 g樣品(精確到0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙醚，渦旋振蕩1 min，然后再加入10 g無水硫酸鈉，再次渦旋振蕩提取1 min，5 000 r/min離心5 min。上層清液轉(zhuǎn)移至150 mL棕色雞心瓶中。殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并提取液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用6 mL正己烷/乙酸乙酯(9∶1，V/V)分2次溶解，過活化好的硅膠固相萃取柱，流速控制在小于1 mL/min。樣液流完后依次用5 mL正己烷和5 mL正己烷/乙酸乙酯(9∶1，V/V)淋洗。最后將硅膠柱壓干，用8 mL丙酮/正己烷溶液(4∶6，V/V)進(jìn)行洗脫，洗脫液35 ℃旋蒸至干，1.00 mL流動(dòng)相定容，過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.3 儀器條件

第一維色譜條件：Agilent XDB-C8柱，規(guī)格150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相為水-乙腈(55∶45,V/V)；柱溫為40 ℃ ；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為30 μL； 檢測波長為254 nm； 中心切割時(shí)間為7.0～8.4 min。

第二維色譜條件：Shim-pack VP-ODS柱，規(guī)格250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相為水-乙腈(50∶50，V/V)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。

捕集柱：Shim-pack GVP-ODS柱，規(guī)格5 mm×2 mm。

稀釋泵設(shè)置：流動(dòng)相為超純水，0～6.00 min，流速為0 mL/min；6.50 ～8.40 min，流速為5 mL/min； 8.41 min以后，流速為0 mL/min。

閥設(shè)置：0.01～5.00 min，設(shè)置左閥，使第一維色譜柱和捕集柱處于斷開狀態(tài)，設(shè)置右閥，使第二維色譜柱和捕集柱處于串聯(lián)狀態(tài)，如圖1所示，此時(shí)樣液流經(jīng)第一維色譜柱，進(jìn)行初步分離；5.00～7.00 min，設(shè)置右閥，使第二維色譜柱和捕集柱處于斷開狀態(tài)，此時(shí)稀釋泵打開；7.00～8.42 min，設(shè)置左閥，使第一維色譜柱和捕集柱處于串聯(lián)狀態(tài)，如圖2所示，此時(shí)對(duì)包含目標(biāo)組分在內(nèi)的一段組分進(jìn)行中心切割，將這些組分轉(zhuǎn)移到捕集柱上；8.42 min以后，設(shè)置右閥，使第二維色譜柱和捕集柱處于串聯(lián)狀態(tài)，如圖3所示，此時(shí)組分進(jìn)入第二維色譜柱進(jìn)行再次分離。

圖1 第一維色譜分離時(shí)的儀器流路示意圖Fig.1 Schematic diagram of instrument flow of the first dimensional chromatography

圖2 中心切割時(shí)的儀器流路示意圖Fig.2 Schematic diagram of instrument flow in heart-cutting

圖3 第二維色譜分離時(shí)的儀器流路示意圖Fig.3 Schematic diagram of instrument flow of the second dimensional chromatography

2 結(jié)果與討論

2.1 在線二維色譜系統(tǒng)的構(gòu)建

二維液相色譜通常采用兩種不同分離機(jī)理的色譜柱分析樣品，使一維色譜系統(tǒng)中不能分離的組分在二維色譜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)分離。一維色譜和二維色譜分離機(jī)理的差異性越大，分離能力越強(qiáng)。最理想的二維色譜系統(tǒng)就是一維是正相分離模式，另外一維是反相分離模式，即NPLC×RPLC模式，此時(shí)具有最高的分離效率。但對(duì)于在線二維色譜系統(tǒng)來說，NPLC×RPLC模式最大的缺陷是存在流動(dòng)相不兼容的問題。盡管目前已有在線蒸發(fā)接口技術(shù)解決了這一問題[26]，但操作復(fù)雜，尤其是對(duì)于常規(guī)分析來說不具有普遍性和實(shí)用性。因此本研究在一維和二維分離中均采用疏水保留機(jī)理的反相色譜分離模式，一維選擇C8柱，二維選擇C18柱。C8柱的脂溶性保留能力比C18柱弱，由于一維為初步分離，選擇C8柱，脂溶性物質(zhì)可以更快的流出，同時(shí)為了縮短分析時(shí)間，使甲基睪酮組分更快的流出，C8柱的長度選擇150 mm。二維的分離要確保目標(biāo)物和雜質(zhì)的完全分離，因此選擇對(duì)非極性和弱極性化合物分離能力更強(qiáng)的C18柱，色譜柱長度選擇250 mm。

2.2 中心切割時(shí)間的確定

中心切割技術(shù)是將感興趣的第一維組分轉(zhuǎn)移到第二維上，以便進(jìn)行進(jìn)一步的分析。因此中心切割時(shí)間的選擇在二維色譜方法中至關(guān)重要，首先要根據(jù)一維色譜中甲基睪酮的保留時(shí)間來確定。在上述一維色譜條件下，通過標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣(流速為1.0 mL/min)，確定甲基睪酮的保留時(shí)間為7.35 min，峰寬約為0.7 min，因此甲基睪酮色譜峰從峰起始到峰結(jié)束的時(shí)間段為7.00～7.70 min。除此之外，還要計(jì)算甲基睪酮從一維紫外檢測器流出到進(jìn)入捕集柱的時(shí)間。根據(jù)連接的不銹鋼管路的內(nèi)徑和長度，確定這段管路的體積約為300 μL。因此，得到目標(biāo)物從紫外檢測器到捕集柱的時(shí)間約為0.3 min。因此甲基睪酮色譜峰到達(dá)捕集柱的時(shí)間段為7.30～8.00 min。因此中心切割時(shí)間至少要全部包括7.30～8.00 min這一時(shí)間段。同時(shí)考慮到整體色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的影響，保留時(shí)間往往也會(huì)發(fā)生一定范圍的偏差。中心切割時(shí)間過窄，目標(biāo)物會(huì)有損失，這將影響到二維色譜的靈敏度和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；中心切割時(shí)間過寬，會(huì)造成較多的基質(zhì)干擾物進(jìn)入二維色譜柱，影響二維色譜的分離，同時(shí)也會(huì)縮短捕集柱的壽命。因此最終的中心切割時(shí)間設(shè)為7.00～8.40 min。

2.3 稀釋泵流速的確定

稀釋泵所用的流動(dòng)相為超純水，其主要作用是迅速降低捕集柱中有機(jī)相的比例，從而保證在中心切割時(shí)間內(nèi)目標(biāo)物保留在捕集柱上，同時(shí)還具有溶質(zhì)聚焦作用，防止進(jìn)入第二維的色譜峰展寬造成靈敏度降低。能否將目標(biāo)物保留在捕集柱上，是決定二維色譜分析方法成敗的關(guān)鍵。通過對(duì)稀釋泵設(shè)置一系列流速，其余參數(shù)按照1.3的儀器條件進(jìn)行設(shè)置，用400 μg/L的甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄二維和一維甲基睪酮色譜峰的面積，計(jì)算兩者比值，從而確定捕集柱對(duì)甲基睪酮的保留情況，結(jié)果如表1所示。當(dāng)流速為3 mL/min時(shí)，僅有48.2%的甲基睪酮被捕集柱捕獲；當(dāng)流速為4 mL/min時(shí)，有75.1%的甲基睪酮可被捕集柱捕獲；當(dāng)流速為5 mL/min時(shí)，有93.3%的甲基睪酮可被捕集柱捕獲；再進(jìn)一步提高流速，保留在捕集柱上的甲基睪酮無明顯變化。流速越大，捕集柱中的水的含量越大，有機(jī)相的比例越小，捕集柱的壽命就會(huì)降低。此外，稀釋泵流速越大，二維系統(tǒng)的壓力也會(huì)越高。綜合考慮，稀釋泵流速選擇5 mL/min比較合適。

表1 稀釋泵流速與捕集柱的捕集效果
Tab.1 The relationship between flow rate of dilution pump and trapping effect of trap column

稀釋泵流速/(mL·min-1)Flowrateofdilutionpump二維與一維色譜峰面積比值/%Ratioofthepeakareaofthesec?onddimensionalandthefirstdi?mensional348．2475．1593．3693．5894．1

2.4 二維色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性考察

由于二維液相色譜峰的響應(yīng)信號(hào)不是通過直接進(jìn)樣產(chǎn)生的，而是通過一維進(jìn)樣、捕集柱捕集后轉(zhuǎn)移到二維色譜產(chǎn)生的。這是與常規(guī)色譜通過直接進(jìn)樣產(chǎn)生色譜響應(yīng)信號(hào)明顯的不同之處。此外，二維色譜響應(yīng)信號(hào)還受到中心切割時(shí)間窗口選擇的適宜性、捕集柱的捕集能力、目標(biāo)物在捕集柱上洗脫的難易程度以及閥切換導(dǎo)致的系統(tǒng)壓力突變等多種因素的影響，因此需要對(duì)構(gòu)建的二維色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

將50 μg/L甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄甲基睪酮二維色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果如表2所示。計(jì)算得到保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.07%，峰面積的RSD為1.56%，完全滿足JJG 705—2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》中定性重復(fù)性≤1.0%和定量重復(fù)性≤3.0%的要求。

由此可見，構(gòu)建的二維液相色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，和常規(guī)液相色譜相比，無顯著差異。

表2 甲基睪酮標(biāo)樣的保留時(shí)間和峰面積
Tab.2 Retention time and peak area of MET

保留時(shí)間/minRetentiontime峰面積Peakarea19．951386719．977384219．979376319．971374419．943388919．9633861

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系和檢出限

將質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、1 000 μg/L甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣檢測。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以甲基睪酮的二維色譜峰面積為縱坐標(biāo)，做線性回歸，得到曲線方程為Y=74.904 4X+140.544，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，線性關(guān)系良好。向鰻鱺陰性樣品中添加一定量甲基睪酮標(biāo)液，使甲基睪酮含量為10 μg/kg，混勻，然后按本研究方法進(jìn)行樣品處理和檢測，計(jì)算信噪比S/N=4.3，檢出限約為7 μg/kg，滿足國家對(duì)水產(chǎn)品中甲基睪酮不得檢出(即甲基睪酮?dú)埩袅啃∮?0 μg/kg)的管理要求。

2.5.2 準(zhǔn)確度和精確度

向鰻鱺陰性樣品中添加3個(gè)濃度水平的甲基睪酮，每個(gè)濃度水平6個(gè)平行樣品。按本研究方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3所示。在添加含量10～100 μg/kg范圍內(nèi)，平均回收率為87.8%～93.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.75%～7.31%。

表3 加標(biāo)樣品的回收率和精密度
Tab.3 Recovery and RSD of spiked samples

添加含量/(μg·kg-1)Spikedconcentration平均回收率/%Averagerecovery相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD1093．27．315088．55．4610087．84．75

2.6 常規(guī)液相和二維液相色譜檢測結(jié)果比較

鰻鱺樣品經(jīng)處理后分別用常規(guī)液相和二維液相上機(jī)檢測。盡管大部分樣品都可用常規(guī)液相色譜進(jìn)行檢測，但也存在個(gè)別樣品由于較強(qiáng)的基質(zhì)干擾難以對(duì)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確判定的情況。圖4為存在基質(zhì)干擾的鰻鱺陰性樣品和甲基睪酮標(biāo)樣的常規(guī)液相色譜圖，其中，甲基睪酮標(biāo)樣質(zhì)量濃度為400 μg/L，樣品由于在甲基睪酮出峰處存在較大的干擾，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量判定。對(duì)該樣品用二維液相色譜檢測，結(jié)果如圖5所示，樣品在甲基睪酮出峰處基線平穩(wěn)，不再有雜質(zhì)峰的干擾。此時(shí)，可以準(zhǔn)確地判斷出樣品中不含有甲基睪酮。對(duì)這類陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)，然后按本研究方法進(jìn)行檢測，二維液相色譜圖如圖6所示，甲基睪酮色譜峰和雜質(zhì)峰分離完全，可以準(zhǔn)確地計(jì)算出樣品中甲基睪酮的含量。

圖4 鰻鱺陰性樣品和MET標(biāo)樣的常規(guī)液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatography of eel negative sample and MET standard sample

圖5 鰻鱺陰性樣品和MET標(biāo)樣的二維液相色譜圖Fig.5 Two-dimensional liquid chromatography of eel negative sample and MET standard sample

圖6 鰻鱺陰性加標(biāo)樣品的二維液相色譜圖Fig.6 Two-dimensional liquid chromatography of spiked eel sample

2.7 實(shí)際樣品檢測

對(duì)采自福建省福清市和長樂市相關(guān)養(yǎng)殖基地的28批次日本鰻鱺樣品，按照本研究方法進(jìn)行處理和檢測，結(jié)果均為陰性。同時(shí)將上述樣品按照SC/T 3029—2006的液相色譜法進(jìn)行檢測，其中21個(gè)批次的樣品結(jié)果為陰性，剩余 7個(gè)批次的樣品在甲基睪酮出峰處出現(xiàn)一定的干擾，無法對(duì)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確判定。為此，對(duì)出現(xiàn)干擾的樣品用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]進(jìn)一步確證，結(jié)果顯示均為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述樣品均為陰性樣品，與本研究方法檢測結(jié)果一致，也進(jìn)一步說明本研究方法較為準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

鰻鱺中含有較多的脂肪成分，在用常規(guī)液相色譜進(jìn)行甲基睪酮檢測時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)干擾，影響了對(duì)檢測結(jié)果的判定。針對(duì)這一狀況，本研究基于二維色譜的分離技術(shù)，在構(gòu)建二維液相色譜系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，建立了鰻鱺中甲基睪酮的在線二維液相色譜分析方法，實(shí)現(xiàn)了甲基睪酮與基質(zhì)干擾物的有效分離，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有一定的實(shí)際應(yīng)用推廣價(jià)值。

[1] 周興華, 向梟, 王進(jìn)文. 甲基睪酮對(duì)珍珠瑪麗魚及紅劍尾魚性逆轉(zhuǎn)及體色影響的初步研究[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào), 2000, 27(3): 99-101, 137.

[2] 范俊杰, 徐少群, 方展強(qiáng), 等. 17α-甲基睪酮對(duì)食蚊魚形態(tài)雄性化及目標(biāo)基因表達(dá)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2013, 37(1): 9-15.

[3] Vick A M, Hayton W L. Methyltestosterone pharmacolinetics and oral bioavailability in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J]. Aquat Toxicol, 2001, 52(3): 177-188.

[4] 馮國明. 水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁用的藥物[J]. 北京農(nóng)業(yè), 2006(5): 37.

[5] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 21981—2008 動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[6] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. SC/T 3029—2006 水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y定 液相色譜法[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

[7] 張璇, 蔡友瓊, 惠蕓華, 等. 超高壓液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮的殘留量[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2014, 33(4): 459-461.

[8] 王強(qiáng), 王旭峰, 黃珂, 等. 酶聯(lián)免疫吸附法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩鬧J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(5): 303-308.

[9] 彭家杰, 李緒鵬, 胡浩光, 等. 高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅壳疤幚矸椒ǖ母倪M(jìn)[J]. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2014, 4(2): 56-60.

[10] 羅玲, 劉伶俐, 洪波, 等. HLB 柱凈化-高效液相色譜法分析水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩粑颷J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2014, 33(7): 844-846.

[11] 李佩佩, 梅光明, 張小軍, 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的甲基睪酮?dú)埩袅縖J]. 食品科學(xué), 2012, 33(22): 282-285.

[12] 黃雪玲, 戚雋淵, 魏厚道, 等. 固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中的己烯雌酚和甲基睪丸酮[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(5): 285-287.

[13] 秦振發(fā), 黎小正. 硅膠柱SPE-HPLC 測定水產(chǎn)品中甲基睪酮的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(10): 291-294.

[14] 萬譯文, 伍遠(yuǎn)安, 洪波, 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮藥物殘留[J]. 湖南飼料, 2013,16(5): 13-16.

[15] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 動(dòng)物源食品中11種激素殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2008.

[16] 儲(chǔ)小軍, 陶保華, 賴世云, 等. 固相萃取-二維液相色譜法測定嬰幼兒配方食品中的維生素B12[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2013, 39(2): 185-190.

[17] 張艷海, 其布勒哈斯, 金燕, 等. 在線二維液相色譜法同時(shí)測定嬰幼兒和成人配方營養(yǎng)品中的維生素A、D3和E[J]. 色譜, 2015, 33(3): 291-297.

[18] Cacciola F, Jandera P, Hajdú Z, et al. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography with parallel gradients for separation of phenolic and flavone antioxidants [J]. J Chromatogr A, 2007, 1149(1): 73-87.

[19] 郭菲, 王彥, 王刃鋒, 等. 二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離中藥復(fù)方葛根芩連湯中的有效成分[J]. 色譜, 2008, 26(1): 15-21.

[20] 張艷海, 張大偉, 孟兆青, 等. 在線二維液相色譜法快速測定桂枝茯苓膠囊中芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(23): 4088-4093.

[21] 唐濤, 張維冰, 李彤, 等. 六味地黃丸組分的二維液相色譜分離[J]. 分析化學(xué), 2007, 35(12): 1767-1771.

[22] 顏權(quán)平, 王昇, 丁麗, 等. 二維液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的間-苯二酚及其他酚類化合物[J]. 煙草科技, 2011,44(12): 56-60.

[23] 黎永明, 陳騰祥, 楊麗萍, 等. 小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組的二維液相色譜分離[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 25(9): 1152-1154, 1157.

[24] 劉芙君, 李建遠(yuǎn), 王培林, 等. 大鼠附睪液蛋白質(zhì)組二維液相色譜分離的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 國際遺傳學(xué)雜志, 2006, 29(6): 420-423.

[25] 江磊, 趙換, 陶燕鐸, 等. 二維制備高效液相色譜分離塞隆骨強(qiáng)極性多肽[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2015, 27(7):1205-1209.

[26] Sonnefeld W J, Zoller W H, May W E, et al. On-line multidimensional liquid chromatographic determination of polynuclear aromatic hydrocarbons in complex samples[J]. Anal Chem, 1982, 54(4): 723-727.

Study on determination of methyltestosterone in eel bytwo-dimensional liquid chromatography

NIU Yuehua, CHEN Geng, HUANG Dongren, ZOU Hongmei, KANG Jianping, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 350003, China)

Eel products have high fat content. Since the conventional liquid chromatography would easily lead to interference in the analysis, it is necessary to establish on-line two-dimensional liquid chromatography inspection method for determination of methyltestosterone in eel products. Samples were extracted with ether and purified by silica gel solid phase extraction column, and then determined by two-dimensional liquid chromatography. C8and C18columns were selected as the first and second dimensional chromatographic columns to construct the two-dimensional separation system. The target fraction of the first-dimensional column was transferred to the second-dimensional column for further separation through heart-cutting technique. The results showed that the two-dimensional liquid chromatographic system had good stability, and the established method can realize the full separation of methyltestosterone and matrix interference. The method was accurate and reliable, and suitable for the determination of methyltestosterone in eel products. This study solved the interference problem which often appears in the determination of methyltestosterone residues in eel products with high fat by conventional liquid chromatography, and was a useful supplement to existing liquid chromatography method for determination of methyltestosterone residues in aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(2):38-44]

eel; methyltestosterone; two-dimensional liquid chromatography; heart-cutting

ZHANG Tianwen, zhangtw1986@163.com

2015-09-01；接收日期：2015-12-11

福建省社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Y0005)

牛曰華(1981-)，男，工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品中藥物殘留分析，292798330@qq.com

：張?zhí)炻?，工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品中藥物殘留分析，zhangtw1986@163.com

S94；O657.7

：A

：2095-1833(2016)02-0038-07