五種金花茶組植物的耐寒性比較研究

李吉濤， 謝偉玲， 柴勝豐， 唐健民， 韋 霄

( 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院 廣西植物研究所, 廣西 桂林 541006 )

五種金花茶組植物的耐寒性比較研究

李吉濤， 謝偉玲， 柴勝豐， 唐健民， 韋 霄*

( 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院 廣西植物研究所, 廣西 桂林 541006 )

金花茶組植物是世界珍稀、瀕危的觀賞植物，具有極高的觀賞價值和藥用價值。為了比較金花茶組植物的耐寒性, 以五種金花茶組植物為材料，采用人工模擬低溫環(huán)境的方法對其2年生葉片進行低溫脅迫處理，應(yīng)用電導(dǎo)法研究五種金花茶種質(zhì)在20 ℃(常溫對照)、 8 ℃、-2 ℃、-7 ℃、-12 ℃、-17 ℃、-22 ℃和-27 ℃低溫下相對電導(dǎo)率的變化，配合Logistic方程，測定其低溫半致死溫度(LT50)，以及葉片中游離脯氨酸、可溶性糖和丙二醛的含量。結(jié)果表明：五種金花茶的低溫半致死溫度(LT50)范圍為-14.58～-12.74 ℃，其中金花茶為-14.58 ℃、龍州金花茶為-14.27 ℃、檸檬黃金花茶為-13.44 ℃、直脈金花茶為-13.09 ℃、東興金花茶-12.74 ℃。低溫半致死溫度能反映金花茶種質(zhì)的耐寒性，金花茶和龍州金花茶耐寒性強，其次為檸檬黃金花茶和直脈金花茶，東興金花茶耐寒性較弱。在降溫過程中，五種金花茶葉片相對電導(dǎo)率隨溫度降低呈S型上升，與溫度呈負相關(guān)；脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。同一低溫條件下，半致死溫度低的金花茶脯氨酸和可溶性糖的含量更高，而丙二醛含量更低。該研究結(jié)果為金花茶組植物耐寒種質(zhì)選育提供了科學(xué)依據(jù)，為人工種植金花茶提供了技術(shù)支持。

金花茶組， 相對電導(dǎo)率， 半致死溫度， 耐寒性

金花茶組植物為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，是世界珍稀的觀賞植物與種質(zhì)資源，是山茶花中唯一具有金黃色花的類群，被譽為“世界珍品、茶族皇后”，亦是培育黃色系山茶新品種的珍貴材料，具有極高的觀賞價值和科研價值。其中金花茶已列入國家一級保護植物和國際生物多樣性公約附屬II物種(傅立國，1992；梁盛業(yè)，1993)。目前，對于金花茶組植物逆境生理，研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫影響金花茶幼苗光合生理特性、抗氧化能力及滲透物質(zhì)含量(柴勝豐等，2015；鄧旭等，2012)。李辛雷等(2006)的研究表明，顯脈金花茶、金花茶、貴州金花茶、長柱金花茶和直脈金花茶等5個物種屬于中度熱敏感性物種。趙世偉(1995)進行了金花茶組植物的引種北移試驗，探討了金花茶組植物對低溫脅迫的反應(yīng)及抗寒性鑒定。吳洪明(2004)通過電導(dǎo)法測定從金花茶(C.nitidissima)中選育的品種(‘金農(nóng)推’‘金防城’‘金壇洛’‘金皇后’)、小花金花茶(C.micrantha)和從弄崗金花茶(C.grandis)中選出的‘金隴瑞’低溫條件下葉片的電解質(zhì)滲出率并初步分析了葉片受凍臨界低溫范圍。大部分金花茶組植物的花期比較長，一般是11月至翌年3月，期間恰逢“春節(jié)黃金周”。花期若遭遇“倒春寒”等低溫天氣，勢必影響其觀賞價值。因此，開展金花茶抗寒種質(zhì)資源評價，對其抗寒性進行評價，探討其抗寒脅迫生理，篩選出耐寒性強的金花茶種質(zhì)，對于保護金花茶種質(zhì)資源、擴大其引種范圍、促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義。

遭受低溫脅迫后，植物細胞膜的透性增加，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，致使電導(dǎo)率增大。電導(dǎo)率大小與細胞受傷害程度呈正相關(guān)。電導(dǎo)率越高，說明植物細胞膜受到的傷害越大，植株的抗寒性越弱(Lyons & Raison，1970)。電解質(zhì)滲出率法是植物抗寒性鑒定中常用且比較可靠的一種方法(Liu et al，2012)，其結(jié)果與物種的田間冷害癥狀等基本相符，常被用來作為植物抗寒性鑒定的理化指標(李剛等，2007；許瑛和陳發(fā)棣，2008；王冠群等，2014；王瑋等，2015；趙昌瓊等，2003)。茶梅、佛手、錦帶花、蘋果、葡萄等園藝植物的耐寒性評價均采用電解質(zhì)外滲法(徐康等，2005；郭衛(wèi)東等，2009；王玲等，2012；時朝等，2013；何偉等，2014)。本研究以五種金花茶種質(zhì)為實驗材料，測定人工模擬低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率和相關(guān)生理指標，分析其耐寒性差異，以期為金花茶組植物耐寒種質(zhì)的選育提供實驗依據(jù)，為熱帶起源的金花茶組植物的北移、防寒栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及低溫處理

金花茶組植物種類為金花茶(Camellianitidissima)、龍州金花茶(C.longzhouensis)、檸檬黃金花茶(C.limonia)、直脈金花茶(C.multipetala)和東興金花茶(C.tunghinensis)，選取生長勢基本一致的健康植株的兩年生枝條的中部葉片，采摘后立即裝入自封袋，速帶回實驗室。分別用自來水、蒸餾水沖洗，用吸水紙吸干水分。將每種葉片分成8份，置于密封的自封袋中，放入低溫培養(yǎng)箱中進行低溫處理。根據(jù)金花茶種質(zhì)圃所在地桂林雁山的年均溫度(約20 ℃)、絕對低溫(-6 ℃)及油茶、山茶的低溫半致死溫度(王永紅等，2006；韋霄等，2007；曾雯君等，2013)，試驗設(shè)置7個處理溫度，分別為8 ℃、-2 ℃、-7 ℃、-12 ℃、-17 ℃、-22 ℃和-27 ℃，以室溫(20 ℃)為對照。參考王冠群等(2014)的低溫處理程序并做適當調(diào)整，當?shù)蜏嘏囵B(yǎng)箱為8 ℃時，將材料放入緩慢降溫，降溫速度為10 ℃·h-1，降至目標溫度后維持3 h。材料取出后，分析測定電解質(zhì)滲出率，并進行脯氨酸、可溶性糖、丙二醛等生理指標分析及鑒定。實驗重復(fù)3次。

1.2 葉片電解質(zhì)滲出率的測定

將對照和處理組葉片拿出后，避開主脈和邊緣，將葉片剪碎，準確稱量1.0 g放入試管中，加入20 mL去離子水，室溫震蕩浸提6 h后靜置待測。先用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定浸提液的電導(dǎo)率R1，代表低溫處理后的葉片電解質(zhì)的外滲值。再將盛有浸提液的試管置于滅菌鍋中，121 ℃處理10 min，冷卻后靜置6 h，測定所有細胞被破壞后浸提液的電導(dǎo)率R2，代表細胞電解質(zhì)的總含量。最后用去離子水的電導(dǎo)率RCK作為對照，計算相對電導(dǎo)率(REC)= [(R1-RCK) /(R2-RCK)] × 100%。將電解質(zhì)滲出率配以Logistic回歸方程y=K/(1+ae-bx)求得拐點溫度即半致死溫度(LT50)。式中，y為相對電導(dǎo)率，x為處理溫度，a、b是方程參數(shù)，K是相對電導(dǎo)率飽和值。計算方法參照莫惠棟 (1983)和劉世紅等(2011)的方法。

1.3 抗寒生理指標的測定

游離脯氨酸(Pro)、可溶性糖及丙二醛(MDA)含量測定參考李合生(2000)的方法，每個指標平行測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，用LSD法檢驗不同處理間是否具有顯著性差異，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對葉片細胞相對電導(dǎo)率的影響

從圖1可以看出，在經(jīng)一系列低溫處理后，五種金花茶種質(zhì)葉片的相對電導(dǎo)率總體變化趨勢均隨處理溫度的降低而逐漸升高，近似呈S型的單峰曲線分布。在降溫初期(8～-12 ℃)，5種葉片的相對電導(dǎo)率均表現(xiàn)出不同程度的升高，說明葉片細胞膜損傷加重，膜透性增加，但同一溫度不同金花茶葉片的REC差異不顯著，其原因是植物可能在一定程度上對低溫脅迫產(chǎn)生了防御反應(yīng)，使細胞膜得以修復(fù)，說明適時的低溫鍛煉能夠增強金花茶的抗寒性。隨著處理溫度降至-12～-17 ℃區(qū)間，相對電導(dǎo)率都超過了50%，說明此時離子滲透已經(jīng)相當嚴重。當溫度繼續(xù)下降至-22～-27 ℃區(qū)間，相對電導(dǎo)率變化又趨平緩，說明此時細胞膜已基本被破壞，電解質(zhì)大都滲透到細胞外。

2.2 金花茶低溫半致死溫度比較

相對電導(dǎo)率用Logistic方程進行擬合后，R2在0.97以上，說明擬合結(jié)果是十分可靠的。從表1可以看出，通過非線性回歸分析并結(jié)合Logistic方程擬合，得到的拐點溫度即為各金花茶種質(zhì)的低溫半致死溫度LT50。五種金花茶種質(zhì)的低溫半致死溫度分別為-14.58 ℃、-14.27 ℃、-13.44 ℃、-13.09℃和-12.74 ℃，分布范圍為-12.74～-14.58 ℃，均出現(xiàn)在其各自相對電導(dǎo)率驟升的溫度區(qū)域(-12～-17 ℃)內(nèi)。根據(jù)低溫半致死溫度的高低，得出五種金花茶種質(zhì)耐寒性由強到弱依次為金花茶 > 龍州金花茶 > 檸檬黃金花茶 > 直脈金花茶 > 東興金花茶。

2.3 低溫處理后五種金花茶葉片生理指標的變化

五種金花茶葉片的游離脯氨酸含量變化差異較大，但總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，達到峰值的溫度是-17 ℃，含量分別為79.71、78.33、74.04、73.90、70.41 ng·g-1FW；20 ℃和8 ℃時，不同金花茶葉片的脯氨酸含量發(fā)生變化，但是沒有達到顯著差異；當處理溫度降到0 ℃以下，同一溫度下不同金花茶葉片的脯氨酸含量變化差異顯著(表2)，LT50低的金花茶脯氨酸含量高于LT50高的金花茶。

在低溫脅迫下，隨著處理溫度的下降，五種金花茶的可溶性糖含量均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，LT50低的金花茶葉片的可溶性糖的含量更高。當溫度降到-17 ℃時，5種材料的可溶性糖含量均達到峰值，半致死溫度最低的金花茶可溶性糖含量為35.62 mg·g-1FW，半致死溫度最高的東興金花茶可溶性糖含量為28.99 mg·g-1FW。

在低溫脅迫范圍內(nèi)，五種金花茶葉片的MDA含量隨溫度的降低呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，達到峰值的溫度均為-17 ℃，但不同材料其MDA峰值含量不同，分別為58.02、59.10、73.24、74.00、82.61 nmol·g-1FW，LT50越低，MDA峰值越小(表2)。由此可知，低溫脅迫后，膜脂過氧化程度與LT50高低正相關(guān)，LT50低的材料膜脂過氧化程度較低。

3 討論與結(jié)論

低溫是熱帶、亞熱帶植物生長過程中遭遇的主要非生物限制因子之一(鄧仁菊等，2014)。本研究中，五種金花茶種質(zhì)葉片經(jīng)一系列低溫處理后相對電導(dǎo)率總體變化趨勢均隨處理溫度的降低而逐漸升高，近似呈S型的單峰曲線分布，這與朱根海等(1986)的研究結(jié)果一致。植物的抗寒能力的強弱并非單一因素所決定的，而是一個復(fù)雜的生理生化過程(Levitt et al, 1980)。經(jīng)過低溫鍛煉，許多植物的抗寒能力明顯增強，但抗寒力的增強幅度因植物種類而異。半致死溫度(LT50)是評價植物抗寒性強弱的一個重要且比較準確的指標(劉慧民等，2014)。本研究從金花茶LT50入手, 并結(jié)合生理生化指標比較金花茶種質(zhì)的耐寒性，方法簡便且準確性較高，可以作為耐寒金花茶種質(zhì)篩選的一個量化指標；而低溫半致死溫度(LT50)也可作為金花茶低溫抗寒分子生物學(xué)研究的處理溫度。通過對收集的金花茶組植物資源進行耐寒性評價，篩選出適合向亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)北緣推廣種植的優(yōu)良種質(zhì)， 擴大引種范圍，有利于更好地保護金花茶組植物種質(zhì)資源。

圖 1 五種金花茶相對電導(dǎo)率隨溫度變化的Logistic曲線 A. 金花茶; B. 龍州金花茶; C. 檸檬黃金花茶; D. 直脈金花茶; E. 東興金花茶。Fig. 1 Logistic curve of relative electric conductivity to temperature of five species of Camellia sect. Chrysantha A. C. nitidissima; B. C. longzhouensis; C. C. limonia; D. C. multipetala; E. C. tunghinensis.

種名Species回歸方程Regressionequation半致死溫度Semi?lethaltemperature(℃)擬合度Fittingdegree金花茶CamellianitidissimaY=134．7943/(1+11．94235164e0．134x)-14．580．9837龍州金花茶C．longzhouensisY=129．1215/(1+11．84686804e0．141x)-14．270．9847檸檬黃金花茶C．limoniaY=122．1326/(1+10．93898833e0．151x)-13．440．9744直脈金花茶C．multipetalaY=103．7302/(1+28．52976512e0．25x)-13．090．9729東興金花茶C．tunghinensisY=112．8015/(1+12．1255923e0．178x)-12．740．9756

注： X表示所對應(yīng)的溫度 (℃)，Y表示相對電導(dǎo)率 (%)。

Note: X and Y indicate temperature (℃) and relative electric conductivity (REC, %), respectively.

表 2 不同低溫處理下五種金花茶葉片游離脯氨酸、可溶性糖及MDA含量的變化

注： 同列數(shù)據(jù)后標注的不同小寫字母，表示在5%水平上不同種金花茶在同一溫度下差異顯著。

Note: The lower case after the figure in the same column indicate the same temperatures under different species had significant difference at 5% level.

脯氨酸與可溶性糖是植物細胞內(nèi)兩種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。當遇到逆境脅迫時，植物體內(nèi)脯氨酸與可溶性糖的積累可以降低細胞滲透勢和保持細胞膜的穩(wěn)定性，從而減輕低溫脅迫對細胞的傷害(王忠, 2000；Mo et al, 2011)。本研究中，受低溫脅迫后，五種金花茶葉片的脯氨酸與可溶性糖含量隨著處理溫度的降低呈先上升后下降的趨勢?？赡苁怯捎诩毎诘蜏孛{迫初期失水，同時胞內(nèi)的可溶性糖和游離脯氨酸的積累，促使細胞液的濃度增加和滲透勢降低，從而保持細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性。但當溫度繼續(xù)下降到一定程度，細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，保護性酶活性喪失，導(dǎo)致可溶性糖和游離脯氨酸的合成減少，含量下降。但是在相同的脅迫溫度條件下，LT50低、耐寒性強的金花茶種質(zhì)合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力可能更強，積累較多的可溶性糖和游離脯氨酸，更有利于減輕低溫脅迫對植株的傷害。

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，可與細胞膜蛋白等結(jié)合，破壞細胞膜的穩(wěn)定性；還會造成細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化，導(dǎo)致細胞膜破裂(龐金安等，2000)。MDA含量的變化可以反映低溫脅迫后植物細胞膜的過氧化程度。當MDA大量增加時，表明植物細胞膜受到的破壞較嚴重(王樹剛等，2011)。本研究中，金花茶葉片內(nèi)MDA含量隨脅迫溫度降低而呈先上升后下降的趨勢，與岳海等(2010)在熱帶起源的經(jīng)濟植物澳洲堅果中的研究結(jié)果一致。隨著脅迫溫度的降低，葉片中MDA含量逐漸升高，表明細胞膜脂發(fā)生了過氧化；當溫度繼續(xù)降低，MDA含量大幅上升達到峰值，膜脂過氧化加劇，葉片細胞受到嚴重傷害；之后MDA含量下降，但下降幅度不大，可能是可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低了細胞膜脂不飽和脂肪酸的過氧化程度，減緩了MDA的合成，對葉片細胞的保護作用增強(王冠群等，2014)。

本研究結(jié)果表明，金花茶和龍州金花茶耐寒性最強，檸檬黃金花茶和直脈金花茶的耐寒性次之，東興金花茶的耐寒性最差。本研究是在模擬低溫條件下進行金花茶種質(zhì)耐寒性比較，但在實際生產(chǎn)中遭遇低溫脅迫時可能還會伴隨水分等脅迫，其生理變化會更復(fù)雜，相關(guān)研究仍需進一步深入。

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Cold tolerance of five species of Camellia sect. Chrysantha

LI Ji-Tao, XIE Wei-Ling, CHAI Sheng-Feng, TANG Jian-Min, WEI Xiao*

( Guangxi Institute of Botany, Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences, Guilin 541006, Guangxi, China )

Camelliasect.Chrysanthaare world-famous economic and ornamental plants with high ornamental and medicinal values. In order to determine the cold tolerance, to lay a theoretical foundation for cold tolerance breeding and to provide a technical support for artificial cultivation ofCamelliasect.Chrysantha, two-year old leaves of five species were employed as materials and treated under artificially simulated low temperature environment, includingC.nitidissima,C.longzhouensis,C.limonia,C.multipetalaandC.tunghinensis. We obtained the changes of electrolyte leakage rates (REC) at 20 ℃ (normal temperature control), 8 ℃, -2 ℃, -7 ℃, -12 ℃, -17 ℃, -22 ℃ and -27 ℃ by using conductance method，calculated the semi-lethal low temperatures (LT50) based on the changes in electrolyte leakage rates (REC) under different low temperature stresses with the Logistic equation, and also analyzed the contents of free proline, soluble sugar and malondialdehyde (MDA) in leaves. The results showed that the semi-lethal temperature (LT50) of five species was:C.nitidissima-14.58 ℃,C.longzhouensis-14.27 ℃,C.limonia-13.44 ℃,C.multipetala-13.09 ℃, andC.tunghinensis-12.74 ℃. The cold tolerance of five speciesCamelliasect.Chrysanthacould be reliably reflected by the semi-lethal temperature.C.nitidissimaandC.longzhouensishad high cold tolerance.C.limoniaandC.multipetalahad medium cold tolerance.C.tunghinensishad poor cold tolerance. The REC of the five species increased following an S-curve with the temperature drop, and temperature showed highly significant negative correlation to cold tolerance. The contents of free proline, soluble protein and MDA increased first and then decreased. Under the same temperature treatment,C.nitidissimawith lower LT50temperature had higher contents of free proline, soluble protein and lower contents of MDA. The results provide the information for selection of cold-tolerant germplasm ofCamelliasect.Chrysantha.

Camelliasect.Chrysantha, relative electric conductivity, semi-lethal temperature, cold tolerance

10.11931/guihaia.gxzw201511023

2015-11-19

2016-02-15

國家自然科學(xué)基金(31160137)；廣西自然科學(xué)基金(2015GXNSFBA139051, 2016GXNSFAA380122)；廣西植物研究所基本業(yè)務(wù)費項目(桂植業(yè)14004) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31160137); the Natural Science Foundation of Guangxi (2015GXNSFBA139051, 2016GXNSFAA380122); the Science Research Foundation of Guangxi Institute of Botany (Guizhiye 14004)]。

李吉濤(1980-)，男，博士，助理研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究，(E-mail)ljtyouth@163.com。

*通訊作者： 韋霄，博士，研究員，主要從事生物多樣性保育研究，(E-mail)weixiao@gxib.cn。

Q945.78

A

1000-3142(2016)12-1403-07

李吉濤， 謝偉玲， 柴勝豐，等. 五種金花茶組植物的耐寒性比較研究 [J]. 廣西植物，2016，36(12):1403-1409

LI JT, XIE WL, CHAI SF，et al. Cold tolerance of five species ofCamelliasect.Chrysantha[J]. Guihaia，2016，36(12):1403-1409