倍他米松ELISA檢測方法的建立

郭 璐，張 晶,沙芳芳,趙興然,王 敬,王向紅，2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071001;2.河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001)

倍他米松ELISA檢測方法的建立

郭 璐1，張 晶1,沙芳芳1,趙興然1,王 敬1,王向紅1，2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071001;2.河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001)

為建立倍他米松(BET)ELISA檢測方法，先使BET與琥珀酸酐反應(yīng)，再采用活化酯法與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原；其次，利用免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體，經(jīng)Sephrose 4B-proteinA方法對抗體進(jìn)行純化；最后，建立倍他米松ELISA檢測方法。結(jié)果表明，免疫抗原偶聯(lián)成功，獲得了親和力較高的多克隆抗血清，間接競爭ELISA測定其滴度為102 400、IC15為6.60×10-5ng/mL和IC50為0.97 ng/mL。該方法適用于殘留在動(dòng)物性食品中的BET現(xiàn)場大批量檢測。

倍他米松；人工抗原；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

倍他米松(Betamethasone,BET)為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物[1]，具有較強(qiáng)的抗炎、抗過敏、抗休克及控制皮膚過敏作用[2]，對垂體、腎上腺皮質(zhì)的抑制作用較強(qiáng)。BET在家畜臨床中有較廣泛的應(yīng)用，但人體通過動(dòng)物性食品攝入過量BET可致代謝紊亂、骨質(zhì)疏松等，尤其可能會(huì)對兒童的正常生長造成較嚴(yán)重的影響。在此背景下，建立健全BET快速檢測方法有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

BET的含量檢測方法有UV、GC、GC/MS、HPLC[3]、LC/MS[4]等。UV是最具便捷性的，但準(zhǔn)確度欠缺、特異性不好，通常局限在醫(yī)院制劑的一般測定上使用。GC、GC/MS檢測手段必須通過硅烷化試劑處理，因此操作復(fù)雜。HPLC[5-6]檢測方法是現(xiàn)如今使用較多，用于BET制劑含量水平的測定手段，但是很少在文獻(xiàn)中看到使用。LC/MS檢測方法雖然靈敏度較高，專屬性較強(qiáng)，但該方法所需儀器價(jià)格高昂?；谝陨鲜聦?shí)，根據(jù)免疫學(xué)快速檢測方法的原理，本試驗(yàn)擬采取特異性多克隆抗體技術(shù)來制作檢測下限低、特異性高的抗體，構(gòu)建出與之相對應(yīng)的ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 BET、牛血清白蛋白(BSA)、福氏完全佐劑(FCA)、福氏不完全佐劑(FICA)、卵清白蛋白(OVA)、琥珀酸酐、無水吡啶、N，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺(DCC)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、過氧化氫脲、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-羥丁二酰亞胺(NHS)，美國Sigma公司產(chǎn)品；蛋白A瓊脂糖凝膠(CL-4B)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，北京熱景生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器 紫外分光光度儀，上海尤柯儀器股份有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)，上海安樂儀器廠產(chǎn)品；酶標(biāo)儀、洗板機(jī)，Thermo公司產(chǎn)品；電子分析天平，北京貝多利斯儀器公司產(chǎn)品；96孔酶標(biāo)板，Costar產(chǎn)品；垂直電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；單道、冷凍干燥機(jī)，北京博泰康儀器公司產(chǎn)品；八道微量可調(diào)移液槍，上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超濾離心管，美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 2只健康雄性日本大耳白家兔,8 周齡，體重約1.5 kg，購自保定養(yǎng)兔基地。購買后觀察7 d，以確認(rèn)其身體有無影響試驗(yàn)結(jié)果的異常狀況。1.1.4 緩沖溶液系統(tǒng) 覆蓋緩沖液:0.2 mol/L pH9.6的NaHCO3溶液；洗滌液:0.01 mol/L PBST；TMB底物溶液；終止液:1.2 mol/L 硫酸溶液；稀釋緩沖液:0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液；洗脫緩沖液: 0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸鹽酸緩沖液；稀釋緩沖液: 0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液；中和緩沖液: 1 mol/L pH 9.0Tris-HCl緩沖液；稀釋緩沖液: 0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液。

1.2 方法

1.2.1 混合酸酐法制備BET半抗原 取40 mg BET加5 mL無水吡啶至20 mL反應(yīng)瓶內(nèi)，充分溶解。然后加入50.996 mg重結(jié)晶琥珀酸酐，加熱回流(反應(yīng)所需時(shí)間通過TLC監(jiān)測確定)。將反應(yīng)獲得混合物移至含冰蒸餾水45 mL、濃鹽酸6 mL的混合液中，過濾分離析出的沉淀物。蒸餾水清洗使沉淀物的pH為5.0，干燥保存記作半抗原。

1.2.2 活潑酯法合成BET完全抗原 合成步驟參考Matsuura S等[7]方法并稍加改進(jìn)，取5 mg半抗原、7.331 mg NHS、13.430 mg DCC溶解在200 μL的DMF中，并振蕩至無沉淀，常溫條件下孵育3 h。然后吸取120 μL反應(yīng)液逐滴加至10 mg BSA(溶于2 mL 0.1 mol/L NaHCO3)當(dāng)中，低溫條件下反應(yīng)2 h，4 ℃條件下過夜；此外，把80 μL的反應(yīng)液逐滴加至10 mg OVA(溶解在2 mL 0.1 mol/L NaHCO3)當(dāng)中，此后步驟同上，最后，進(jìn)行高速離心并使用超濾管將雜質(zhì)從溶液中分離出來。所得上清液保存于-20 ℃環(huán)境中。

1.2.3 SDS-PAGE法鑒定偶聯(lián)物的合成 制備試驗(yàn)所需的分離膠，丙烯酰胺含量為0.1 g/mL，濃縮膠含量為0.05 g/mL。將均為10 mg/mL的BSA、BET-BSA、OVA、BET-OVA加入到等體積的上樣緩沖液當(dāng)中，并混合均勻，高溫處理5 min后加樣。將初始電壓調(diào)至為80 V，當(dāng)濃縮膠跑完之后，立即增加電壓至120 V，當(dāng)指示劑跑出分離膠之后，隨即終止通電。在常溫下，使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色過夜，制備250 mL/L乙醇與80 mL/L乙酸混合的脫色液，在水平搖床上進(jìn)行洗滌，直至膠體透明，最后使用凝膠成像儀進(jìn)行結(jié)果的觀察和記錄。

1.2.4 BET多克隆抗體的制備 將人工免疫原BET-BSA溶解在0.001 g/mL的鹽水當(dāng)中，同等劑量的佐劑混合，乳化充分，然后免疫2只健康雄性日本大耳白家兔(8 周齡)，免疫方式是在其后頸部位6點(diǎn)、大腿部位2點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，連續(xù)接種6次，每次間隔14 d，免疫程序見表1。第3、4、5次加強(qiáng)免疫程序結(jié)束后10 d，在家兔耳靜脈取血，通過ELISA檢測手段對滴度進(jìn)行分析，同時(shí)著重觀察其特異性程度。在第6次強(qiáng)化免疫過程之后7 d，取其心房內(nèi)的鮮血，并將其放置于37 ℃環(huán)境下1 h，之后在4 ℃進(jìn)行充分凝血，過夜，將血清進(jìn)行4 000 r/min離心15 min，加入疊氮鈉(0.000 1 g/mL)放置于-20 ℃保存。

表1 免疫程序

Table 1 The procedure of immunization

免疫次數(shù)Timesofimmunization免疫劑量/只Immunedoseperrabbit時(shí)間間隔/dTimeinterval首次免疫1stimmunization1mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFCA1mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFCA-第2次加強(qiáng)免疫2ndboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第3次加強(qiáng)免疫3rdboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第4次加強(qiáng)免疫4thboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第5次加強(qiáng)免疫5thboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第6次加強(qiáng)免疫6thboosterimmunization1mg免疫原+1mL生理鹽水+1mLFICA1mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14

1.2.5 Bet多克隆抗體的鑒定

1.2.5.1 效價(jià)測定 采用間接ELISA分析法測定多克隆抗體血清的效價(jià)，具體操作如下：抗原(BET-OVA)4 ℃包被過夜。洗板，加0.05 g/mL脫脂奶粉，200 μL/皿，37 ℃條件下孵育1 h封閉。洗板，加使用PBS(1×)倍比稀釋成試驗(yàn)所需的不同濃度的血清，100 μL/皿，37 ℃條件下孵1 h，洗板。加用PBS(1×)1∶2 500倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)羊抗兔血清，100 μL/皿，37 ℃條件下孵育0.5 h，加底物液37 ℃孵育30 min終止反應(yīng)。450 nm波長下測定OD值。

1.2.5.2 親和力測定 采用間接ELISA分析方法測定多克隆抗體血清親和力，具體操作如下：抗原(BET-OVA)4℃包被過夜。洗板，加0.05 g/mL脫脂奶粉，200 μL/皿，37 ℃條件下孵育1 h封閉。洗板，加使用PBS(1×)倍比稀釋成試驗(yàn)所需的不同濃度的BET標(biāo)準(zhǔn)品，100 μL/皿，37 ℃條件下孵育1 h，洗板。加用PBS(1×)1∶2 500倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)羊抗兔，100 μL/皿，37 ℃條件下孵育0.5 h，加底物液37 ℃孵育30 min終止反應(yīng)。450 nm波長下測定吸光值。

由所測得到的吸光度值計(jì)算其抑制率(inhibition)，計(jì)算公式如下：

抑制率(I)%=[1-(OD樣品-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100

以x軸表示標(biāo)品不同濃度，y軸為其相應(yīng)濃度下計(jì)算所得抑制率，繪制出抑制曲線。

1.2.6 抗體濃度測定 使用ProteinA-Sepharose-4B親和層析柱將上述試驗(yàn)所得抗血清進(jìn)行純化，收集其OD值大于0.2的試管溶液，合并后分別在280 nm和260 nm波長處對4 ℃抗體進(jìn)行掃描，把所得OD值代入公式：抗體含量(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀釋倍數(shù)。

1.2.7 抗體純化效果的鑒定 使用了紫外分光光度計(jì)法[8]對其純度進(jìn)行檢測，首先進(jìn)行PBS緩沖液的檢測，其結(jié)果作為基線，在280 nm波長處對用PBS適當(dāng)稀釋后的未純化的血清和純化后的血清分別進(jìn)行紫外光譜掃描[9]。

采用間接競爭法檢測血清純度，并對處理前后的結(jié)果進(jìn)行分析，使用未經(jīng)處理以及處理后的抗體進(jìn)行間接ELISA競爭反應(yīng)，制作出抑制曲線，并分析試驗(yàn)對抗體靈敏度的影響。

1.2.8 ELISA分析方法的建立 根據(jù)間接競爭ELISA的檢測方法，檢測到不同濃度梯度BET的OD值，通過吸光值數(shù)值來計(jì)算出對應(yīng)的抑制率，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 BET-BSA完全抗原的鑒定

在SDS-PAGE電泳系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小是遷移率的主要影響因素，由此可認(rèn)為樣品分子質(zhì)量大小與遷移率成反比。從圖1中兩個(gè)條帶可以看出，載體蛋白BSA條帶比BET-BSA條帶略微優(yōu)先，據(jù)此可推斷人工抗原的分子量大于載體蛋白，人工抗原合成成功。

2.2 抗體效價(jià)的測定

在進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)中，在一段時(shí)期內(nèi)，所進(jìn)行的免疫反應(yīng)試驗(yàn)次數(shù)同血清中抗體效價(jià)成正比，BET-1從第1次取血抗血清效價(jià)為3 200到最后一次心臟取血后抗血清效價(jià)均達(dá)到102 400，BET-2從第1次取血抗血清效價(jià)為6 400到最后一次心臟取血后抗血清效價(jià)均達(dá)到102 400。由此說明，此免疫程序能獲得較高效價(jià)的抗體。

1.BSA; 2.BET-BSA

2.3 抗血清親和力的測定

由4次取血后測定的間接競爭曲線圖2和圖3能夠看出，同一濃度BET的抑制率大體上同免疫次數(shù)成正比，同時(shí)，BET-1的IC50從8.20 ng/mL下降到1.72 ng/mL，對于BET-2的IC50從15.05 ng/mL下降到0.37 ng/mL。因此推斷，抗血清對BET的親和力可通過本免疫試驗(yàn)得到顯著增強(qiáng)。

圖2 BET-1抗血清親和力變化

圖3 BET-2抗血清親和力變化

2.4 抗體純化

在280 nm和260 nm波長處[10]對4 ℃抗體進(jìn)行掃描后，把所得OD值代入公式：抗體含量(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀釋倍數(shù)。計(jì)算得出純化后BET-1抗體的濃度是1.06 mg/mL，BET-2的濃度是1.53 mg/mL(圖4)。

圖4 抗血清純化前后色譜圖

據(jù)圖5和圖6可看出，未經(jīng)純化的血清光譜掃描圖中在415、537、578 nm處均有較為明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn)，經(jīng)純化后的血清未出現(xiàn)雜質(zhì)峰，并且在280 nm有比較明顯的蛋白吸收峰，據(jù)此可以表明抗血清在純化以后可得比較單一的免疫球蛋白。

1.未經(jīng)純化抗血清；2.純化后抗血清1.Unpurified antiserum; 2.Purified antiserum

圖7和圖8間接競爭ELISA鑒定抗血清純化效果可以推斷，經(jīng)純化后的抗血清與抗原的親和力有所提高，IC50和IC15有所下降，表明純化多克隆抗體可在一定程度上增強(qiáng)抗原抗體特異性反應(yīng)。

2.5 ELISA分析方法的建立

通過對兩種抗體BET-1和BET-2的效價(jià)和親和力測定，確定了BET-2抗體作為本研究的檢測抗體。本次試驗(yàn)利用矩陣法優(yōu)化包被原的最適濃度和抗血清的稀釋度，初步所選最佳工作濃度是吸光度在1.0左右的包被量和抗血清稀釋度。進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng)，建立BET的標(biāo)準(zhǔn)曲線，x軸以BET的濃度，y軸抑制率(圖9)。 對圖9中的曲線進(jìn)行直線方程擬合，得到線性回歸方程為y=3.647 41ln(x)+50.11(R2=0.987 7)，經(jīng)計(jì)算可得IC50=0.97 ng/mL，最低檢出限IC15=6.60×10-5ng/mL，說明了免疫抗血清中含有較高純度抗BET抗體。

1.未經(jīng)純化抗血清；2.純化后抗血清1.Unpurified antiserum;2.Purified antiserum

圖7 BET-1抗血清純化前后其親和力的變化圖

圖8 BET-2抗血清純化前后其親和力的變化圖

3 討論

本試驗(yàn)采取混合酸酐法成功合成免疫原(BET-BSA)和包被原(BET-OVA)，并經(jīng)用SDS凝膠電泳法對試驗(yàn)的作用進(jìn)行了分析，使得試驗(yàn)結(jié)果更具理論指導(dǎo)性。此外，分期注射的免疫方法能夠獲較得高效價(jià)及結(jié)合能力更高的抗體。多克隆抗體通過進(jìn)一步純化后，利用紫外分光光度計(jì)對血清純度進(jìn)行了測定，同時(shí)還使用了間接競爭ELISA法加以佐證，通過減少對抗原抗體特異性有影響的其他蛋白，能夠顯著增強(qiáng)該抗體的檢測靈敏度，其IC15降低。所以，特異性高、結(jié)合能力好的抗體制備成功，給ELISA方法的進(jìn)一步發(fā)展提供了重要的實(shí)際依據(jù)，同時(shí)也推動(dòng)了其向著快速檢測方向的發(fā)展。建立了間接競爭ELISA方法，并繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到該方法的IC50為0.97 ng/mL，最低檢出限可達(dá)6.60×10-5ng/mL，此方法檢測不僅僅下限低、抗干擾能力強(qiáng)，同時(shí)也兼具ELISA檢測法微量、快速、低成本以及操作簡單等優(yōu)勢。

圖9 BET標(biāo)準(zhǔn)曲線

[1] 唐麗紅,戚靜燕,馬香妹.浙江省12家醫(yī)院糖皮質(zhì)激素應(yīng)用分析[J].中國藥房,2015(2):159-160.

[2] 張楚怡,毛越蘋.糖皮質(zhì)激素依賴性皮炎的研究進(jìn)展[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2015(2):148-151.

[3] 任 韡,白 林,蔡 樂,等.HPLC法測定倍他米松尿素乳膏中倍他米松和羥苯乙酯的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2014(6):527-529.

[4] 曲婷婷,張 蕊,王本杰,等.LC-MS/MS法測定人血漿中倍他米松[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2008(4):402-407.

[5] 李 存,吳銀良,楊 挺.同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肝中地塞米松和倍他米松殘留量[J].分析化學(xué),2010(2):271-274.

[6] 廉 洪,李羚羚,張春泉.倍他米松凝膠的制備及質(zhì)量控制[J].中國藥房,2009,20(34):2691-2693.

[7] Matsuura S,Kita H,Takagaki Y.Specifity of mouse monoclonal anti-okadaic antibodies to okadaic acid and its analogs among diarrhetic shellfish toxins[J].Biosci Biotechnol Biochem,1994,58(8):1471-1475.

[8] 沈星燦,劉新艷,梁 宏,等.牛血紅蛋白與銀納米粒子相互作用的光譜研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2006,64(6):469-474.

[9] 朱衛(wèi)華,趙志敏,郭 昕,等.基于血清紫外-可見吸收光譜的膽固醇含量研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2009,29(4):1004-1007.

[10] 馮 梁.磺胺二甲嘧啶膠體金免疫層析試紙條的研制[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

Establishment of ELISA Method for Detecting Betamethasone

GUO Lu1,ZHANG Jing1,SHA Fang-fang1,ZHAO Xing-ran1,WANG Jing1,WANG Xiang-hong1，2

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei，071001,China;2.HebeiCenterforAgriculturalProductsProcessingEngineeringandTechnologyResearch,Baoding,Hebei，071001,China)

To establish betamethasone (BET) ELISA analysis method, the first step is to have BET reacted with amber acid anhydride and then coupled with bovine serum albumin (BSA) to produce immunogen with the help of active ester method; second, polyclonal antibody is obtained by immunizing rabbits, and the antibody is purified via Sephrose 4B-proteinA method; the final step is to construct BET ELISA analysis method. The results showed that immunogen succeeded in the coupling,and polyclonal antisera with high affinity were obtained. The detection by indirect competition ELISA showed its titer is 102 400, IC156.60×10-5ng/mL, and IC500.97 ng/mL. This method is applicable in mass field detection of BET residue in the animal derived food.

betamethasone;artificial antigen;polyclonal antibody；ELISA

2016-03-10

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(152776120D)

郭 璐(1990-)，女，河北定州人，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程研究。*通訊作者

S859.83

A

1007-5038(2016)12-0050-05