• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山羊IFN-γ免疫血清制備及抗體ELISA檢測方法的建立

    2017-01-04 10:47:42劉鶴媛岳進華張洪杰陳德坤
    動物醫(yī)學(xué)進展 2016年12期
    關(guān)鍵詞:包被孵育山羊

    劉鶴媛,周 銘,岳進華,張洪杰,陳德坤

    (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

    山羊IFN-γ免疫血清制備及抗體ELISA檢測方法的建立

    劉鶴媛,周 銘,岳進華,張洪杰,陳德坤*

    (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

    為制備山羊干擾素-γ(IFN-γ)免疫血清并建立山羊IFN-γ抗體ELISA檢測方法,以原核表達的山羊γIFN重組蛋白(rIFN-γ)為材料,免疫小鼠制備免疫血清;通過對測定不同的抗原包被濃度及包被時間,酶標(biāo)抗體稀釋度,免疫血清的孵育時間等條件的優(yōu)化建立檢測抗體效價的ELISA檢測方法,并采用建立的方法測定免疫血清的抗體效價。結(jié)果顯示,rIFN-γ抗原包被濃度為10 μg/mL,4 ℃包被12 h;酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶5 000;免疫血清孵育時間為60 min,可以得到最佳ELISA的檢測結(jié)果。重復(fù)試驗顯示該方法變異系數(shù)(CV)在1.5%~5%之間。采用建立的方法測得免疫小鼠免疫血清效價為107。該ELISA檢測方法靈敏高,穩(wěn)定性好,為山羊IFN-γ抗體檢測提供了技術(shù)支持。

    山羊;rIFN-γ;免疫血清;酶聯(lián)免疫吸附試驗

    γ干擾素(IFN-γ)是一種重要的細胞因子,主要參與細胞免疫[1]。病毒、細胞內(nèi)寄生菌等病原體入侵機體[2],或腫瘤細胞的產(chǎn)生[3],都會刺激機體產(chǎn)生IFN-γ,誘導(dǎo)巨噬細胞、T細胞、B細胞等細胞MHCⅡ類分子的表達,提高抗原遞呈能力;IFN-γ也能活化巨噬細胞、NK細胞等,提高其對病原體的殺傷能力[4],可以反映機體的細胞免疫狀態(tài)。 近年來,隨著山羊集約化養(yǎng)殖的擴大,山羊疫病大規(guī)模暴發(fā)的現(xiàn)象日益突出,疫病防控工作也變得尤為重要。以IFN-γ為評估指標(biāo),可以評估機體細胞免疫水平,為疫病防控工作提供參考。目前,已見有關(guān)于其他動物IFN-γ的ELISA檢測方法[5-6],但尚未見有關(guān)山羊IFN-γ的檢測方法。本試驗擬建立抗IFN-γ抗體ELISA檢測方法,為后續(xù)制備抗山羊IFN-γ單克隆抗體,建立山羊IFN-γ的ELISA檢測方法打下基礎(chǔ),也為臨床監(jiān)測評估山羊免疫狀態(tài)提供有效的手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 雌性Balb/c小鼠,6周齡~8周齡,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

    1.1.2 主要試劑與儀器 未除鹽的純化山羊rIFN-γ凍干粉,為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室保存;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品;羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體為北京博奧森生物公司產(chǎn)品;TMB顯色液為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品;酶標(biāo)板為Castor公司產(chǎn)品;其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 抗原制備 將純化的山羊rIFN-γ凍干粉溶于蒸餾水,配制成1 mg/mL的液體,取弗氏完全佐劑與rIFN-γ等量混勻,用三通管進行乳化,乳化約1 h后,取1滴乳化物置于靜止水面,乳化物1 min內(nèi)不散開,表明乳化達到目的,此免疫原供小鼠首次免疫使用。按照同樣的方法制備rIFN-γ與弗氏不完全佐劑乳化的免疫原,供第2次免疫使用。rIFN-γ水劑抗原直接用蒸餾水溶解,制備成1 mg/mL即可。上述3種免疫原制備完成后,4℃保存,供1周內(nèi)小鼠免疫使用。

    1.2.2 小鼠免疫及免疫血清制備 第1次免疫小鼠,按照100 μL/只,腹部皮下多點注射(50 μL/點);首免后14 d,進行第2次免疫,免疫劑量同第1次,免疫部位選擇第1次未注射抗原的腹部皮下位點(50 μL/點);2免后第14天,用水劑抗原免疫小鼠,免疫劑量為100 μL/只,腹腔注射。之后每隔1周,用水劑抗原加強免疫小鼠1次,免疫劑量和途徑同第3次免疫。末次免疫后10 d左右,摘眼球法采集免疫小鼠血液并分離血清,此為免疫血清(陽性血清)。另采集未免小鼠血液并分離血清,作為陰性血清。血清置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 間接ELISA操作方法 用pH9.6 、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原(山羊rIFN-γ),100 μL/孔,4 ℃包被過夜;次日棄去孔內(nèi)液體,用pH7.4 含0.5 mL/L的Tween-20的PBS(PBST)洗滌2~3遍(以下簡稱洗滌),加入50 g/L脫脂奶粉,100 μL/孔,37℃封閉1 h;棄去封閉液,洗滌,加入pH7.4的PBST稀釋的小鼠抗血清,并設(shè)陰性對照(陰性血清),100 μL/孔,37℃孵育1 h;棄去小鼠血清,洗滌,加入羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗,100 μL/孔,37 ℃孵育1 h;棄去酶標(biāo)二抗,洗滌,加入TMB顯色液,100 μL/孔,避光孵育15 min;加入2 mol/L硫酸,100 μL/孔,終止反應(yīng),置于酶標(biāo)儀,讀取OD450 nm值。待測孔OD450 nm值(P)比陰性對照孔OD450 nm值(N)大于或等于2.1(即P/N≥2.1)時,待測孔判為陽性孔。

    1.2.4 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體最佳稀釋比例的確定 用PBST稀釋羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體,按照1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000的比例稀釋,每一稀釋度做3個重復(fù),100 μL/孔,37 ℃包被2 h;棄去孔內(nèi)液體,用PBST洗滌3次,以50 g/L脫脂奶粉作為封閉液,100 μL/孔,37℃封閉1 h;棄去孔內(nèi)液體,用PBST洗滌3次,加入TMB顯色液,100 μL/孔,避光孵育15 min;加入2 mol/L的硫酸,100 μL/孔,終止反應(yīng),置于酶標(biāo)儀,取OD450 nm值最接近1.0的孔對應(yīng)的羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋比例為最佳稀釋比例。

    1.2.5 抗原包被濃度及包被時間的確定 用pH 9.6、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液10倍連續(xù)稀釋山羊rIFN-γ為100.00、10.00、1.00、0.100 μg/mL,每一濃度的抗原分別與陽性、陰性血清反應(yīng),按照上述間接ELISA操作方法,檢測不同濃度包被抗原所對應(yīng)的OD450 nm值。以P/N值最大的孔所對應(yīng)的抗原包被濃度為最佳抗原包被濃度。 以最佳抗原包被濃度將抗原包被10、11、12、13、14 h,并按照上述間接ELISA操作方法,檢測不同包被時間所對應(yīng)的OD450 nm值,以O(shè)D450 nm值趨于穩(wěn)定后對應(yīng)的最短包被時間為最佳包被時間。

    1.2.6 血清孵育時間的確定 取小鼠陽性血清,用PBST以1∶1 000稀釋,按照上述ELISA操作方法,分別孵育30 、45、60、75、90 min,檢測不同孵育時間對應(yīng)的OD450 nm值,以O(shè)D450 nm值穩(wěn)定后對應(yīng)的最短孵育時間為最佳孵育時間。

    1.2.7 重復(fù)試驗 取一份小鼠陽性血清分為A、B、C 3等份,分別在3個不同時間段,按照優(yōu)化條件,進行間接ELISA操作,檢測不同時間所得OD450 nm值,根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果計算變異系數(shù)(CV)。

    1.2.8 抗山羊rIFN-γ免疫血清效價的測定 用PBST稀釋陽性血清(抗rIFN-γ抗體)及陰性血清,均按照1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010的比例稀釋,并按照優(yōu)化條件進行ELISA操作,檢測陰、陽性血清按照不同比例稀釋時所得OD450 nm值,以P/N≥2.1為陽性結(jié)果,測免疫血清抗體效價。

    2 結(jié)果

    2.1 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋度優(yōu)化結(jié)果

    將羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體按照不同比例稀釋后,經(jīng)ELISA檢測,OD450 nm值見表1,酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶5 000時,OD450 nm值最接近1.0,為最佳稀釋度。

    2.2 山羊 rIFN-γ包被濃度優(yōu)化結(jié)果

    山羊rIFN-γ作為包被抗原,稀釋為不同濃度后,經(jīng)ELISA檢測,當(dāng)包被抗原濃度為10 μg/mL時,所得P/N值最大,因此,抗原的最佳包被濃度為10 μg/mL(表2)。

    2.3 山羊rIFN-γ包被時間優(yōu)化結(jié)果

    當(dāng)包被時間超過12 h(包括12 h)后,OD450 nm值趨于穩(wěn)定,因此,山羊rIFN-γ的最佳包被時間為12 h(表3)。

    2.4 免疫血清孵育時間

    小鼠陽性血清不同孵育時間所對應(yīng)的OD450 nm值見表4,當(dāng)孵育時間超過60 min(包括60 min)后,OD450 nm值趨于穩(wěn)定,因此,小鼠血清的最佳孵育時間為60 min。

    2.5 重復(fù)性試驗

    根據(jù)公式,變異系數(shù)(CV)=(標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均值Mean)×100%,計算不同時間同一小鼠陽性血清ELISA檢測結(jié)果的變異系數(shù)(表5),ELISA檢測結(jié)果的變異系數(shù)(CV)在1.5%~5%,說明該間接ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

    2.6 抗山羊rIFN-γ免疫血清抗體效價檢測結(jié)果

    將陰、陽性血清按照不同比例稀釋后,所得OD450 nm及P/N值見表6,根據(jù)P/N值可知抗山羊IFN-γ免疫血清抗體效價為107。

    表1 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋度檢測結(jié)果

    Table 1 The determinition result of goat anti-mouse IgG-HRP dilutions

    項目Item酶標(biāo)抗體稀釋度IgG-HRPdilution1∶10001∶30001∶50001∶70001∶10000OD450nm1.453±0.0741.209±0.0531.034±0.0430.892±0.0320.783±0.017

    表 2 山羊rIFN-γ包被濃度優(yōu)化結(jié)果

    Table 2 The optimization result of coating concentration of goat rIFN-γ

    rIFN-γ濃度/(μg·mL-1)rIFN-γconcentrationOD450nm陽性血清(P)Positiveserum陰性血清(N)NegativeserumP/N100.001.446±0.0220.076±0.01319.0310.001.267±0.0320.063±0.00920.111.001.203±0.0180.074±0.01116.260.100.412±0.0130.056±0.0087.36

    表3 山羊rIFN-γ包被時間

    Table 3 The coating time of goat rIFN-γ

    項目Item包被時間/hCoatingtime1011121314OD450nm0.842±0.0730.937±0.0831.032±0.0381.041±0.0221.037±0.019

    表4 免疫血清孵育時間

    Table 4 The incubation time of immune serum

    項目Item孵育時間/minIncubationtime3045607590OD450nm0.768±0.0920.896±0.0431.043±0.0381.037±0.0231.041±0.016

    表5 間接ELISA檢測方法的重復(fù)性試驗結(jié)果

    Table 5 Repetitive test results of indirect ELISA method

    樣品SamplesOD450nm檢測次數(shù)Testtimes123平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)/%CVA1.0260.9970.9961.0060.01391.38B1.2101.1031.1171.1430.04754.15C1.1031.1331.1021.1130.01441.29

    表6 抗山羊rIFN-γ抗體效價測定結(jié)果

    Table 6 Potency test results of antibody against goat rIFN-γ

    項目Item血清稀釋倍數(shù)及對應(yīng)的OD450nm值SerumdilutionsanditscorrespondingOD450nmvalues1031041051061071081091010陽性血清Positiveserum0.9390.7220.6320.4800.1340.1020.0820.071陰性血清Negativeserum0.0790.0690.0710.0620.0580.0560.0570.054P/N11.910.58.97.72.31.81.41.3

    3 討論

    IFN-γ由天然免疫系統(tǒng)的NK細胞分泌,在特異性免疫反應(yīng)中主要由活化的Th1、CTL分泌。NK細胞、活化Th1和CTL數(shù)量越多,IFN-γ分泌量就越多,體內(nèi)IFN-γ水平就越高,機體抗病毒等免疫功能就越強。準(zhǔn)確測定IFN-γ含量,對于評估機體細胞免疫功能狀態(tài)極為重要。通常測定IFN-γ水平,主要應(yīng)用抗IFN-γ單抗試劑盒[8-9]。目前市面未見山羊IFN-γ檢測試劑盒,主要原因是未有山羊IFN-γ單抗研制成功,這極大地限制了山羊免疫學(xué)基礎(chǔ)研究,以及相關(guān)的疫苗免疫效果評估等工作。本研究建立的山羊IFN-γ抗體ELISA檢測方法,對于實驗室后續(xù)研制山羊單抗工作奠定了基礎(chǔ)。

    無論是制備山羊IFN-γ免疫血清還是山羊IFN-γ單抗,對IFN-γ都具有特別要求。純化的天然IFN-γ無論是用于免疫原還是包被抗原,都是最理想的抗原,但實際工作中這一思路的可行性較差。實驗室研發(fā)細胞因子單抗,首選免疫原通常考慮原核表達產(chǎn)物,主要基于其易于純化并且可大量獲得[10],但要求原核表達的細胞因子必須和天然分子之間具有相同的功能性B細胞表位。本實驗室前期已成功獲得了純化的具有免疫活性的山羊IFN-γ原核表達產(chǎn)物[7],該產(chǎn)物能夠抑制羊口瘡病毒(ORFV)感染山羊胎兒成纖維細胞,具有良好的抗病毒生物學(xué)活性,表明該產(chǎn)物具有與山羊天然IFN-γ相同免疫活性,二者在活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)部位可能存在相同的功能性B細胞表位。以此為基礎(chǔ)所制備的免疫血清和建立的IFN-γ抗體ELISA檢測方法,無疑具有識別山羊IFN-γ活力,為山羊IFN-γ研究和水平測定提供了可行的技術(shù)手段。影響ELISA測定結(jié)果的因素較多,關(guān)鍵因素包括抗原包被濃度及時間、酶標(biāo)抗體稀釋度、免疫血清孵育時間等,這些因素中的任何一個因素優(yōu)化條件不到位,都會對測定結(jié)果的特異性和靈敏度產(chǎn)生影響。本研究優(yōu)化結(jié)果顯示包被抗原濃度為10 μg/mL。無論包被抗原濃度高于還是低于這一濃度,P/N值均會降低,偏離此包被濃度愈遠,靈敏度愈低;在確定酶標(biāo)抗體稀釋度時,參考稀釋范圍為1∶1 000~1∶10 000,本研究設(shè)計5個不同的稀釋比例,優(yōu)化的稀釋比例為1∶5 000。這一優(yōu)化結(jié)果既避免了酶標(biāo)抗體的浪費,又保證了所得結(jié)果的可靠性;當(dāng)抗原包被時間為12 h,小鼠血清孵育時間為60 min時,OD450 nm值不再隨時間的延長而增加,表明此時各自的反應(yīng)充分。按照以上優(yōu)化條件重復(fù)ELISA操作,結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)保持在1.5%~5%之間,且利用該ELISA方法所測得的小鼠陽性血清的穩(wěn)定效價為107,表明本研究建立的方法具有良好的穩(wěn)定性。

    [1] 金伯泉. 細胞與分子免疫學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 183-184.

    [2] Almanzar G, Schmalzing M, Trippen R, et al. Significant IFNγ responses of CD8+T cells in CMV-seropositive individuals with autoimmune arthritis[J]. J Clin Virol,2016, 77: 77-84.

    [3] Briesemeister D, Sommermeyer D, Loddenkemper C, et al. Tumor rejection by local interferon gamma induction in established tumors is associated with blood vessel destruction and necrosis[J]. Int J Cancer,2011, 128(2): 371-378.

    [4] Young H A, Bream J H. IFN-gamma: recent advances in understanding regulation of expression, biological functions, and clinical applications[J]. Curr Top Microbiol Immunol,2007, 316: 97-117.

    [5] 張改梅,賈 紅,侯紹華,等. 檢測牛IFN-γ雙抗體夾心ELISA的建立及在牛結(jié)核病診斷上的初步應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2014(10): 1693-1698.

    [6] 李志中. 抗雞γ-干擾素單克隆抗體的制備及定量抗原ELISA檢測方法的建立[D]. 內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

    [7] 安 貝. 山羊IFN-γ基因的克隆表達及抗ORFV活性鑒定[D]. 陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

    [8] 楊永輝. 一種γ-干擾素定量檢測方法及試劑盒[P]. 中國專利: CN201510037981.1, 2015-4-29.

    [9] 陳利蘋, 劉思國, 朱海波, 等. 一種抗天然牛γ-干擾素的單克隆抗體,分泌該抗體的雜交瘤細胞株及應(yīng)用[P]. 中國專利: CN201410668539.4, 2015-4-29.

    [10] 朱玉賢. 現(xiàn)代分子生物學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007.

    Preparation of Goat IFN-γ Immune Serum and Establishment of an ELISA for Detecting Antibodies

    LIU He-yuan,ZHOU Ming,YUE Jin-hua,ZHANG Hong-jie,CHEN De-kun

    (CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

    In order to prepare immune serum against goat IFN-γ and develop a method of ELISA, Balb/c mice were immunized with recombinant goat IFN-γ (rIFN-γ) expressed prokaryotically to produce immune serum, and then the coating concentration and time of rIFN-γ, the HRP-IgG dilution, and incubation time of the immune serum were all determined to optimize the ELISA method. And the potency of immune serum was also detected. The results suggested that an optimized ELISA result could be acquired when rIFN-γ was coated at 4℃ for 12 h in a concentration of 10 μg/mL, HRP-IgG was diluted at 1∶5 000, and the immune serum was incubated for 60 min. The repeated experiments suggested that the coefficient of variation (CV) varied between 1.5% and 5%. The immune serum potency was proved to be 107. This ELISA method with high sensitivity and stability could provide a strong requirement for goat IFN-γ detection.

    goat; rIFN-γ; immune serum; ELISA

    2016-04-12

    陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTTSNY04-04)

    劉鶴媛(1989-),女,河南周口人,碩士研究生,主要從事獸醫(yī)病原學(xué)與免疫學(xué)研究。 *通訊作者

    S852.4

    A

    1007-5038(2016)12-0024-04

    猜你喜歡
    包被孵育山羊
    多糖包被在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生、診斷及治療中的作用研究進展
    夏季如何讓山羊增膘
    ELISA兩種包被方法在牛乳氯霉素測定中的比較
    山羊受騙
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    聰明的山羊
    坐公交
    上海故事(2015年13期)2016-01-22 13:25:09
    跟一天了
    伴侶(2015年5期)2015-09-10 07:22:44
    中文字幕最新亚洲高清| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| www.www免费av| 久久草成人影院| 国产精品野战在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品,欧美在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美3d第一页| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品人妻1区二区| 床上黄色一级片| 久久久久国内视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产乱人伦免费视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品av久久久久免费| 99在线视频只有这里精品首页| 久久伊人香网站| 亚洲最大成人中文| 美女大奶头视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人性生交大片免费视频hd| 中文字幕高清在线视频| 此物有八面人人有两片| 欧美性猛交黑人性爽| 给我免费播放毛片高清在线观看| 天堂网av新在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 深夜精品福利| 中国美女看黄片| 精品久久久久久成人av| 日韩精品中文字幕看吧| 91av网一区二区| 亚洲九九香蕉| 99久国产av精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产三级黄色录像| xxxwww97欧美| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美成人性av电影在线观看| 国产久久久一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国内揄拍国产精品人妻在线| 丝袜人妻中文字幕| 怎么达到女性高潮| 男人舔奶头视频| 露出奶头的视频| 国产美女午夜福利| 国产av麻豆久久久久久久| 1000部很黄的大片| 嫩草影院精品99| 午夜激情福利司机影院| 少妇的逼水好多| 国产乱人视频| 99国产综合亚洲精品| x7x7x7水蜜桃| netflix在线观看网站| 男人舔奶头视频| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| a级毛片在线看网站| svipshipincom国产片| 网址你懂的国产日韩在线| 国产不卡一卡二| 岛国在线免费视频观看| 久久九九热精品免费| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 99视频精品全部免费 在线 | 99国产精品一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲九九香蕉| 精品久久久久久久久久久久久| 九九在线视频观看精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 禁无遮挡网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本黄大片高清| 深夜精品福利| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一二三四社区在线视频社区8| 久9热在线精品视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩人妻高清精品专区| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲精品456在线播放app | 美女cb高潮喷水在线观看 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久午夜综合久久蜜桃| 大型黄色视频在线免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产视频内射| 一个人看视频在线观看www免费 | 青草久久国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美激情在线99| 日本在线视频免费播放| ponron亚洲| 久久久精品欧美日韩精品| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄色女人牲交| 欧美日韩一级在线毛片| 一本综合久久免费| 国产欧美日韩一区二区三| 免费观看的影片在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品综合久久久久久久免费| 性色av乱码一区二区三区2| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 两个人的视频大全免费| 国产精品av久久久久免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日本成人三级电影网站| 九九热线精品视视频播放| e午夜精品久久久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲美女视频黄频| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 午夜两性在线视频| 亚洲中文av在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 曰老女人黄片| 波多野结衣高清作品| 久久久国产成人免费| 国产激情欧美一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 午夜激情欧美在线| 网址你懂的国产日韩在线| 国产高清视频在线观看网站| 国产97色在线日韩免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲第一电影网av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品精品国产色婷婷| 色av中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲九九香蕉| 欧美一级a爱片免费观看看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 俺也久久电影网| 午夜日韩欧美国产| 99热只有精品国产| 热99re8久久精品国产| 日韩国内少妇激情av| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美日韩精品网址| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久成人av| 男人舔奶头视频| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 1000部很黄的大片| 69av精品久久久久久| 国产高清三级在线| 午夜福利18| 日本 欧美在线| 怎么达到女性高潮| 91av网一区二区| 性色avwww在线观看| 一级毛片女人18水好多| 国产野战对白在线观看| 国产精品久久视频播放| 91九色精品人成在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 色精品久久人妻99蜜桃| 99久久精品一区二区三区| 午夜影院日韩av| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久久久免费视频了| 无遮挡黄片免费观看| 日本 欧美在线| 日日夜夜操网爽| 午夜影院日韩av| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产视频内射| 国产精品99久久久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 久久久久国内视频| 亚洲人成网站高清观看| 无遮挡黄片免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 日本熟妇午夜| 国产成人福利小说| 欧美一级毛片孕妇| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品 国内视频| 免费观看精品视频网站| 国产不卡一卡二| 久久久色成人| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 悠悠久久av| av视频在线观看入口| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲国产看品久久| 国产成人av教育| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品影院久久| 成年人黄色毛片网站| 特级一级黄色大片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 午夜久久久久精精品| 嫩草影视91久久| 亚洲五月天丁香| 黑人操中国人逼视频| 一进一出好大好爽视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久人人精品亚洲av| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩国内少妇激情av| 国产成人福利小说| 啦啦啦韩国在线观看视频| 美女午夜性视频免费| 国产美女午夜福利| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品久久二区二区91| 免费一级毛片在线播放高清视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 又爽又黄无遮挡网站| 一区二区三区激情视频| 欧美激情在线99| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美在线黄色| 香蕉国产在线看| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲av第一区精品v没综合| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲美女视频黄频| aaaaa片日本免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 中文字幕高清在线视频| 深夜精品福利| 最新美女视频免费是黄的| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产99白浆流出| 两个人视频免费观看高清| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美午夜高清在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产乱人视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 999精品在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av美国av| 国产av一区在线观看免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 女警被强在线播放| 全区人妻精品视频| 最近最新免费中文字幕在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产免费av片在线观看野外av| 桃色一区二区三区在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁人妻一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产一区二区激情短视频| 午夜久久久久精精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产亚洲欧美98| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品 国内视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产激情欧美一区二区| 变态另类丝袜制服| 国产探花在线观看一区二区| 国产成年人精品一区二区| 黄色丝袜av网址大全| 搡老岳熟女国产| 99热6这里只有精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人永久免费在线观看视频| 我要搜黄色片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产日本99.免费观看| av在线蜜桃| a级毛片在线看网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产成人精品无人区| 国产亚洲精品一区二区www| 九九热线精品视视频播放| 中文字幕久久专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 观看免费一级毛片| 香蕉av资源在线| 99热这里只有精品一区 | 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中国美女看黄片| 亚洲av五月六月丁香网| a级毛片在线看网站| 亚洲专区字幕在线| 久久精品影院6| 亚洲av成人精品一区久久| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲avbb在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产单亲对白刺激| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产v大片淫在线免费观看| 免费看a级黄色片| 久久久国产成人免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 香蕉丝袜av| 天堂网av新在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产片特级美女逼逼视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲欧美日韩无卡精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 免费看a级黄色片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 99久久精品一区二区三区| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品国产精品| 日日啪夜夜撸| 久久人人爽人人片av| 中文字幕av成人在线电影| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文天堂在线官网| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲av熟女| 岛国毛片在线播放| videossex国产| 最近中文字幕2019免费版| 六月丁香七月| 久久精品91蜜桃| 亚洲四区av| 身体一侧抽搐| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美丝袜亚洲另类| av免费观看日本| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品电影一区二区三区| 嫩草影院精品99| 亚洲性久久影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲成人av在线免费| 欧美成人一区二区免费高清观看| 永久网站在线| 热99re8久久精品国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 美女高潮的动态| 日韩欧美精品v在线| 国产视频内射| 在线观看一区二区三区| 精品久久久久久久久久久久久| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 嫩草影院新地址| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 91久久精品国产一区二区成人| 色综合色国产| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 日本与韩国留学比较| 成人鲁丝片一二三区免费| 精华霜和精华液先用哪个| 特大巨黑吊av在线直播| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 我要看日韩黄色一级片| 伦精品一区二区三区| 岛国在线免费视频观看| 九九在线视频观看精品| 乱系列少妇在线播放| 亚洲精品自拍成人| 国产精品蜜桃在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 秋霞伦理黄片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品国产高清国产av| 男女视频在线观看网站免费| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 少妇熟女欧美另类| av免费观看日本| 国产在线一区二区三区精 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 啦啦啦韩国在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 色5月婷婷丁香| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 小说图片视频综合网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成人二区视频| 七月丁香在线播放| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 两个人视频免费观看高清| 欧美日韩综合久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国内揄拍国产精品人妻在线| av在线老鸭窝| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲欧美日韩高清专用| 日韩人妻高清精品专区| 晚上一个人看的免费电影| 麻豆成人午夜福利视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 日韩视频在线欧美| 激情 狠狠 欧美| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕av成人在线电影| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久这里只有精品中国| 丝袜喷水一区| 青春草亚洲视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 亚洲最大成人手机在线| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产成人精品婷婷| 日韩成人伦理影院| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 永久免费av网站大全| 国产乱来视频区| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩视频在线欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成年版毛片免费区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 内地一区二区视频在线| 国产男人的电影天堂91| 特级一级黄色大片| 春色校园在线视频观看| 亚洲av中文av极速乱| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久久久伊人网av| 成人午夜精彩视频在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产69精品久久久久777片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品电影一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲电影在线观看av| 久久精品夜色国产| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品熟女少妇av免费看| 国产乱来视频区| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 69av精品久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 嘟嘟电影网在线观看| av免费在线看不卡| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av熟女| 1000部很黄的大片| 国产精品蜜桃在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 久久精品国产亚洲av涩爱| 性色avwww在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产精品日韩av在线免费观看| 黄色配什么色好看| 久久久久网色| 免费观看a级毛片全部| 久久久精品大字幕| 久久精品久久精品一区二区三区| av在线蜜桃| 91精品国产九色| 亚洲精品乱久久久久久| 特级一级黄色大片| 精品欧美国产一区二区三| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产 一区 欧美 日韩| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 99热全是精品| 免费电影在线观看免费观看| kizo精华| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 日本色播在线视频| 亚洲av成人精品一区久久| 综合色丁香网| 成年女人看的毛片在线观看| 成年免费大片在线观看| 色吧在线观看| av在线亚洲专区| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费大片18禁| 免费观看在线日韩| 如何舔出高潮| 亚洲欧洲日产国产| 老司机影院毛片| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品乱久久久久久| 日本熟妇午夜| 精品人妻熟女av久视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 国产午夜福利久久久久久| 免费看日本二区| 国产精品人妻久久久影院| 欧美+日韩+精品| 欧美色视频一区免费| 少妇丰满av| 国产伦精品一区二区三区四那| 美女内射精品一级片tv| 只有这里有精品99| av在线老鸭窝| 成人午夜高清在线视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久综合国产亚洲精品| 国产免费一级a男人的天堂| 成年av动漫网址| 国产视频首页在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产av不卡久久| 亚洲经典国产精华液单| 午夜激情福利司机影院| 97超视频在线观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 美女国产视频在线观看| 亚洲在久久综合| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产淫片久久久久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费av观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| av免费观看日本| 国产在线男女| 禁无遮挡网站| eeuss影院久久| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| 成人国产麻豆网| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久久久久大av| 麻豆成人av视频| 精品人妻熟女av久视频| 日韩大片免费观看网站 | 国产精品女同一区二区软件| 国产成人精品久久久久久| 中文字幕制服av| 中国国产av一级| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产久久久一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产在线一区二区三区精 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美色视频一区免费|