AP-1及其siRNA對(duì)心肌細(xì)胞中TGF-β1的影響

李 斌，陳 晶

(包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040)

AP-1及其siRNA對(duì)心肌細(xì)胞中TGF-β1的影響

李 斌，陳 晶

(包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040)

采用RNA干擾方法研究轉(zhuǎn)錄因子AP-1對(duì)TGF-β1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響及其對(duì)心肌細(xì)胞的影響。設(shè)計(jì)合成兩對(duì)AP-1基因的siRNA-59和siRNA-60，同時(shí)合成與AP-1基因序列無關(guān)的siRNA-58，試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照組及干擾組(AP-1-58、AP-1-59和AP-1-60)共5組，使用LipofectantineTM2000轉(zhuǎn)染AP-1 siRNA入培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)AP-1和TGF-β1在心肌細(xì)胞中mRNA水平表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，siRNA-58對(duì)AP-1的基因沉默(表達(dá)下調(diào))無顯著差異(P>0.05)，siRNA-59和siRNA-60對(duì)AP-1的基因沉默(表達(dá)下調(diào))有顯著差異(P<0.05)，同時(shí)對(duì)應(yīng)siRNA-59和siRNA-60組的TGF-β1基因有顯著性下調(diào)(P<0.05)，說明AP-1和TGF-β1的基因表達(dá)存在正相關(guān)。

AP-1；TGF-β1；心肌細(xì)胞；RNA干擾；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

心血管疾病尤其是心臟疾病發(fā)病率一直居高不下，且有逐年增加和年輕化的趨勢(shì)。心肌肥厚是多種心臟疾病共同的病理過程，影響因素較多，包括心肌細(xì)胞肥大，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心肌細(xì)胞表型胚胎基因再表達(dá)及與收縮功能有關(guān)的收縮蛋白的改變等[1-2]。心肌肥厚機(jī)制非常復(fù)雜，至今人們尚未研究清楚。

資料顯示轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可以刺激心肌細(xì)胞合成收縮蛋白[3]。Li C[4]等在大量的動(dòng)物模型和人手術(shù)后的病理標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，各種原因?qū)е碌男募》屎窬瑫r(shí)伴隨著TGF-β1表達(dá)的上調(diào)。在左心室肥厚的體外試驗(yàn)中，大量研究均表明TGF-β1與左心室肥厚關(guān)系密切，呈顯著正相關(guān)[5-7]。

本研究采用RNA干擾技術(shù)[8]，設(shè)計(jì)AP-1(c-jun)的siRNA，體外檢測(cè)細(xì)胞中的AP-1和TGF-β1的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 心肌細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑 LipofectantineTM2 000試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，胰酶為杭州四季青生物制品工程公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM(高糖型)為Gibeo公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent kit perfect real-time、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR?premix ExTaqTM Ⅱ RT-PCR kit和Trizol RNA提取試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；SiRNA 為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 H9C2細(xì)胞在 DMEM、100 mL/L的小牛血清、100 U /mL青霉素及100 U/mL鏈霉素培養(yǎng)基中,于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞傳代用 2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞。用相差顯微鏡常規(guī)觀察細(xì)胞生長形態(tài)及生長規(guī)律。

1.2.2 siRNA的脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 采用 Invitrogen公司 Lipofectamine 2000并按說明書進(jìn)行：將1 mL無抗培養(yǎng)基中接種0.5×105～2×105細(xì)胞于6孔板,經(jīng)24 h培養(yǎng)待細(xì)胞生長融合度達(dá)40%～50%后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染[9]。用250 μL DMEM稀釋5 μL LipofectantineTM2000，靜置5 min；用250 μL DMEM稀釋5 μL siRNA；混合轉(zhuǎn)染試劑和SiRNA，靜置20 min。轉(zhuǎn)染4 h～6 h后換新培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。

試驗(yàn)分為3組，siRNA-AP-1組、control-RNAi-AP-1組和未進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%～95%，以LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染。將稀釋的脂質(zhì)體與合成的RNA寡聚物等體積混勻，滴加到細(xì)胞液中，讓RNA寡聚物/脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境下接觸6 h后，換成有血清和抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h～72 h，收集細(xì)胞，熒光相差顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)TGF-β1在mRNA水平的表達(dá)

1.2.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 用異硫氰酸胍法提取細(xì)胞總RNA(TaKaRa RNAiso plus)，對(duì)RNA進(jìn)行完整性和純度檢測(cè)，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeScript?RT reagent kit)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-20℃保存。1.2.3.2 合成引物和內(nèi)參 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限合成，序列如下：GAPDH (129 bp) 5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3′；5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′;TGF-β1(149 bp) 5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′；5′-GTTTGGGACTGATCCCATTG-3′;AP-1(c-jun，125 bp) 5′-TGACTGCAAAGATGGAAACGA-3′；5′-CAGGTTCAAGGTCATGCTCTGT-3′。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾結(jié)果

使用6孔板分5組(陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、 SiRNA-58、 SiRNA-59、 SiRNA-60)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染干擾(圖1A)。干擾后，陰性對(duì)照組細(xì)胞正常生長，細(xì)胞融合度由40%增長至70%(圖1B)；干擾后，陽性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，有部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞融合度由40%增長至60%左右，考慮可能是脂質(zhì)體影響了細(xì)胞活性(圖1C)；干擾后，SiRNA-58組由于是與AP-1(c-jun)基因無關(guān)的SiRNA，現(xiàn)象比較接近陽性對(duì)照，細(xì)胞融合度50%至60%，考慮此SiRNA對(duì)細(xì)胞干擾不大，主要是脂質(zhì)體影響了細(xì)胞活性(圖1D)；干擾后，SiRNA-59組細(xì)胞形態(tài)變化大，部分視野下細(xì)胞死亡，呈圓點(diǎn)或圓點(diǎn)狀聚集，此SiRNA對(duì)細(xì)胞干擾明顯(圖1E)，干擾后，SiRNA-60組細(xì)胞形態(tài)變化大，部分視野下細(xì)胞死亡，呈圓點(diǎn)或圓點(diǎn)狀聚集，此SiRNA對(duì)細(xì)胞干擾最為明顯(圖1F)。

2.2 TGF-β1在mRNA水平的表達(dá)情況

經(jīng)real-time PCR，各組中AP-1在mRNA水平

表達(dá)情況如圖2所示，TGF-β1在mRNA水平表達(dá)情況如圖3所示。在RNA干擾組中siRNA-58組為與AP-1基因無關(guān)的siRNA，假陽性組，與陰性對(duì)照和陽性對(duì)照相比，無顯著性差異；siRNA-59組、siRNA-60組與陰性陽性對(duì)照相比，差異極顯著；siRNA-60組干擾效果更為明顯(圖2)。TGF-β1在干擾組中呈顯著性下調(diào)，與AP-1的表達(dá)量呈正相關(guān)(圖3)。

圖1 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞鏡檢結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞中AP-1在mRNA的表達(dá)情況

圖3 各組細(xì)胞中TGF-β1在mRNA的表達(dá)情況

3 討論

激動(dòng)蛋白-1(activator protein-1，AP-1)屬于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，是由原癌基因c-jun和c-fos分別編碼的c-Jun和c-Fos蛋白嵌合而成的二聚體復(fù)合物，且以c-Jun為主[11-12]。Weigert C等[13]發(fā)現(xiàn)TGF-β1的基因啟動(dòng)子中含有兩個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)(位于-453至-323之間)。

我們通過RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)AP-1(c-jun)的siRNA，進(jìn)行RNA干擾，體外檢測(cè)細(xì)胞中的AP-1和TGF-β1的表達(dá)。研究顯示，siRNA-59組、siRNA-60組干擾效果較為理想，TGF-β1在干擾組中呈顯著性下調(diào)，與AP-1的表達(dá)量呈正相關(guān)。

TGF-β1在各種病因引起的心肌肥厚中均有上調(diào)趨勢(shì)。Wang W S[14]將大鼠TGF-β1基因敲除后持續(xù)給AngⅡ并不發(fā)生心肌肥厚，提示TGF-β1可直接誘導(dǎo)心肌肥大。謝雙倫等[15]以AP-1為靶點(diǎn)采用decoy ODNs技術(shù)對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AP-1 decoy ODNs可以抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成。TGF-β1在各種病因引起的心肌肥厚中均有上調(diào)趨勢(shì)，是多種心臟疾病共同的病理過程，影響因素較多，包括心肌細(xì)胞肥大，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心肌細(xì)胞表型胚胎基因再表達(dá)及與收縮功能有關(guān)的收縮蛋白的改變等。TGF-β1基因上游的啟動(dòng)子有AP-1結(jié)合位點(diǎn)，本研究證實(shí)了它們之間呈正相關(guān)?？梢赃M(jìn)一步檢測(cè)心肌細(xì)胞表型胚胎基因再表達(dá)及與收縮功能有關(guān)的收縮蛋白的改變等，進(jìn)而可能找到治療心肌肥厚的新的靶點(diǎn)。

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Effects of AP-1 and siRNA on TGF-β1in Myocardial Cells

LI Bin,CHEN Jing

(DepartmentofBasicMedicineandForensicMedicine,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014040,China)

To study the effect of transcription factor AP-1 on TGF-β1and cardiomyocytes by using RNA interference method,two pairs of siRNA of AP-1 genes were designed and synthesized,meanwhile unrelated siRNA of AP-1 genes was synthesized as control. The experiment was divided into five groups, including negative control group, positive control group and three interference groups(siRNA-58,siRNA-59,siRNA -60). The cultured rat cardiomyocytes were transfected with AP-1 siRNA using LipofectamineTM2000.Cell morphology was observed by inverted microscope.The changes of mRNA expressions of AP-1 and TGF-β1in cardiomyocytes were detected by real-time quantitative PCR.The results showed,there was no significant difference in the expression of AP-1 gene in siRNA-58 group.In the siRNA-59 group and siRNA-60 group, the expression of AP-1 gene decreased significantly,while the expression of TGF-β1gene was significantly reduced.The results indicated that the expression of AP-1 gene and TGF-β1gene were positively correlated.

activator protein-1; transforming growth factor β1; cardiomyocyte; RNA interference; real-time PCR

2016-05-19

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZY12215)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014MS0804，2016MS(LH)0826)

李 斌(1977-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副教授，碩士，主要從事心血管疾病致病機(jī)制研究。

S856.2

A

1007-5038(2016)12-0046-04