梅雪芳,施 維,張瑤瑤,黃維義
(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)
大片吸蟲分泌排泄抗原對小鼠肝損傷的研究
梅雪芳,施 維,張瑤瑤,黃維義*
(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)
為探究大片形吸蟲分泌排泄物對小鼠肝臟的影響,將60只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為試驗組和對照組各30只。每隔2天注射0.4 mg FgESP 200 μL,對照組注射PBS 200 μL。于首次注射后第10天、4周、7周、14周、18周處死6只小鼠,觀察肝臟表觀病理變化,制做肝臟HE染色病理切片并測定血清中與肝功能密切相關(guān)的ALT、AST、ALP、ALB、GLB等生化指標(biāo)的變化。肝臟眼觀病理變化結(jié)果顯示,試驗組從第4周可見白色點狀結(jié)節(jié),癥狀隨著時間的延長而加重;肝臟組織病理結(jié)果顯示,從第2周開始小鼠肝臟出現(xiàn)空泡變性,至第18周出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤,并伴隨輕度肝纖維化;生化指標(biāo)動態(tài)變化結(jié)果顯示,ALT、AST活性在整個試驗進(jìn)程中出現(xiàn)顯著上升(P<0.05),ALP活性在第4周~7周明顯升高,之后降低(P>0.05),ALB和GLB水平在整個試驗進(jìn)程中分別表現(xiàn)為顯著下降和顯著上升(P<0.05),提示肝細(xì)胞可能發(fā)生變性、壞死導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高,蛋白合成能力下降。本研究結(jié)果表明大片吸蟲分泌排泄抗原(FgESP)可導(dǎo)致小鼠肝損傷,損傷程度隨著FgESP的持續(xù)注射而加重。
大片形吸蟲;分泌排泄物;肝臟損傷;小鼠
片形吸蟲病(Fascioliasis)是由肝片形吸蟲(Fasciolahepatica)和大片形吸蟲(F.gigantica)等片形吸蟲屬吸蟲引起的一種全球廣泛分布的人獸共患寄生蟲病[1],主要侵害宿主的肝膽系統(tǒng)。全球70多個國家地區(qū)約有240萬人受到感染,1.8億人的健康受到該病的威脅[2],我國約有12萬人感染[3]。人感染大片形吸蟲后可出現(xiàn)多系統(tǒng)、器官受損,臨床癥狀為高熱、腹部脹痛以及肝臟和脾臟腫大,病程長達(dá)半年甚至更久[4]。早期童蟲在移行過程中除了對臟器造成機(jī)械性損傷,其分泌排泄物(excretory-secretory products,ESP)對肝臟也會產(chǎn)生刺激和毒害作用。研究表明,肝片形吸蟲的分泌排泄產(chǎn)物能夠造成人肝細(xì)胞和大鼠嗜酸性粒細(xì)胞的壞死和凋亡[5-6],這提示在蟲體與機(jī)體免疫抗衡過程中,ESP產(chǎn)生的刺激會給宿主造成較為嚴(yán)重的免疫病理損傷。臨床報道表明,部分病人在接受大片形吸蟲治療后肝臟仍有不可逆轉(zhuǎn)損傷,形成囊實型結(jié)構(gòu)[4],這表明在人體中除了機(jī)械性損傷外,可能還存在有其他的因素促進(jìn)了肝臟疾病的進(jìn)程。
近年來,人體病例的報道逐漸增多,該病作為一種公共衛(wèi)生問題逐漸獲得人們的關(guān)注[7]。國內(nèi)外許多學(xué)者針對片形吸蟲及其分泌排泄抗原開展了大量的實驗研究,以期實現(xiàn)對片形吸蟲病的有效控制和預(yù)防。本研究用大片吸蟲分泌排泄抗原刺激小鼠,來探討其單獨作用時對小鼠肝臟產(chǎn)生的影響。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 SPF級雌性昆明小鼠60只,4周齡~5周齡,體重18 g~20 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。
1.1.2 蛋白收集 從南寧各屠宰場采集新鮮牛大片吸蟲,收集成蟲活蟲,用37℃預(yù)熱的pH7.2 PBS溶液清洗5遍~6遍,除去膽汁及其它膽管分泌物等污漬后,置含10 g/L葡萄糖的PBS溶液中培養(yǎng),培養(yǎng)液用量以剛好沒過蟲體為宜,一般1.5 mL/條。從1 h~8 h每隔2 h取出部分培養(yǎng)液于4℃、5 000 r/min離心10 min,取上清液,用分光光度計測蛋白含量,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 方法
1.2.1 動物感染 將60只昆明小鼠隨機(jī)分為感染組和對照組,各30只。試驗組每隔2 d注射0.4 mg FgESP 200 μL,對照組注射PBS 200 μL。
1.2.2 血清及組織樣品的采集 首次注射后第10天、4周、7周、14周、18周每組各取出6只,采集小鼠血液并分離血清,用全自動生化分析儀測定以下生化指標(biāo):堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(oxaloacetic transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLB)。冰上無菌取肝臟,觀察肝臟表觀病變情況。取肝臟病變明顯部位,置100 mL/L中性福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木精-曙紅 (hematoxylin-eosin,HE)染色,顯微鏡下觀察組織病理變化。
2.1 肝臟眼觀變化
試驗組第10天肝臟未見明顯異常,第4周時,肝臟表面出現(xiàn)白色點狀結(jié)節(jié),此后白色結(jié)節(jié)的面積逐漸擴(kuò)大,至18周時,肝臟表面出現(xiàn)多個片狀白色結(jié)節(jié)。陰性對照組小鼠肝表觀無異常(圖1)。
A.對照組;B~F.第10天、4周、7周、14周、18周試驗組A.Control group; B-F.Treatment groups of 10 d,4 w,7 w,14 w and 18 w
2.2 肝臟病理學(xué)觀察
小鼠肝臟切片HE染色病理學(xué)觀察結(jié)果表明,對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,肝細(xì)胞索呈放射性狀,無纖維結(jié)締組織增生,無炎癥細(xì)胞浸潤,膽管無擴(kuò)張和增生(圖2A,B)。試驗組小鼠第10天時,肝細(xì)胞排列開始紊亂,在血管周圍及肝臟表層出現(xiàn)肝細(xì)胞腫大,胞質(zhì)溶解呈透明狀,即空泡變性(圖2C,D)。至第7周,小鼠肝細(xì)胞變性程度加重,有的呈氣球樣。第14周,小鼠匯管區(qū)周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤,周圍有成纖維細(xì)胞和再生肝細(xì)胞(圖2E,F(xiàn))。第18周,在肝臟匯管區(qū)或小葉間有結(jié)締組織增生和灶狀炎性細(xì)胞浸潤,炎性細(xì)胞周圍肝細(xì)胞增生,部分小鼠匯管區(qū)膽管有不同程度的增生,管腔內(nèi)含脫落的上皮細(xì)胞,膽管上皮細(xì)胞腫脹,纖維組織增生(圖2G,H,I,J)。
2.3 肝功能相關(guān)生化指標(biāo)的測定
試驗組和對照組小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果見圖3~圖7。與對照組相比,試驗組小鼠血清ALT水平從第10天開始顯著高于對照組,至第14周出現(xiàn)峰值(P<0.05)(圖3)。AST水平從第10 d開始略高于對照組,至第14周出現(xiàn)峰值(P<0.05)(圖4)。ALP水平在第4~7周出現(xiàn)明顯升高,14周開始低于對照組(P>0.05)(圖5)。 試驗組小鼠血清ALB水平均低于對照組,整個試驗過程中趨勢平穩(wěn)(P<0.05)(圖6),GLB水平均高于對照組,至第14周出現(xiàn)峰值(P<0.05)(圖7)。
片形吸蟲感染可導(dǎo)致人和水牛ALT、AST活性升高[8-9]。ALT 主要存在于細(xì)胞漿水溶性部分,AST在細(xì)胞漿水溶性部分和細(xì)胞線粒體內(nèi)均有分布,二者的升高可提示肝細(xì)胞的變性、壞死[10]。本研究結(jié)果顯示,隨著FgESP的持續(xù)刺激,血清中ALT、AST含量升高,在第14周達(dá)到峰值。ALP主要存在于肝細(xì)胞血竇側(cè)肝竇狀隙表面,本試驗ALP呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(統(tǒng)計學(xué)差異不顯著),提示在試驗前期發(fā)生細(xì)胞膜損壞,后期可能由于小鼠營養(yǎng)狀況不佳、貧血等原因造成下降。
肝臟是蛋白質(zhì)合成、分解的主要器官。肝細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致其白蛋白合成能力的下降[11]。楊汝軍[4]等報道,治療的18例人體巨片形吸蟲病例中,肝臟CT提示,多發(fā)性的低密度影18例,占100%;低蛋白血癥12例,占66.7%。同時,作為一個重要的免疫器官,肝臟中的免疫細(xì)胞被激活后,分泌的球蛋白增多,因而低蛋白和高免疫球蛋白幾乎是片形吸蟲病的普遍現(xiàn)象[12]。本研究分別對ALB和GLB水平進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,ALB檢測值有所降低,GLB水平在前期變化不明顯,第14周時明顯升高。這表明,腹腔注射FgESP后,小鼠肝白蛋白合成能力降低;至第14周時,GLB明顯升高,這與小鼠肝切片在前期沒有明顯炎癥反應(yīng)、第14周出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤的結(jié)果相一致。
圖3 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of serum ALT levels
圖4 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of serum AST levels
圖5 血清堿性磷酸酶(ALP)水平的動態(tài)變化
人感染大片形吸蟲時,如果不及時治療,會引起肝臟損傷,嚴(yán)重者可致肝腎衰竭甚至死亡。持續(xù)和嚴(yán)重的感染會引起肝纖維化和肝硬化,甚至可能導(dǎo)致肝膽管型肝癌[13]。但是由于以前人的片形吸蟲病患病率相對較低,患者多屬少量多次感染,癥狀較輕,相關(guān)報道較少,該病常被人們忽略。并且由于對該病了解較少,糞便檢查需要在感染后3~4個月才能查到蟲卵,早期診斷困難,極易出現(xiàn)誤診,因而延誤病情[14-15]。本試驗結(jié)果提示,在人醫(yī)中若發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶活性升高、白蛋白合成能力下降等癥狀,在進(jìn)行診斷時應(yīng)當(dāng)考慮到片形吸蟲的感染。此外,對確診為片形吸蟲感染的患者,不僅要進(jìn)行傳統(tǒng)的驅(qū)蟲,還應(yīng)當(dāng)針對蟲體分泌排泄物對肝臟的損傷來采取相應(yīng)的保肝措施,以期獲得更好地治療方案。
圖6 血清白蛋白(ALB)水平的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of serum ALB levels
圖7 血清球蛋白(GLOB)水平的動態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of serum GLOB levels
有研究表明,牛、羊感染肝片吸蟲囊蚴后,成蟲回收率分別為16%~53%和11%~21%[16],大多數(shù)寄生蟲在遷移的過程中沒有發(fā)育為成蟲,而是被困在肝實質(zhì)或者中途死亡。推測寄生蟲死亡后大量的蟲體蛋白釋放并對肝臟發(fā)揮作用;體表多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的脫落是被困在肝實質(zhì)或者正在移行中的寄生蟲應(yīng)對宿主免疫攻擊時的一種逃避途徑[17],其脫落也可導(dǎo)致體表蛋白的釋放,在童蟲期,多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物大約每3 h更新一次[18]。此外,蟲體細(xì)胞合成和分泌一些蛋白分子,也可對肝細(xì)胞造成損傷[19]。本研究進(jìn)一步證明FgESP單獨刺激會引起小鼠的肝損傷。寄生蟲蟲體相關(guān)蛋白有望成為肝片吸蟲疫苗新的候選抗原,開發(fā)新的有效防控策略是片形吸蟲病防治的迫切需要。
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Study on Mouse Liver Injury by Excretory-secretory ofFasciolagiganticaProducts
MEI Xue-fang,SHI Wei,ZHANG Yao-yao,HUANG Wei-yi
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China)
To investigate the impact ofFasciolagiganticaexcretory-secretory products (FgESP) no mouse liver,sixty female mice were randomly divided into treatment group and control group (30 mice/group).The mice in treatment group were given by intraperitoneal injection (i.p.) 0.4 mg FgESP diluted in 200 μL PBS,while 200 μL PBS alone injection was set as control.6 mice per time point were executed by 1 week-post injection (wpi),4 wpi,7 wpi,14 wpi,or 18 wpi,respectively.Liver lesions were observed and recorded,followed by performing hepatic histology slices with haematoxylin eosin (HE) staining.Serum biochemical indexes (i.e.ALT,AST,ALP,ALB,GLB), which were closely related to liver function,were measured by auto-biochemical analyzer.White dot-like nodules on the liver surface after FgESP injection since 4 wpi were observed.Histology slice determination showed that vacuolar degeneration was found in FgESP injection group since 2 wpi,rather than control.Massive inflammatory cell infiltration occurred in the liver parenchyma since 18 wpi after injection,associated with mild fibrosis.It was also shown that the enzyme activities of ALT and AST significantly increased during the entire experiment according to the blood biochemical index measure (P<0.05),while activity of ALP increased during 4 to 7 wpi but turned to decreased subsequently (P<0.05),the levels of ALB and GLB decreased and increased,respectively (P<0.05) ,suggesting the presence of degeneration,necrosis in the hepatic cells and decrease of the protein synthesis capability.The results indicated that FgESP could induce liver injury in mice,and the damage may aggravate over time.
Fasciolagigantica; excretory-secretory product;liver injury;mouse
2016-04-28
國家自然科學(xué)基金項目(31260605)
梅雪芳(1990-),女,河南駐馬店人,碩士,主要從事動物寄生蟲學(xué)與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者
S852.735
A
1007-5038(2016)12-0034-05