雞冷誘導RNA結(jié)合蛋白基因序列分析及組織表達

葉青華，吳 巧，岳 華*，儲 倩

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川成都 611130；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

雞冷誘導RNA結(jié)合蛋白基因序列分析及組織表達

葉青華1，吳 巧2，岳 華2*，儲 倩2

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川成都 611130；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

為研究雞冷誘導RNA結(jié)合蛋白(CIRP)基因的結(jié)構(gòu)特征和組織定量分布情況，根據(jù)GenBank中原雞CIRP基因(NM-001031347)的編碼區(qū)序列自行設計引物，從健康雛雞脾臟中擴增青腳麻羽雞CIRP基因的編碼區(qū)(CDS)并進行生物信息學分析；設計引物建立實時熒光定量RT-PCR，檢測CIRP mRNA在雛雞各組織器官中的分布及相對表達水平。結(jié)果顯示,雞CIRP基因CDS區(qū)全長573 bp，編碼190個氨基酸，其氨基端包含一個RNA結(jié)合域，羧基端富含RGG重復序列，推導的多肽鏈羧基端比鴨、斑胸草雀及哺乳動物要多18個氨基酸；CIRP基因在雞各被檢組織器官中均有表達，相對表達水平由低到高分別為法氏囊、肺臟、胰腺、胸腺、脾臟、睪丸、盲腸扁桃體、心臟、腦、腎臟、哈德氏腺、肝臟。本研究為進一步探討雞CIRP基因的遺傳進化及其在病原感染中的作用提供了參考。

雞；冷誘導RNA結(jié)合蛋白；生物信息學分析；組織定量分布

冷誘導RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP或CIRBP)是一個18 ku的蛋白，屬于RNA結(jié)合蛋白異源核糖核蛋白亞群[1]。CIRP最初是在研究紫外線輻射引起DNA損傷的轉(zhuǎn)錄反應時發(fā)現(xiàn)的，它以一種劑量依賴增殖方式參與對紫外線輻射的轉(zhuǎn)錄應答[2-3]，隨后Nishiyama H等[4]又從小鼠睪丸細胞中分離得到了CIRP的cDNA，并證實CIRP與冷應激有關。大量研究表明，CIRP在多種細胞類型中均有表達，參與對H2O2[5]、缺氧[6]、滲透壓[7]等應激的轉(zhuǎn)錄應答，并且對上述多種應激狀態(tài)下的細胞具有保護作用[8-9]，同時參與神經(jīng)調(diào)節(jié)[10]和生物鐘調(diào)節(jié)[11]等生理過程。CIRP在細胞抗凋亡過程中對絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPK) 級聯(lián)中的ERK通路、核因子κB(NF-κB)通路也有著顯著的調(diào)控作用[12]。研究顯示，抑制CIRP的表達能促進多種癌細胞凋亡，并增加對化學治療藥物的敏感性，表明CIRP是一個潛在的癌癥治療新的分子靶點[13-14]。有研究表明，在LPS刺激和敗血癥情況下，CIRP通過調(diào)節(jié)NF-кB信號通路影響多種炎性因子的產(chǎn)生[15]，并通過調(diào)節(jié)TRL4促進炎癥發(fā)生[16]，是一種新的促炎介質(zhì)[17]，在細菌感染中發(fā)揮重要作用。但國內(nèi)外對CIRP的研究主要集中在哺乳動物，未見禽類CIRP的相關研究報道。本研究旨在克隆雞CIRP基因的編碼序列區(qū)(coding sequence region,CDS)，分析雞CIRP基因的序列結(jié)構(gòu)特征，并檢測其組織定量分布情況，為深入開展雞CIRP在病原感染過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 10日齡青腳麻羽雞，成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞、DNA純化回收試劑盒，北京天根生物有限公司產(chǎn)品；ExTaq酶試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、PrimescriptTM RT試劑盒和pMD19-T vector試劑盒,TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞CIRP基因CDS區(qū)的克隆及序列分析 根據(jù)GenBank中登錄的原雞CIRP基因(NM-001031347)的編碼區(qū)序列自行設計一對特異性引物，上、下游引物依次為：GC-F：5′-ATGGCATCGGATGAGGG-3′；GC-R：5′-TCACAACAGGGTCA-3′，預期擴增片段為573 bp。采用Trizol試劑提取雛雞脾臟總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，用GC-F、GC-R引物PCR擴增雞CIRP基因CDS區(qū)，采用25 μL反應體系：10×ExTaqbuffer 2.5 μL，MgCl22 μL，dNTP Mixture 2 μL，上、下游引物各 1 μL，ExTaq0.15 μL, cDNA 2 μL，ddH2O 14.35 μL。采用自行優(yōu)化的Touch Down法：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s， 72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；72℃ 10 min，16 ℃結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化回收試劑盒回收純化并連接至pMD19-T載體過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入DH5α感受態(tài)細胞中送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結(jié)果用BioXM2.6進行序列分析，用DNA Star進行同源性分析，用MEGA5.0建立進化樹，用ProtParam軟件分析其編碼蛋白的理化參數(shù)，用Tmpred軟件預測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，用PSORT Ⅱ程序預測蛋白的亞細胞定位，用SMART程序分析編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 雞CIRP基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法的建立 根據(jù)GenBank中登錄的原雞CIRP基因(NM-001031347)序列自行設計1對特異性引物：CIRP-F: 5′-TCTCGCCCGTAAGAACCAATC-3′;CIRP-R:5′-AGAAGC-TACTGCGCTACCGTGT-3′，擴增雞CIRP基因215 bp片段。采用SYBR GreenⅠ染料法，在ABI 7300實時熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析。以最小的Ct值和最高的熒光值為標準，分別對循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進行優(yōu)化，建立檢測雞CIRP mRNA的實時熒光定量PCR方法。

1.2.3 定量檢測雞CIRP基因的組織分布 選用10日齡雞(n=5)作為試驗對象，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、睪丸、胰腺、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、盲腸扁桃體，按說明書分別提取各組織器官的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測雛雞各組織中CIRP基因，分析其組織定量分布情況，以本實驗室篩選出的在生理狀況下穩(wěn)定的RPL4基因作為內(nèi)參[18]，以2-△△Ct法[19]計算各組織器官中CIRP基因的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 雞CIRP基因CDS的序列分析

從雞脾臟中擴增出一條約573 bp 的片段(圖1)，與預期大小相符。測序結(jié)果顯示，克隆得到雞CIRP基因CDS區(qū)序列與GenBank中登錄的原雞CIRP(NM-001031347)基因序列除了在第9位(由G變?yōu)锳)和第306位(由C變?yōu)門)核苷酸發(fā)生無意義突變外，其他序列均吻合。雞CIRP基因編碼190個氨基酸，編碼的多肽鏈包含18種標準氨基酸，其中甘氨酸數(shù)目最多，其次是絲氨酸，不含組氨酸和脯氨酸。BioXM2.6對比分析雞、鴨、斑胸草雀、人和小鼠CIRP的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，鴨和斑胸草雀CIRP編碼171個氨基酸，人和小鼠CIRP編碼172個氨基酸，而雞CIRP基因則在其編碼區(qū)的511堿基處密碼子AAA替代終止密碼子TAA，致使其在羧基末端多編碼出18個氨基酸。和已經(jīng)報道的鳥類(原雞、鴨、斑胸草雀)一樣，雞CIRP基因與哺乳動物相比在148位少1個氨基酸。

M.DNA 標準DL 2 000;1～2.雞CIRP基因編碼區(qū)PCR擴增目的片段

M.DNA Marker DL 2 000;1-2.PCR products of chicken CIRP CDS

圖1 雞CIRP基因編碼區(qū)序列的PCR擴增結(jié)果

Fig.1 Amplification results of chicken CIRP CDS by PCR

同源性分析表明GenBank上僅有的3個鳥類CIRP基因無論在核苷酸結(jié)構(gòu)上，還是在氨基酸結(jié)構(gòu)上與哺乳動物類都是種屬間高度保守的。雞CIRP基因的CDS區(qū)核苷酸序列及編碼氨基酸序列與鴨、斑胸草雀、倉鼠、人、家鼠、猩猩、褐家鼠、豬、爪蟾、斑馬魚的同源性分別為88.8%、86.8%、72.8%、73.0%、73.0%、73.4%、73.6%、60.7%和31.4%和96.5%、95.9%、83.1%、83.7%、83.1%、83.7%、82.6%、84.3%、62.7%和14.2%。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，雞、鴨、斑胸草雀3個鳥類屬于同一分支，人、倉鼠、猩猩等哺乳動物屬于另一分支，鳥類CIRP與哺乳動物類CIRP遺傳距離較近，與爪蟾和斑馬魚的遺傳距離較遠(圖2)。

通過Protparam軟件對雞CIRP理化性質(zhì)的分析可知，雞CIRP的相對分子質(zhì)量約為21 ku，理論pI為9.74，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為35.05，該值小于40即為穩(wěn)定性蛋白[20]，由此判斷雞CIRP為穩(wěn)定性蛋白；總平均親水性為-0.948，說明雞CIRP整體呈現(xiàn)親水性，是可溶性蛋白[21]。Tmpred和PSORT Ⅱ軟件分析顯示,雞CIRP不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白應是一種存在于細胞核的蛋白質(zhì)。采用SMART在線軟件預測到雞CIRP氨基端含有一個RNA結(jié)合域。

2.2 雞CIRP mRNA實時熒光定量RT-PCR

雞CIRP基因的擴增曲線與熔解曲線見圖3，擴增曲線平滑，熔解曲線為單一性峰，證明此熒光方法擴增效率和特異性良好。優(yōu)化的反應體系為20 μL：SYBR GreenⅠ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物分別為0.3 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。優(yōu)化的反應條件： 95℃，3 min；95 ℃，30 s；59℃，31 s，共40個循環(huán)。 熔解溫度為83.1℃±0.5℃。

2.3 雞CIRP基因的組織定量分布

通過實時熒光定量RT-PCR檢測得到各組織器官中CIRP mRNA及RPL4 mRNA的Ct值，以RPL4作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算各組織器官中CIRP基因的相對表達水平。以表達量最低的組織器官中的CIRP表達量為1，其余組織器官中CIRP基因的相對表達水平則是其與表達量最低的組織器官中CIRP表達水平的比值。由圖4可知，CIRP在雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、睪丸、胰腺、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、盲腸扁桃體等組織器官中廣泛表達。其中，肝臟中相對表達水平最高，哈德氏腺次之，法氏囊中相對表達水平最低。

3 討論

3.1 雞CIRP基因的結(jié)構(gòu)特征

本研究克隆得到的雞CIRP基因編碼區(qū)序列與GenBank中登錄的原雞CIRP(NM-001031347)基因序列除了在第9位(由G變?yōu)锳)和第306位(由C變?yōu)門)核苷酸發(fā)生無意義突變外，其他序列均吻合，這顯示了克隆結(jié)果的準確性。雞CIRP基因編碼190個氨基酸，與鴨、斑胸草雀、人和小鼠相比存在顯著的不同，在其編碼區(qū)的511堿基處密碼子AAA替代終止密碼子TAA，使翻譯在羧基末端多編碼出18個氨基酸，多出來的部分是否會影響CIRP的基因功能有待進一步研究。CIRP在脊椎動物中是高度保守的，但遺傳進化樹結(jié)果表明，GenBank上僅有的3個鳥類(雞、鴨、斑胸草雀)單獨聚為分支，哺乳動物類聚為另一支，對比兩物種的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)最大的區(qū)別在于鳥類的148位氨基酸處比哺乳動物類都要少1個氨基酸，這一發(fā)現(xiàn)為研究鳥類CIRP的遺傳進化提供了參考。

圖2 CIRP基因的系統(tǒng)進化分析

圖3 雞CIRP 基因擴增曲線和熔解曲線

圖4 雞CIRP基因的組織定量分布

已有研究表明[22]，人和小鼠CIRP基因編碼172個氨基酸，包含兩個確定的結(jié)構(gòu)域：1-85位氨基酸為RNA結(jié)合域(consensus sequence RNA-binding domain，CS-RBD)；86-172位氨基酸為羧基末端甘氨酸富集結(jié)構(gòu)域(RGG motif，R-精氨酸，G-甘氨酸)。CS-RBD是主要的RNA結(jié)合基序之一，包含兩個高度保守的序列：一個八聚體的RNP1和一個六聚體的RNP2。CIRP的CS-RBD包含RNP1和RNP2的共有序列以及許多高度保守的片段，可以很好地與其他有機體蛋白的CS-RBD結(jié)合[22]。羧基末端RGG結(jié)構(gòu)域可以增加RNA同其他RBD非特異性的親和性及序列特異的RNA結(jié)合活性[23]。此外，羧基端RGG 區(qū)域的精氨酸殘基的甲基化作用也是CIRP從細胞核向細胞質(zhì)移動所必需的[9]。本研究采用SMART軟件預測到雞CIRP基因氨基端包含了一個RNA結(jié)合域，對比發(fā)現(xiàn)雞CIRP與人CIRP的RNA結(jié)合域完全相同。另外，我們也發(fā)現(xiàn)雞CIRP羧基端結(jié)構(gòu)與人CIRP羧基端結(jié)構(gòu)類似，包含許多重復的RGG序列，RGG序列中影響CIRP核質(zhì)遷移過程的3個精氨酸甲基化位點(R94、R105、R116)不存在任何變化。CIRP向應激顆粒移動可能通過其RNA結(jié)合域或RGG結(jié)構(gòu)域介導，而CIRP的RGG結(jié)構(gòu)域中精氨酸殘基的甲基化作用是CIRP出核轉(zhuǎn)運和隨后在應激顆粒中積累所必需的[9]。因此，我們推測在一些應激條件下雞CIRP與人CIRP的核質(zhì)遷移過程可能是相同的。

3.2 雞CIRP基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR

實時熒光定量RT-PCR具有靈敏度高、重復性好、特異性強、速度快、通量高、無需PCR后電泳等特點,已成為基因定量檢測的金標準[24]，被廣泛應用于基因表達水平的研究。本研究首次建立了雞CIRP基因的實時熒光定量RT-PCR，該方法的擴增曲線平滑，熔解曲線為單一性峰，證明此實時熒光定量RT-PCR具有良好的擴增效率和特異性。在研究不同樣本之間基因表達量的變化時，很難保證樣本之間細胞數(shù)量的一致，以及在核酸提取和RNA反轉(zhuǎn)錄過程中也很難保證各樣本之間的一致性，因此，需要內(nèi)參基因進行相對定量分析來消除這些誤差。本研究利用生理狀況下穩(wěn)定的內(nèi)參基因RPL4[18]對檢測結(jié)果進行標化，消除試驗方法及功能狀態(tài)等因素帶來的表達差異，保證了定量結(jié)果的準確性，為雞CIRP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究提供了有用的檢測手段。

3.3 雞CIRP基因的組織定量分布

CIRP最初是在睪丸中被分離鑒定，是一種重要的多功能蛋白，在多種組織器官中發(fā)揮作用。Zhou M等[17]采用外科手術造成雄性Balb/c小鼠隱睪癥，并通過體內(nèi)電穿孔技術將CIRP基因轉(zhuǎn)移到隱睪癥小鼠的睪丸中，通過RT-PCR和Western blot 驗證了CIRP的過表達可通過下調(diào)p53和Fas的水平而減少隱睪癥引起的睪丸損傷。此外，CIRP在睪丸中對于維持小鼠精子的發(fā)生過程也起著至關重要的作用[25-26]。研究表明CIRP在原腸胚時期與爪蟾的神經(jīng)組織發(fā)育密切相關[10-11]。在溫和低溫時，CIRP還可以通過誘導硫氧環(huán)蛋白表達而抑制H2O2誘導的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的凋亡，形成一條溫和低溫時神經(jīng)元保護通路而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[27]。Peng Y等證實母源的x-CIRP1是爪蟾前腎形成過程中所必需的，CIRP在前腎形成過程中發(fā)揮重要作用。

目前關于CIRP功能性研究主要集中在睪丸、腦、腎組織器官中，CIRP在這些組織器官中都有分布并且參與了一些重要的生理活動過程。然而關于CIRP在各個組織器官中的定量分布檢測未見報道。本研究通過實時熒光定量RT-PCR檢測得到各組織器官中CIRP mRNA的表達水平。結(jié)果表明，雞CIRP基因在各組織器官中均有表達，但在肝臟中的表達水平卻遠遠高于其他組織器官。眾所周知，肝臟承載著機體的新陳代謝和免疫防御等重要功能，參于了機體對冷應激[28]、損傷[29]和疾病[30]等條件下的應激反應。業(yè)已證明，CIRP在機體起始免疫和流感病毒復制過程中發(fā)揮重要作用[13-31]，并參與機體對新城疫病毒[32]、細菌內(nèi)毒素(LPS)[33]的轉(zhuǎn)錄應答。本研究結(jié)果為深入研究雞CIRP參與機體對病原感染應答中的作用提供了有價值的參考資料。

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Sequence Analysis and Tissue Expression of Cold-inducible RNA Binding Protein in Chickens

YE Qing-hua1,WU Qiao2,YUE Hua2,CHU Qian2

(1.ChengduVocationalCollegeofAgricultralScienceandTechnology,Chengdu,Sichuan,611130,China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

To study the structural features and quantitative distribution of chicken CIRP gene in chicken tissues,according to the jungle fowl CIRP gene sequence in GenBank (NM-001031347),the primers were designed.The coding sequence region (CDS) of partridge shank chicken CIRP gene was cloned,sequenced and then analyzed.Real-time RT-PCR was developed for detecting the relative expression levels of CIRP gene in various tissues and organs of the chicks.The results showed that CIRP gene CDS in chicken was 573 bp,which encoding 190 amino acids,containing a N-terminal RNA binding domain and C-terminal arginine-glycine-rich (RGG) repeats,and the terminal polypeptide chain carboxyl group has 18 amino acids more than that in the duck, zebra fish and mammals.CIRP mRNA existed in all detected tissues and organs.The relative expression levels elevated as following: bursa of Fabricius,lung,pancreas,thymus,spleen,testis,cecal tonsil,heart,brain,kidney,Harder's gland,liver.Analysis of chicken CIRP gene structural features and quantitative study on the tissue distribution could provide a reference for further studying its genetic evolution and further exploring the role in the infective process.

chicken;cold-inducible RNA binding protein;bioinformatics analysis;quantitative distribution in tissue

2016-04-05

四川省教育廳創(chuàng)新團隊項目(13TD0057)

葉青華(1970-)，女，甘肅民勤人，副教授，碩士，主要從事動物疫病防治研究 。*通訊作者

S852.321;Q789

A

1007-5038(2016)12-0028-06