豬6種常見病毒多重PCR檢測方法的建立及應用

羅 寧，王冬冬，楊宗統(tǒng)，孫 舉，徐守振,3，王守春，尹燕博,3*，徐 彪*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.山東出入境檢疫檢驗局/食品農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，山東青島 266001；3.澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101)

研究論文

豬6種常見病毒多重PCR檢測方法的建立及應用

羅 寧1,2，王冬冬1，楊宗統(tǒng)1，孫 舉1，徐守振1,3，王守春2，尹燕博1,3*，徐 彪2*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.山東出入境檢疫檢驗局/食品農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，山東青島 266001；3.澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101)

旨在建立一種可同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬細小病毒(PPV)和豬巨細胞病毒(PCMV)的多重PCR檢測方法。參考相關(guān)文獻及序列比對結(jié)果設計6對特異性引物，建立了可同時檢測以上6種病毒的多重PCR方法并應用此方法對臨床病例進行了檢測。結(jié)果表明，所建立的多重PCR方法靈敏度高，對6種病毒的最低核酸檢測量分別為12.8 pg(PRRSV)、46 pg(CSFV)、16 pg(PRV)、23.5 pg(PCV-2)、72 pg(PPV)、8.6 pg(PCMV)，對豬流感病毒(SIV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)無特異性擴增。應用該方法對臨床145份樣品進行檢測，總陽性率為83.45%，2種以上病毒混合感染陽性率為69.66%。說明所建立的多重PCR檢測方法敏感，可用于豬群中上述6種豬病病原的單一感染或混合感染的鑒別診斷。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬瘟病毒；豬偽狂犬病病毒；豬圓環(huán)病毒2型；豬細小病毒；豬巨細胞病毒；多重PCR

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)呈現(xiàn)規(guī)?；⒓s化發(fā)展，隨著豬群養(yǎng)殖密度的增大，多種病毒混合感染的情況日趨嚴重[1-2]，其中以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬巨細胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)引起的豬繁殖障礙類疾病為主要危害，臨床上以早產(chǎn)、弱胎、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等為主要特征[3]，多呈混合感染，難以區(qū)分。PCMV可在豬肺泡巨噬細胞中增殖，侵襲免疫系統(tǒng)[4]，使機體對外界抵抗力降低，造成繼發(fā)感染，進而嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

實驗室對上述6種疫病的診斷主要包括病原分離、血清學診斷以及單一PCR等方法。病原分離準確性高，但是操作復雜耗時長，血清學診斷準確率低，單一PCR費時費力。多重PCR技術(shù)不僅可實現(xiàn)同時檢測多種病原，且保留了普通PCR敏感性高、特異性強的優(yōu)點[5]，近年來該技術(shù)已廣泛應用于動物病原的檢測中[6-7]。鑒于當前豬病混合感染的嚴重性和多重PCR的優(yōu)勢，本研究擬建立一種快速檢測豬常見6種疫病病原體的多重PCR方法，可同步檢測上述病原體的單一或混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA 1株購自中國動物疫病預防控制中心；豬偽狂犬病活疫苗、豬乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株購自中牧股份實業(yè)有限公司；豬瘟弱毒疫苗、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)弱毒疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；細小病毒滅活疫苗購自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司；豬流感病毒[8]由本實驗室分離并保存；豬巨細胞病毒[9]陽性病料由本實驗室保存。

1.1.2 檢測樣本 樣本取自2015年1月到2016年2月山東省各地豬場的臨床發(fā)病豬，病料包括肺、氣管、脾、淋巴等等組織或器官。

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus試劑、Reverse Transcriptase XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor(RNasin)RNA 抑制劑、pMD19-T Vector、DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細胞等購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自OMEGA公司；DNA提取試劑盒、2×EasyTaqPCR Super Mix、Trans2K DNA Maker購自北京全式金公司；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物設計與合成 根據(jù) GenBank 公布的CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、PCMV的保守基因核苷酸序列，參考相關(guān)文獻，設計6對特異性引物。引物序列、目的基因以及擴增片段長度見表1；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 多重PCR引物

Table 1 Primers used for multiplex PCR amplification

病毒Virus目的基因Targetgene引物序列(5'-3')Sequencesofprimers長度/bpSizePRRSVNSP2F:CGGTTTTGATGGGCGACAR:TGCAGGCGTGCGAGGTAA806CSFVPolyproF:GGGGTTTGGAAACTGGCTGR:GCTCCTTTAGTCCCTGAT244PRVgBF:TCGCCGTGCTCTTCAAGGR:AGGTGTCGTTGGTGGTGTG324PCVrepF:TGACCTGTCTACTGCTGTGAR:CCGTGGATAGTTCTGTAGCA527PPVVP2F:GCAGTACCAATTCATCTTCTR:TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG158PCMVDPOLF:ACCGTCTGAGAGAGACTGAACTTCTCR:CCCTGATCTTAAATGACGAGGACGTGAC415

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 將待檢樣品剪碎研磨，加入PBS(1∶3)，反復凍融3次，然后5 000 r/min 離心5 min，取上清備用。標準毒株以及疫苗株凍融3次后5 000 r/min 離心5 min，取上清備用。

1.2.2 核酸提取及PRRSV、CSFV的cDNA制備 145份病樣組織以及標準毒株RNA提取步驟參考RNAiso Plus試劑說明書進行，組織DNA以及標準毒株DNA提取步驟按照DNA提取試劑盒說明書進行。將提取的DNA儲存于-20 ℃，RNA進行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：病毒RNA懸液4 μL，依次加入各病毒反轉(zhuǎn)錄上、下游引物各0.75 μL，MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，dNTPS(2.5 mmol/L)2 μL，5×MLV buffer 4 uL，RNA酶抑制劑0.5 μL，加無RNase水補至20 μL，42 ℃水浴中作用1 h。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存。

1.2.3 單一PCR方法的建立及反應條件優(yōu)化 單一病毒的PCR反應采用30 μL體系:2×EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，各病毒上、下游引物(25 nmol/mL)各1.5 μL，cDNA(或DNA)2 μL，ddH2O補足30 μL。以梯度PCR儀在51 ℃～60 ℃范圍內(nèi)自動設置6個退火溫度梯度。反應程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，梯度退火溫度(51、52.2、54.8、57.7、60.6、62.7 ℃)45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，進行初步鑒定。多次重復試驗后確定各PCR的最佳退火溫度。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 將PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，復蘇后取部分涂布于含Amp+(100 μg/mL)LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h。挑取單菌落進行PCR鑒定，將陽性菌落培養(yǎng)后按試劑盒說明書提取質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結(jié)果進行比對分析。

1.2.5 多重PCR方法的建立及反應條件優(yōu)化 在建立6種病毒單項PCR檢測的基礎上，對多重PCR反應條件進行優(yōu)化，包括退火溫度(53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃)、反應循環(huán)數(shù)(30～35個循環(huán))，在單一變量的情況下分別進行PCR，以確定多重PCR的最佳反應條件。取擴增產(chǎn)物5 μL用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，進行結(jié)果鑒定。

1.2.6 特異性試驗 利用建立的PCR對正常組織、大腸埃希菌(E.coli)、豬流感病毒(SIV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，以評價PCR的特異性。

1.2.7 敏感性試驗 取鑒定為陽性的各病毒克隆質(zhì)粒，用核酸定量儀測定初始濃度，然后5倍比稀釋，取1 μL作為模板，進行多重PCR檢測，以其模板最高稀釋倍數(shù)呈陽性反應的為PCR的敏感度。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 以PRRSV、CSFV的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和PRV、PCV、PPV的DNA為模板分別進行8次多重PCR檢測，對重復性檢驗以評價其穩(wěn)定性。

1.2.9 多重PCR方法的初步應用 對2015年1月到2016年2月收集的山東省各地方臨床樣本進行處理，所有樣品組織勻漿后分為兩份，一份進行多重PCR檢測，另一份用建立的單一PCR進行復檢。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR與多重PCR擴增結(jié)果

利用合成的PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV特異性引物分別擴增相應病毒，并對這6種病毒進行多重PCR擴增。結(jié)果顯示，針對6種病毒單一PCR和多重PCR均能擴增出約806、244、324、527、158、415 bp的片段(圖1)，與預期結(jié)果相符。各單一PCR在54.8 ℃均可得到良好擴增。

M.DNA標準DL 2 000；1.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR產(chǎn)物；2.PRRSV 單一PCR產(chǎn)物；3.PCV-2 單一PCR產(chǎn)物；4.PCMV 單一PCR產(chǎn)物；5.PRV 單一PCR產(chǎn)物；6.CSFV 單一PCR產(chǎn)物；7.PRRSV 單一PCR產(chǎn)物；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 2.PCR products of PRRSV; 3.PCR products of PCV-2; 4.PCR products of PCMV; 5.PCR products of PRVV; 6.PCR products of CSFV; 7.PCR products of PPV; 8.Negative control

圖1 單一PCR與多重PCR標準陽性樣品擴增結(jié)果

Fig.1 Amplification results of single PCR and multiplex PCR in standard positive samples

2.2 PCR產(chǎn)物的鑒定

將標準陽性樣品單一PCR擴增產(chǎn)物連接pMD19-T載體，篩選陽性重組質(zhì)粒送至生工生物工程上海股份有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI在線工具BLAST比對分析。結(jié)果顯示，擴增序列PRRSV NSP2基因、CSFV Polypro基因、PRV gB基因、PCV-2 rep基因、PPV VP2基因、PCMV DPOL基因與6種病毒各自引物設計株的預期擴增序列同源性均在99.8%以上，表明所擴增基因片段分別為PRRSV NSP2基因、CSFV Polypro基因、PRV gB基因、PCV-2 rep基因、PPV VP2基因及PCMV DPOL基因。

2.3 PCR反應條件優(yōu)化

通過固定單一變量，在改變其他條件的情況下對多重PCR進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，在循環(huán)次數(shù)為35，退火溫度55 ℃(圖2)時反應擴增效果最佳。最佳反應條件為，反應總體積50 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 25 μL，4種DNA病毒的上下游引物等比例混合液各1 μL(每條引物濃度25 nmol/mL，PRRSV、CSFV上下游引物各1.5 μL(每條引物濃度25 nmol/mL)，4種DNA模板各1 μL，cDNA模板各2 μL，ddH2O 10 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

M.DNA標準DL 2 000；1.53 ℃；2.54 ℃；3.55 ℃；4.56 ℃；5.57 ℃；6.58 ℃；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.53 ℃; 2.54 ℃; 3.55 ℃; 4.56 ℃; 5.57 ℃; 6.58 ℃; 7.Negative control

圖2 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

Fig.2 The optimal annealing temperature in multiplex PCR

2.4 特異性試驗結(jié)果

利用已建立的多重PCR反應進行特異性試驗，結(jié)果顯示，對正常組織、大腸埃希菌(E.coli)、SIV、PEDV、TGEV、PoRV和 FMDV無特異性擴增，而PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV均可擴增出預期大小的條帶，經(jīng)測序后確定是目的基因序列(圖3)。表明該方法有良好的特異性。

2.5 敏感性試驗結(jié)果

對5倍梯度稀釋的模板進行多重PCR的敏感性試驗，結(jié)果顯示，該多重PCR能檢測到的PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV的最低核酸濃度分別為12.8、46、16、23.5、72、8.6 pg(圖4)。

2.6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

利用已建立的多重PCR反應對PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV進行8次重復試驗，結(jié)果顯示，擴增結(jié)果均一致(圖5)。

2.7 多重PCR方法的初步應用

用建立的多重PCR對145份來自山東省各地豬場的臨床發(fā)病豬病料進行檢測，結(jié)果顯示，PRV陽性率為38.62%(56/145)，PCV-2陽性率為36.55%(53/145)，PRRSV陽性率為28.28%(41/145)，PRRSV-PCV-2陽性率占6.90%(10/145)；PRRSV-PRV-PCMV陽性率占9.67%(14/145)，有4份樣品為CSFV-PRV-PPV-PCMV四重感染(表2)，部分樣本的電泳結(jié)果見圖6。所有樣本經(jīng)單一PCR方法驗證，結(jié)果與多重PCR符合率為98.6%。

M.DNA標準DL 2 000；1.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR產(chǎn)物；2.JEV 單一PCR產(chǎn)物；3.TGEV 單一PCR產(chǎn)物；4.PEDV 單一PCR產(chǎn)物；5.PoRV 單一PCR產(chǎn)物；6.SIV 單一PCR產(chǎn)物；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 2.PCR products of JEV; 3.PCR products of TGEV; 4.PCR products of PEDV; 5.PCR products of PoRV; 6.PCR products of SIV; 7.Negative control

圖3 多重PCR特異性試驗結(jié)果

Fig.3 Specificity results of multiplex PCR

M.DNA標準DL 2 000；1～6.5-1～5-6稀釋

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.5-1-5-6dilutions

圖4 多重PCR敏感性試驗結(jié)果

Fig.4 Sensitivity test of multiplex PCR

M.DNA標準DL 2 000；1～8.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR產(chǎn)物；9.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-8.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 9.Negative control

圖5 多重PCR穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Fig.5 Stability test of multiplex PCR

表2 臨床樣本感染狀況統(tǒng)計

Table 2 Statistics on infection status of clinical samples used for multiplex PCR amplification

項目Item陽性樣品數(shù)NumberofPositivesamples比例/%RatePRRSV單純感染PRRSVinfection74.83CSFV單純感染CSFVinfection117.59PRV單純感染PRVinfection106.90PCV-2單純感染PCV-2Infection74.83PPV單純感染PPVInfection10.69PCMV單純感染PCMVInfection85.52PRRSV+PCV-2混合感染PRRSV+PCV-2co-infection106.90PRRSV+PRV混合感染PRRSV+PRVco-infection85.52CSFV+PCV-2混合感染CSFV+PCV2co-infection74.83PRV+PCV-2混合感染PRV+PCV-2co-infection53.45CSFV+PRV混合感染CSFV+PRVco-infection42.76PCV-2+PCMV混合感染PCV-2+PCMVco-infection32.07PRRSV+PPV混合感染PRRSV+PPVco-infection32.07PRRSV+PCV-2+PRV混合感染PRRSV+PCV-2+PRVco-infection149.66PRV+PCV-2+PRV混合感染PRV+PCV-2+PRVco-infection42.76CSFV+PCV-2+PCMV混合感染CSFV+PCV-2+PCMVco-infection32.07CSFV+PRV+PPV+PCMV混合感染CSFV+PRV+PPV+PCMVco-infection42.76未檢出感染Noinfection2416.55

M.DNA標準DL 2 000；1～28.臨床樣本；29.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000 ; 1-28.Clinical samples; 29.Negative control

3 討論

本研究建立了豬場中常見6種傳染病病原的多重PCR檢測方法，分別針對PRRSV的Npro基因、CSFV的Polypro基因、PRV的gB基因、PCV-2的rep基因、PPV的VP2基因、PCMV的DPOL基因的保守區(qū)域設計了6對特異性的引物，可同時擴增出806、244、324、527、158、415 bp的條帶，與預期目的條帶大小相符。實現(xiàn)了通過一次PCR反應檢測多種病原的目標，通過試驗驗證了該方法特異性好，靈敏度高，檢測核酸含量可達pg級。本試驗采用EasyTaqPCR Super Mix代替?zhèn)鹘y(tǒng)的PCR 反應體系(dNTP、Taq酶、10×PCR buffer組合體系)，減少了加樣的繁瑣步驟以及可能產(chǎn)生的污染，同時提高了反應的靈敏度。

對145份來自山東省各地豬場的臨床發(fā)病豬樣本進行檢測，混合感染率為69.66%(101/145),其中以PRRSV-PRV-PCV三重感染最為嚴重，達到9.67%(14/145)；其次是PRRSV-PCV-2二重感染占6.90%(10/145)；單純感染僅占30.35%(44/145)。結(jié)果表明,混合感染已經(jīng)成為我國規(guī)模化豬場疫病發(fā)生的流行趨勢，豬巨細胞病毒感染陽性率占14.48%(21/145),低于裴曉萌報道的山東省PCMV感染率40%[10]。本次研究中，針對6種病毒的檢測并沒有進行野毒株和疫苗株的區(qū)分，因此檢測結(jié)果中不排除有疫苗株的可能。

本研究建立的檢測引起豬繁殖障礙類疫病的常見6種病毒的PCR方法，可快速、準確的檢測出引起繁殖障礙的PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2、PPV和PCMV，該方法可用于臨床樣本的檢測,有廣闊的應用前景。

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Establishment and Application of Multiplex PCR for Detecting Six Kinds of Swine Viruses

LUO Ning1,2，WANG Dong-dong1，YANG Zong-tong1，SUN Ju1，XU Shou-zhen1,3，WANG Shou-chun3，YIN Yan-bo1,3，XU Biao2

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong,266019,China; 2.ShanDongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau/FoodandAgriculturalProductsMonitoringCenter,Qingdao,Shandong,266001,China; 3.QingdaoOland-BetterBioengineeringCo.,LTD.,Qingdao,Shandong,266101,China)

The aim of this assay was to establish a multiplex PCR method for simultaneously detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),classical swine fever virus(CSFV),porcine pseudorabies virus (PPV),porcine circovirus type 2 (PCV-2),porcine parvovirus (PPV) and porcine cytomegalovirus (PCMV).Six pairs of specific primers were designed for a multiplex PCR based on the conservative nucleotides according to references and sequence analysis.Samples collected from clinically ill pigs were detected by the multiplex PCR method.The results of sensitivity and specificity tests showed that the minimum amounts of nucleic acid detection by the mPCR were 12.8,46,16,23.5,72，8.6 pg respectively,and the amplification results of swine influenza virus (SIV),Japanese encephalitis virus (JEV),porcine epidemic diarrhea virus,(PEDV),transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PoRV) were all negative.A total of 145 specimens piglets were tested by the multiplex PCR method, the total positive rate was 83.45%,and the co-infection rate was 69.66%.We successfully established a multiplex PCR method with high sensitivity,and specificity and the method was well used in clinical tests.

PRRSV; CSFV; PRV; PCV-2; PPV; PCV; multiplex PCR

2016-05-16

國家科技支撐計劃項目(2015BAI07B01)

羅 寧(1990-)，女，山東威海人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究。*通訊作者

S855

A

1007-5038(2016)12-0001-06