九味補(bǔ)血口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃若干 裴澤建 黃平權(quán) 藍(lán)曉東 覃佩莉 梁杰敏 林海英 王小紅

廣西盈康藥業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530023

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九味補(bǔ)血口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃若干 裴澤建 黃平權(quán) 藍(lán)曉東 覃佩莉 梁杰敏 林海英 王小紅

廣西盈康藥業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530023

目的：提高九味補(bǔ)血口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)人參、絞股藍(lán)、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)五味子中五味子醇甲進(jìn)行定量分析。結(jié)果：人參與絞股藍(lán)、黃芪的薄層色譜均具有特征性的清晰斑點(diǎn)，陰性溶液無干擾；五味子醇甲在0.05100～1.5300μg范圍內(nèi)其峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為100.97%(RSD=0.91%)。結(jié)論：研究建立的定性鑒別與定量分析方法靈敏、準(zhǔn)確，具有良好專屬性和重現(xiàn)性，更能有效控制九味補(bǔ)血口服液的質(zhì)量。

九味補(bǔ)血口服液；人參；絞股藍(lán)；黃芪；五味子醇甲

九味補(bǔ)血口服液由人參、黃芪、絞股藍(lán)、當(dāng)歸等藥味組成，具有益氣補(bǔ)血、健脾益胃的功效。原標(biāo)準(zhǔn)只建立當(dāng)歸、甘草、陳皮的薄層色譜鑒別和正丁醇提取物測定方法，方中君藥人參、黃芪等均未建立有定性或定量的質(zhì)控指標(biāo)，為能更加有效控制本品質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)開展人參、黃芪、絞股藍(lán)薄層色譜鑒別研究和五味子中五味子醇甲HPLC測定研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-10ATVP高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 材料 人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-200318)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：110713-200322)、黃芪甲苷(批號(hào)：0781-200109)、五味子醇甲(批號(hào)：110857-201513)對(duì)照品、人參(批號(hào)：120917-200406)、絞股藍(lán)(批號(hào)：121311-200402)對(duì)照藥材均購自中國藥品生物制品檢定研究院；九味補(bǔ)血口服液(批號(hào)：131201、131202、131203，廣西盈康藥業(yè)有限責(zé)任公司)。乙腈、磷酸為色譜醇；水為純化水；其余試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別2.1.1 人參和絞股藍(lán)的薄層鑒別 取本品30mL，加三氯甲烷30mL，振搖提取，分取上層溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(30mL，30mL，20mL)，合并正丁醇提取液，用氨試液提取2次，每次50mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50mL，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，用水50mL洗脫，棄去水洗脫液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參對(duì)照藥材0.8g和絞股藍(lán)對(duì)照藥材2g，同法制備成對(duì)照藥材溶液；再取人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)照品加甲醇制成每1mL各含1mg的對(duì)照品溶液。按處方比例制備缺人參、絞股藍(lán)的陰性樣品，同法制成陰性溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各1～2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑[1]8，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，分別與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置紫外光(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

2.1.2 黃芪的薄層鑒別 取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取2.1.1項(xiàng)的供試品溶液作為供試品溶液。按本品制法制備缺黃芪陰性樣品，同法制備陰性溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各1～2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上層溶液)-甲醇(10∶1)[1]302為展開劑，置氨氣飽和的層析缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性試驗(yàn)無干擾。見圖2。

2.2 五味子醇甲的含量測定[1]66

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 照中國藥典2015版四部通則0512高效液相色譜法，色譜柱為日本島津公司BDS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相；檢測波長為250nm；理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2.2 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含50μg的對(duì)照品溶液。②供試品溶液制備：精密量取本品10mL，置分液漏斗中，加水20mL，混勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘?jiān)执渭蛹状歼m量使溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。③陰性樣品溶液制備：按標(biāo)準(zhǔn)處方工藝制備不含五味子的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備成陰性樣品溶液。

分別精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，專屬性試驗(yàn)色譜圖見圖3、4、5。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，且該色譜峰和其他組分色譜峰分離度符合規(guī)定，陰性樣無干擾，說明該方法的系統(tǒng)適用性和專屬性良好。

2.2.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取五味子醇甲對(duì)照品12.75mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(含五味子醇甲0.2550mg/mL)，精密量取該貯備液0.5mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對(duì)照液各10μL注入液相色譜儀，結(jié)果峰面積分別為97065、497390、993624、1500990、2016087、2520814、3022343。以五味子醇甲峰面積(A)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=5.0460×10-7X-0.0047(r=0.9999，n=7)。結(jié)果五味子醇甲在0.05100～1.5300μg范圍之間線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品的供試品溶液10μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄五味子醇甲色譜圖及峰面積，分別為1075998、1067577、1065693、1067843、1079951、1082658，平均峰面積1073287，RSD為0.67%(n=6)，表明精密度良好，符合要求。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品同一批號(hào)的樣品，照含量測定項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算含量分別為54.06、53.79、54.13、53.84、53.76、54.25μg/mL，平均53.97μg/mL，RSD為0.38%(n=6)，說明重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 照上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，取該供試品溶液分別于0h、4h、8h、16h、24h測定峰面積，分別為1076001、1069854、1072581、1070732、1078765、1069781，平均1072952，RSD為0.34%。表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知五味子醇甲含量的本品同一樣品(批號(hào)：131201，含量為53.97μg/mL)，精密量取5mL，加水25mL，共9份，分別精密加入對(duì)照品貯備液(濃度為0.1376mg/mL)1mL、2mL、3mL，低、中、高濃度各3份，照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法處理、測定。結(jié)果表明，本法加樣回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 樣品的含量測定 按上述含量測定方法測定了本品10批樣品五味子醇甲的含量，結(jié)果分別為54.0、61.7、45.6、73.1、54.2、42.8、41.9、56.3、64.7、69.2μg/mL。

3 討論

3.1 人參中含有多種人參皂苷，絞股藍(lán)中主要含四環(huán)三萜皂苷，其中多種皂苷結(jié)構(gòu)與人參皂苷相同，如人參皂苷Rb1、Rd、Rb3和F2等[2]，為方便實(shí)驗(yàn)操作，故在預(yù)試驗(yàn)時(shí)就設(shè)計(jì)采用同一方法同時(shí)對(duì)這兩味藥材進(jìn)行薄層鑒別。在進(jìn)行人參、絞股藍(lán)薄層鑒別預(yù)試驗(yàn)摸索過程中，曾嘗試使用過(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上層溶液)-甲醇(10∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)等展開劑，但因制劑中含皂苷成分太多，分離效果均不夠理想，最終以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑最為理想，在此條件下，斑點(diǎn)能較好的分離且清晰圓整，Rf值適宜，方法簡便，重現(xiàn)性好。

3.2 《中國藥典》中黃芪使用黃芪甲苷作為對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別，我們也擬定采用黃芪甲苷作為本藥材的鑒定指標(biāo)。在進(jìn)行黃芪薄層鑒別預(yù)試驗(yàn)時(shí)，曾嘗試使用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層液等展開劑，分離效果均不夠理想，最終以(正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上層溶液)-甲醇(10∶1)為展開劑最為理想，此法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。

3.3 在進(jìn)行本試驗(yàn)的含量測定方法摸索時(shí)，曾嘗試使用HPLC法對(duì)方中的人參、絞股藍(lán)建立含量測定方法，以人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)照品為含測指標(biāo)，但陰性樣有干擾而無法建立。五味子醇甲含測方法流動(dòng)相經(jīng)選擇甲醇-水不同比例進(jìn)行比較，最終甲醇-水的比例為60∶40時(shí)主成分峰分離度、峰形最佳；五味子醇甲甲醇溶液在250nm處有最大吸收而選擇此波長作為檢測波長；對(duì)于供試品溶液的制備，曾選用乙醚、乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行萃取處理，結(jié)果乙醚萃取乳化嚴(yán)重，而乙酸乙酯萃取效果良好而被選用。

本試驗(yàn)對(duì)方中的人參、絞股藍(lán)、黃芪等藥味進(jìn)行定性鑒別和對(duì)五味子醇甲進(jìn)行定量測定，方法靈敏、準(zhǔn)確，具有較好專屬性和重現(xiàn)性，為九味補(bǔ)血口服液提升質(zhì)量控制方法提供具有參考價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。從測定的10批樣品中五味子醇甲的含量來看，五味子醇甲的最低含量為41.9μg/mL，最高為73.1μg/mL。造成樣品中五味子醇甲含量高低不均的原因，應(yīng)該是五味子藥材不同批次之間因產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏等因素的影響而使五味子醇甲含量存在差異性，因此在投料生產(chǎn)時(shí)要把好藥材質(zhì)量關(guān)，以保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:8,302,66.

[2]國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1999：533.

(編輯：程鵬飛)

Study on Quality Standard of Jiuwei Buxue Oral Liquid

HUANG Ruogan PEI Zejian HUANG Pingquan LAN Xiaodong QING Peili LIANG Jiemin LIN Haiying WANG Xiaohong

Guangxi Yingkang Pharrmacy Co. Ltd.，Nanning 530023，China

Objective To improve the quality standard of Jiuwei Buxue oral liquid. Methods Thin layer chromatography was used to identify Ginseng Radix Et Rhizoma, Gynostemma and Astragali Radix. High performance liquid chromatogranhy was used to determine schisandrin content in Schisandra Chinensis. Results The chromatographic spots of Radix Et Rhizoma, Gynostemma and Astragali Radix were claer with characteristic, and negative solution didn’t interfere with this result. The peak area and sample volume of schisandrin showed a good linearity at a range at 0.05100 to 1.5300μg and the average recovery was 100.97% (RSD=0.91%).Conclusion This study established the metohd of qualitative identification and quantitative anlysis is Sensitive and accurate and has good specificity and reproducibility, which can be used to control the quality of Jiuwei Buxue oral liquid better.

Jiuwei Buxue Oral Liquid;Radix Et Rhizoma; Gynostemma; Astragali Radix；Schisandrin

2016-09-19

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻14124004-2-5)；南寧市科學(xué)技術(shù)與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20133328)。

黃若干(1973-)，男，主管藥師，主要從事中藥制劑的生產(chǎn)、新藥開發(fā)研究以及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:huangruogan@163.com

R284

A

1007-8517(2016)23-0016-04