雷公藤紅素經(jīng)過(guò)TRAIL途徑增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株HOS的殺傷作用①

李朝旭 張浚哲 王勝濤 王銳英 唐際存

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨二科，桂林541004)

·中醫(yī)中藥與免疫·

雷公藤紅素經(jīng)過(guò)TRAIL途徑增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株HOS的殺傷作用①

李朝旭 張浚哲 王勝濤 王銳英 唐際存②

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨二科，桂林541004)

目的：探討雷公藤紅素經(jīng)過(guò)TRAIL途徑增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株HOS的殺傷作用。方法：Western blot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞株HOS死亡受體(DR)的表達(dá)。使用唑來(lái)膦酸(ZOL)聯(lián)合IL-2體外擴(kuò)增人γδ T細(xì)胞，LDH法檢測(cè)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞株的殺傷活性。結(jié)果：雷公藤紅素可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞株HOS死亡受體DR4和DR5的表達(dá)(P<0.05)。健康人來(lái)源的γδ T細(xì)胞具有殺傷HOS細(xì)胞株的能力(P<0.05)，經(jīng)過(guò)雷公藤紅素(1 μmol/L) 24 h預(yù)處理HOS細(xì)胞株，γδ T細(xì)胞殺傷HOS細(xì)胞株的能力增強(qiáng)(P<0.05)，TRAIL中和抗體可阻斷雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞殺傷HOS細(xì)胞株的能力(P<0.01)。結(jié)論：雷公藤紅素經(jīng)過(guò)TRAIL途徑增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株HOS的殺傷作用。

骨肉瘤；γδ T細(xì)胞；免疫治療；雷公藤紅素

我們前期研究顯示，γδ T細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)有一定的殺傷作用[1]。然而，腫瘤微環(huán)境中大量免疫抑制因素的存在，導(dǎo)致免疫效應(yīng)細(xì)胞難以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，影響了γδ T細(xì)胞免疫治療的效果，限制了γδ T細(xì)胞的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。

通過(guò)藥物上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的為免疫細(xì)胞所識(shí)別的特異性高親和力受體，達(dá)到免疫細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，是提高γδ T細(xì)胞免疫治療效果的可靠途徑[2]。因此，尋找不同的聯(lián)合方案成為提高γδ T細(xì)胞免疫治療OS亟需解決的問(wèn)題[3]。本研究旨在觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷人OS細(xì)胞系HOS的影響及機(jī)制，為OS患者的γδ T細(xì)胞免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Daudi和人OS細(xì)胞系HOS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。唑來(lái)膦酸(Zoledronate,ZOL)、雷公藤紅素為瑞士諾華制藥公司產(chǎn)品，人重組白介素2(recombinant interleukin 2，rIL-2)、 MTT和DMSO購(gòu)自上海普欣生物有限公司,CD3、TCR-γδ、死亡受體(Death receptors,DR)4、DR5和抗腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自加拿大Cedarlane公司，CytoTox96?非放射性細(xì)胞毒性試劑盒購(gòu)自Promega公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640干粉均購(gòu)自Gibco公司，CytomicsTMFC500型流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman-Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) Daudi細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，HOS細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液裂解雷公藤紅素處理前后HOS細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，等量蛋白質(zhì)采用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)PVDF膜上，室溫下?lián)u動(dòng)封閉2 h后，總蛋白加入鼠抗人DR4、DR5抗體4℃過(guò)夜，室溫下洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 耦聯(lián)羊抗鼠二抗，ECL顯影，以β-actin條帶作為內(nèi)對(duì)照。

1.2.3 γδ T細(xì)胞制備 本研究獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并經(jīng)健康志愿者同意。γδ T細(xì)胞制備具體步驟見(jiàn)我們以前研究[4]。取健康人外周靜脈血5 ml,1∶1稀釋后,用淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×106ml,在24孔培養(yǎng)板(1 ml/孔)中培養(yǎng),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱;培養(yǎng)第1天新鮮培養(yǎng)液含ZOL 1 μmol/L和人rIL-2 400 U/ml;以后，每3 d更換一半新鮮培養(yǎng)液，內(nèi)含人rIL-2 400 U/ml，共培養(yǎng)2周后收獲γδ T細(xì)胞，分別加入抗人TCR-γδ-PE抗體和抗人CD3-FITC抗體， 避光4℃孵育30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞的純度。

1.2.4 T細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗(yàn)及阻斷試驗(yàn) 以HOS為靶細(xì)胞,分別設(shè)置效靶細(xì)胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1,根據(jù)CytoTox96?非放射性細(xì)胞毒性試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)體外擴(kuò)增2周的γδ T細(xì)胞細(xì)胞毒性，具體步驟見(jiàn)我們以前研究[5]。阻斷實(shí)驗(yàn)，γδ T細(xì)胞在含抗TRAIL抗體(10 μg/ml)的新鮮培養(yǎng)液孵育半小時(shí)，PBS洗滌2次后,按6∶1的比例，與HOS細(xì)胞混合。根據(jù)以下公式計(jì)算:γδ T細(xì)胞殺傷率=(A實(shí)驗(yàn)組-A效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組-A靶細(xì)胞對(duì)照組)/( A靶細(xì)胞最大釋放量組-A靶細(xì)胞對(duì)照組)×100%[6]。

1.2.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活力 γδ T細(xì)胞分別以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。加入終濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00和16.00 μmol/L的雷公藤紅素，每個(gè)濃度梯度設(shè)5個(gè)復(fù)孔同時(shí)設(shè)空白和未干預(yù)對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力：γδ T細(xì)胞細(xì)胞相對(duì)活力=A藥物/A對(duì)照×100%。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素促進(jìn)HOS細(xì)胞DR4和DR5的表達(dá) 如圖1所示， DR4和DR5在HOS細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)較弱。經(jīng)不同濃度雷公藤紅素預(yù)處理HOS 24 h后，HOS細(xì)胞DR4和DR5表達(dá)明顯提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈劑量依賴(lài)性。

2.2 γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞具有殺傷作用 4例健康人志愿者參與本研究,健康人PBMCs來(lái)源的γδ T細(xì)胞體外擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)我們前期研究[6，7]。如圖2所示，在效靶細(xì)胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T細(xì)胞對(duì)HOS的殺傷率分別為(3.2±1.3)%、(12.0±2.1)%、(16.7±1.9)%和(19.5±2.0)%。

2.3 雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用 HOS在含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h，觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷HOS細(xì)胞的影響。結(jié)果如圖2所示，在效靶細(xì)胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T細(xì)胞對(duì)雷公藤紅素預(yù)處理的HOS細(xì)胞的殺傷率達(dá)到(8.0±2.1)%、(17.3±2.4)%、(24.7±1.5)%和(36.3±1.4)%，雷公藤紅素可增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用(P<0.05)。

圖1 雷公藤紅素對(duì)HOS細(xì)胞DR4 and DR5表達(dá)的影響Fig.1 Impact of celastrol on DR4 and DR5 expression in OS cell line HOS

圖2 雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用Fig.2 Celastrol sensitizes OS cells HOS to γδ T cell-mediated cytotoxicityNote:*.P<0.05 vs untreated group.

圖3 TRAIL中和抗體阻斷γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用Fig.3 Effect of a neutralizing TRAIL antibody on cytotoxic lysis of OS cells by γδ T cells

圖4 雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖及殺傷活性的影響Fig.4 Impact of celastrol on proliferation and cytotoxic activity of γδ T cells

2.4 雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用通過(guò)TRAIL途徑 為了觀察雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用的途徑，我們使用TRAIL中和抗體，阻斷γδ T細(xì)胞經(jīng)過(guò)TRAIL途徑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷。結(jié)果如圖3所示，在效靶細(xì)胞比為6∶1時(shí)，γδ T細(xì)胞對(duì)未處理的HOS細(xì)胞及雷公藤紅素預(yù)處理的HOS細(xì)胞的殺傷分別達(dá)到(16.7±1.9)%和(24.7±1.5)%；使用TRAIL中和抗體預(yù)先作用γδ T細(xì)胞30 min后，對(duì)未處理的HOS細(xì)胞及雷公藤紅素預(yù)處理的HOS細(xì)胞的殺傷分別達(dá)到(10.7±1.0)% 和(9.7±1.0)%，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 小劑量雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞活力及殺傷活性無(wú)影響 結(jié)果如圖4A所示， 當(dāng)雷公藤紅素的濃度達(dá)到4 μmol/L時(shí)，γδ T細(xì)胞活力仍然達(dá)到(86 ± 2.3)%，提示小劑量雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞活性影響不大。為觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷活性的影響，我們選擇對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷敏感的Daudi細(xì)胞作為靶細(xì)胞，γδ T細(xì)胞在含或不含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h后，觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷Daudi細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷活性無(wú)明顯影響(P<0.05，圖4B)。

3 討論

目前已知TRAIL途徑是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一[8],亦是γδ T細(xì)胞識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞的重要途徑之一[9]。TRAIL屬腫瘤壞死因子超家族成員，表達(dá)于活化的T細(xì)胞,與DR4/DR5結(jié)合可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響[10]。體外實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)DR的OS細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的caspase-8介導(dǎo)的凋亡高度敏感，并且體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)TRAIL可阻止肺部淋巴結(jié)播散和提高OS動(dòng)物模型生存率[11]。因此，上調(diào)OS細(xì)胞表面死亡受體DR4/DR5的表達(dá)，可能促進(jìn)γδ T細(xì)胞免疫治療OS。

雷公藤紅素是雷公藤單體之一，屬三萜類(lèi)色素，分子式為C29H38O4，分子量為450。除了具有抗氧化、抗風(fēng)濕、抗老年癡呆癥等功效，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素也具有廣泛的抗癌活性。尤其重要的是，雷公藤紅素可通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面死亡受體DR4和DR5，進(jìn)而增強(qiáng)通過(guò)TRAIL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]，提示雷公藤紅素可能致敏免疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用[13]。但是，雷公藤紅素能否上調(diào)OS細(xì)胞表面死亡受體DR4和DR5并被γδ T細(xì)胞識(shí)別，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究經(jīng)不同濃度雷公藤紅素預(yù)處理OS細(xì)胞系HOS 24 h后，HOS細(xì)胞DR4和DR5表達(dá)明顯提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈劑量依賴(lài)性，提示雷公藤紅素可能致敏免疫細(xì)胞對(duì)OS細(xì)胞的殺傷作用。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)健康人及不同類(lèi)型OS患者PBMCs經(jīng)ZOL刺激可選擇性高度擴(kuò)增γδ T細(xì)胞[7]，尤其重要的是，這種體外擴(kuò)增的γδ T細(xì)胞對(duì)OS細(xì)胞具有殺傷作用[14]。但是，本研究及我們前期研究結(jié)果表明γδ T細(xì)胞對(duì)OS細(xì)胞的殺傷作用較弱[15]。為觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷HOS細(xì)胞的影響，本研究結(jié)果顯示1 μmol/L的雷公藤紅素預(yù)處理HOS 24 h，可增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞殺傷作用(P<0.05)。

為確定雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞殺傷HOS細(xì)胞的作用途徑，我們使用TRAIL中和抗體，阻斷γδ T細(xì)胞TRAIL殺傷途徑。結(jié)果顯示，其對(duì)未處理的HOS細(xì)胞及雷公藤紅素預(yù)處理的HOS細(xì)胞的殺傷作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)OS細(xì)胞株HOS的殺傷作用是通過(guò)TRAIL途徑發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖及殺傷活性的影響，我們首先采用MTT法觀察不同濃度雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示， 在含濃度達(dá)到4 μmol/L的雷公藤紅素培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，γδ T細(xì)胞增殖率仍然達(dá)到(86.0±2.3)%。為觀察雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷活性的影響，我們選擇對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷敏感的Daudi細(xì)胞作為靶細(xì)胞，γδ T細(xì)胞在含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h后， γδ T細(xì)胞對(duì)Daudi細(xì)胞殺傷活性無(wú)明顯變化(圖4B)。因此，我們認(rèn)為小劑量雷公藤紅素對(duì)γδ T細(xì)胞增殖及殺傷活性無(wú)影響，在本研究中我們采用1 μmol/L的雷公藤紅素預(yù)處理骨肉瘤細(xì)胞系HOS。

綜上所述，雷公藤紅素能上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞表面死亡受體DR4和DR5，進(jìn)一步促進(jìn)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞的殺傷作用，TRAIL中和抗體可阻斷雷公藤紅素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)HOS細(xì)胞的殺傷作用。

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[收稿2016-04-13 修回2016-05-18]

(編輯 倪 鵬)

Celastrol increases osteosarcoma cells line HOS lysis by γδ T cells through TRAIL way

LI Zhao-Xu,ZHANG Jun-Zhe,WANG Sheng-Tao,WANG Rui-Ying,TANG Ji-Cun.

Department of Orthopaedics No.2,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541004,China

Objective:To investigate whether celastrol can increase the cytotoxic activity of γδ T cells against osteosarcoma(OS) cells line HOS through TRAIL way.Methods:The death receptors 4/5 (DR4/5) protein levels in the OS cell lines HOS was investigated by Western blot analysis.Zoledronate (ZOL) was used to induce γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers.γδ T cell cytotoxicity against HOS cells was investigated by a standard lactate dehydrogenase release assay (LDH).Results:Celastrol increased DR4/5 protein expression in HOS (P<0.05).γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers showed cytotoxicity against HOS (P<0.05).Following co-culture with HOS pre-treated with celastrol (1 μmol/L) for 24 h,γδ T cells showed significantly higher cytotoxicity against HOS (P<0.05).The induction of DR4/5 molecules increased lysis of HOS by γδ T cells which was abolished by addition of a blocking TRAIL antibody.Conclusion:Celastrol can enhance γδ T cells′cytotoxic activity against OS cells line HOS through TRAIL way.

Osteosarcoma;γδ T cell;Immunotherapy;Celastrol

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.011

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金 (81360400)和廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFAA118169)資助項(xiàng)目。

李朝旭(1977年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事骨與軟組織腫瘤的生物治療方面研究，E-mail:lizhaoxu@glmc.edu.cn。

R392.12

A

1000-484X(2016)12-1777-04

②通訊作者，E-mail:tangjicun@glmc.edu.cn。