β-arrestin1激活STAT3信號通路影響白血病細胞K562體外遷移侵襲能力

張紅霞 吳廣勝

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液風濕科，石河子832000)

β-arrestin1激活STAT3信號通路影響白血病細胞K562體外遷移侵襲能力

張紅霞 吳廣勝

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液風濕科，石河子832000)

目的：探討β-arrestin1對白血病細胞生物學功能的影響及相關機制的研究。方法：特異性的β-Arrestin1-siRNA和陰性對照siRNA轉染K562細胞，形成β-Arrestin1-siRNA組、陰性對照siRNA組和空白組對照組。以此為實驗分組，應用transwell小室法檢測各組細胞的遷移侵襲能力變化，Western blot檢測pSTAT3蛋白的表達。結果：β-Arrestin1-siRNA處理組細胞的遷移和侵襲能力較對照組分別下降43%及52%(P<0.05)；且pSTAT3蛋白表達減少；STAT3抑制劑能抑制K562細胞體外遷移侵襲能力。結論：白血病細胞K562中β-arrestin1蛋白高表達激活STAT3信號通路，從而促進細胞的遷移侵襲能力。

β-arrestin1；STAT3；遷移侵襲

慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一類以髓系細胞慢性增殖為主要特征，發(fā)生在造血干細胞的惡性克隆性疾病，占白血病確診病例15%～20%，年發(fā)病率為(1～1.5)/10萬[1,2]。95%患者骨髓中可以發(fā)現(xiàn)bcr/abl融合基因陽性，特征性t(9；22)(p34；q11)染色體移位，即Ph染色體。目前有研究報道CML與Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT等信號通路的異常激活密切相關[3-6]。

β-arrestin 是一類細胞內蛋白質，其家族的兩個主要成員為β-arrestin1和β-arrestin2，廣泛存在于機體各組織與器官中；β-Arrestin1是一類有多種功能的信號蛋白，通過七次跨膜偶聯(lián)受體(GPCRs) 介導形成蛋白復合物，在ERK、JNK3、JAK/STAT等信號傳導過程中發(fā)揮重要作用，從而參與腫瘤的侵襲、轉移等過程的發(fā)生。另外，β-arrestin通過結合其他信號分子，并調節(jié)這些分子的磷酸化、泛素化或其細胞內定位等過程，從而對相應的信號通路進行調控，達到調節(jié)腫瘤細胞生命進程的最終目標。

大量研究表明β-arrestin1在白血病中明顯高表達，并且通過激活相關信號通路從而調控急性淋巴細胞白血病細胞和慢性髓細胞白血病細胞的增殖[7-9]?；谶@些研究，本實驗組通過應用siRNA技術，抑制白血病細胞K562中的β-arrestin1表達，從而觀察K562細胞體外遷移和侵襲能力的變化，并進一步探討這一變化的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 anti-β-arrestin1 抗體(Abcam)；GAPDH單克隆抗體(生工上海股份有限公司)；anti-p-STAT3和anti-STAT3(Cell Signaling公司)；1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone公司)；Lipofectamine 2000、陰性對照siRNA、β-arrestin1特異性siRNA及Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(Life technologies公司)；24-Well Cell Migration and Invasion試劑盒(cell biolabs)；STAT3通路的抑制劑(JSI-124)(Calbiochem公司)。

1.1.2 實驗分組 將未轉染的K562細胞列為空白對照組、轉染negative-siRNA的K562細胞列為陰性對照組、轉染β-arrestin1-siRNA的K562細胞列為實驗組。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人慢性髓細胞白血病細胞株K562購自American Type Culture Collection公司。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2孵箱。根據(jù)細胞培養(yǎng)情況，于細胞生長的對數(shù)生進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉染 取對數(shù)生長期的K562細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，將3條特異性β-arrestin1-siRNA轉入細胞，并篩選出抑制效果最好的一條。Lipofectamine? 2000用Opti-MEM預混后，靜置5 min，分別用Opti-MEM稀釋3條β-arrestin1-siRNA和negative-siRNA，取對應量的稀釋的轉染試劑Lipofectamine? 2000與β-arrestin1-siRNA和negative-siRNA混勻，室溫環(huán)境下靜置20 min。將混合物按分組加入鋪好細胞的6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.3 Western blot檢測細胞中蛋白的表達 PBS充分洗滌細胞3次，RIPA裂解液裂解細胞并抽提總蛋白。BCA法檢測細胞總蛋白濃度，隨后定量35 μg總蛋白，并按照5∶1比例與6×SDS-PAGE上樣緩沖液混合后，95℃加熱5 min。10%SDS-PAGE膠上電泳，轉膜，5%BSA室溫封閉1 h，再分別加入1∶500～1∶2 000稀釋后的相應的一抗，4℃孵育過夜。次日洗滌3次，分別加入相應HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)，室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光法顯色并用ECL凝膠成像系統(tǒng)(ECL,USA)采集圖像。重復3次。

1.2.4 transwell小室法檢測細胞遷移、侵襲能力 對轉染48 h后的K562細胞進行重懸，然后進行臺盼藍染色，對細胞存活率鑒定，超過95%則進行后續(xù)實驗。嚴格按照transwell說明書進行實驗操作。以3×106個/孔的密度將細胞接種于含有和不含有基質膠的transwell的上室中，分別用于測定K562細胞的遷移和侵襲能力；對于侵襲實驗在transwell的下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24 h后對穿膜的K562細胞進行染色，并用酶標儀測定其OD值。實驗重復3次。

2 結果

2.1 siRNA對β-arrestin1蛋白表達的抑制作用 用β-arrestin1 siRNA轉染K562細胞48 h后提取細胞總蛋白，通過Western blot檢測β-arrestin1蛋白的表達水平。結果顯示，特異性siRNA處理后，細胞內β-arrestin1水平顯著降低(圖1)，抑制率為73.3%～78.9%，且第3條序列的抑制率最佳，故選擇該條序列抑制K562細胞體內β-arrestin1的表達，進行后續(xù)實驗。

2.2 特異性siRNA干擾β-arrestin1蛋白對K562細胞體外遷移、侵襲能力的影響 特異性β-arrestin1 siRNA處理K562細胞48 h后， transwell檢測K562細胞體外遷移、侵襲能力的變化，結果發(fā)現(xiàn)特異性β-arrestin1 siRNA處理K562細胞相較于陰性對照或空白對照組的細胞，侵襲和遷移能力均有顯著下降(43%和52%)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結果見圖2。

圖1 Western blot法檢測特異性siRNA對β-arrestin1蛋白表達抑制效率Fig.1 Western blot analysis assess knockdown efficiency of β-arrestin1 siRNANote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

圖2 K562細胞遷移侵襲能力的檢測Fig.2 Detection of migratory and invasive K562 cellsNote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

圖3 Western blot法檢測RNA敲除β-arrestin1后pSTAT3的表達Fig.3 Assessing expression of pSTAT3 post β-arrestin1-siRNA transfection by using Western blot analysisNote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

2.3 Western blot檢測各組細胞內p-STAT3的表達水平 β-arrestin1 siRNA轉染K562細胞48 h后提取細胞總蛋白，經(jīng)Western blot法檢測，結果表明相較于陰性對照或空白對照組，β-arrestin1 siRNA處理組磷酸化的STAT3蛋白(pSTAT3)表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖3。

圖4 抑制STAT3的磷酸化對K562細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Impact on migration and invasion capacity of K562 cells by inhibiting phosphorylation of STAT3 pathwayNote:Compared with the control group,*.P<0.05.

2.4 抑制K562細胞內pSTAT3的表達對K562細胞侵襲、遷移能力的影響 STAT3的抑制劑處理transwell上室中的K562細胞，檢測其體外侵襲、遷移能力的變化；結果發(fā)現(xiàn)，STAT3的抑制劑處理組K562細胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

慢性粒細胞白血病是一種常伴有白細胞異常增生及分化成熟障礙，起源于造血干細胞的惡性克隆性、增殖性疾病，因此檢測白血病細胞特異基因的表達改變可能有助于白血病的早期診斷及治療。腫瘤細胞的高侵襲遷移被認為是目前影響腫瘤治療和復發(fā)的關鍵因素。

Arrestins家族廣泛存在于細胞內，是一類可溶性蛋白質，對G蛋白受體的信號傳導起關鍵作用，并且也能調節(jié)細胞內其他多種信號轉導[10]。β-arrestin1是家族的主要成員，是在β腎上腺素受體激酶[11]純化過程中被發(fā)現(xiàn)的關鍵的支架蛋白[12]和信號調控因子[13]。有研究表明，β-arrestin1參與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生。如β-arrestin1通過激活β-catenin 信號傳導途徑,使卵巢癌細胞體外遷移能力明顯增強[14]；另外還有研究發(fā)現(xiàn)在β-arrestin1轉基因小鼠中，血管內皮生長因子(VEGF)以及基質金屬蛋白酶(MMP)-9的表達增加，微小血管的形成得到了增強，對于細胞的侵襲、遷移以及血管的形成有利，從而提供了腫瘤生長適宜的微環(huán)境[15]。本研究采用siRNA技術抑制白血病細胞K562中β-arrestin1的表達后，觀察K562細胞體外浸潤和轉移能力的變化，結果與學者們研究結果一致。這些研究表明β-arrestin1的高表達能夠促進白血病細胞向周圍淋巴結浸潤和轉移。

腫瘤細胞的浸潤和轉移是由多種細胞因子和多種信號通絡調節(jié)和介導的，其中，JAK/STAT3通路的異常激活可促進多種腫瘤細胞浸潤。Bonetto[16]在研究中指出，IL-6可通過激活磷酸化的STAT3，從而膠質瘤細胞的浸潤及轉移能力增強，而當使用STAT3抑制劑處理細胞后，則能抑制IL-6引起的效應，有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)JAK/STAT3通路的異常激活，可引起下游的VEGF明顯高表達從而對胃癌的發(fā)生、遷移和侵襲有重要的作用?；贘AK/STAT3通路對腫瘤細胞的調控作用，本實驗觀察了抑制K562細胞中β-arrestin1的表達后 STAT3磷酸化水平的變化，結果表明抑制β-arrestin1表達使K562細胞內磷酸化的STAT3水平顯著降低。另外，我們用STAT3通路抑制劑JSI-124抑制STAT3激活后，可觀察到細胞的浸潤、轉移能力顯著降低。進一步證明β-arrestin1通過激活白血病細胞K562體內JAK/STAT3信號通路，使K562細胞遷移侵襲能力明顯增強。

綜上所述，β-arrestin1的高表達與白血病細胞的浸潤、轉移能力密切相關，并且揭示了β-arrestin1對JAK/STAT3信號通路的作用，為發(fā)現(xiàn)慢性髓系白血病新的藥物治療靶點奠定了理論基礎。

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[收稿2016-04-15 修回2016-06-02]

(編輯 許四平)

β-arrestin1 promotes leukemia cell K562 migration and invasion by activating STAT3 signaling pathway

ZHANG Hong-Xia,WU Guang-Sheng.

Department of Rheumatism,the First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi 832000,China

Objective:To investigate the function of β-arrestin1 and its related mechanisms in migration and invasion capacity of leukemia cell K562.Methods:β-arrestin1-siRNA or negative siRNA was transfected into K562 cells of experiment group or control group.The migration and invasion capacity of K562 cells was detected by transwell tests;and the protein expression of β-arrestin1 and pSTAT3 were detected by Western blot.Results:As compared to control group and negative siRNA group,the migration and invasion capacity of transfected β-arrestin1-siRNA group were attenuated about 43% or 52% (P<0.05);Western blot showed that the expression of phosphorylation of STAT3 was decreased in β-arrestin1-siRNA group.And the STAT3 inhibitors obviously suppressed the migration and invasion capacity of K562 cells.Conclusion:In leukemia cells K562,β-arrestin1 activates STAT3 signaling pathway to promote the cell migration and invasion.

β-arrestin1;STAT3;Migration and invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.010

張紅霞(1980年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病方面的研究，E-mail：zhanghongxia3839@163.com。

及指導教師：吳廣勝(1959年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事血液病方面的研究，E-mail：hematology@126.com。

R733.7

A

1000-484X(2016)12-1773-04