穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tα-突觸核蛋白單克隆SH-SY5Y細胞株的建立

東惟玲 方琪 張秀艷 趙昀 單立冬 惠國楨

穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tα-突觸核蛋白單克隆SH-SY5Y細胞株的建立

東惟玲 方琪 張秀艷 趙昀 單立冬 惠國楨

目的 利用分子克隆技術構建含人野生型(WT)及致病突變A30P(G88C)、A53T(G157A) α-突觸核蛋白基因(α-synuclein gene，SNCA)的重組真核表達載體pLentiVENUS-YFP-SNCA，通過慢病毒轉染的方法獲得過表達人野生型及致病突變A30P、A53T α-synuclein單克隆SH-SY5Y細胞株。方法 提取紅白血病細胞K562細胞總RNA，以RT-PCR法擴增SNCA，SNCA與克隆載體PMD-19T的體外連接(T-A克隆)后進行基因測序，將測序正確者以限制性內切酶酶切后與真核表達載體pLentiVENUS連接，建立野生型重組真核表達載體。取正常SNCA與克隆載體連接體，利用單核苷酸差異引物定點突變法構建SNCA的兩個突變型A30P、A53T，經基因測序、酶切與真核表達載體pLentiVENUS連接，建立突變型的重組真核表達載體。以磷酸鈣沉淀法轉染293T細胞制備的慢病毒轉染SH-SY5Y細胞，利用流式細胞儀BD AriaⅢ進行96孔板單細胞分選以獲得穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變型A30P、A53T α-突觸核蛋白的單克隆細胞株，并通過倒置熒光顯微鏡、蛋白免疫印跡、逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，Rt-PCR)、鑒定各單克隆SH-SY5Y細胞株是否過表達。結果 Rt-PCR及電泳結果顯示所獲得目的基因，基因測序結果正確；重組真核表達載體pLentiVENUS-SNCA經限制性內切酶酶切和基因測序證明構建成功。倒置熒光顯微鏡顯示除對照組(未轉染組)外，空載體轉染組及載體與SNCA重組后轉染組均有熒光蛋白表達；但蛋白免疫印跡結果顯示載體與正?；蛲蛔兊腟NCA重組后轉染組的蛋白含量高于空載體組。RT-PCR結果顯示載體與正?；蛲蛔兊腟NCA重組后轉染組的細胞RNA表達量高于空載體組。 結論 利用分子克隆技術和慢病毒轉染技術成功建立過表達α-突觸核蛋白的WT及A53T、A30P突變型SH-SY5Y單克隆細胞株。

α-突觸核蛋白；真核表達載體pLentiVENUS-SNCA；單克隆SH-SY5Y細胞株

人α-突觸核蛋白基因(α-synuclein gene，SNCA)定位于染色體4q21.3-q22,由6個外顯子和若干個內含子組成，其翻譯產物為α-突觸核蛋白(α-synuclein)，這種蛋白在哺乳動物腦中廣泛表達，并在突觸前富集[1]。SNCA基因的二次重復突變和三次重復突變與散發(fā)性和家族性帕金森病(Parkinson disease,PD)均有關系，并且該基因點突變類型A53T、A30P等會引起常染色體顯性遺傳形式的PD[2]。而且，病理情況下α-突觸核蛋白會異常聚集，聚集的α-突觸核蛋白是殘存神經元內包含體——路易小體(Lewy bodies，LB)的主要成分[3]，而LB是PD的主要的特征性病理改變。盡管α-突觸核蛋白在PD患者和模型腦中廣泛存在，但是對LB的形成導致多巴胺神經元以及其他類型神經元退變的病理生理機制目前還知之甚少。由于深入的有關SNCA突變的研究能更好的了解這種蛋白在病理生理過程中的作用，因此本文作者利用分子克隆技術構建含人野生型(WT)及致病突變型A30P、A53T的SNCA重組真核表達pLentiVENUS-YFP-SNCA，并通過慢病毒侵染的方法獲得過表達人WT及致病突變型A30P、A53TSNCA單克隆人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)細胞珠，期望為進一步研究α-突觸核蛋白功能及PD發(fā)病機制奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 Trizol試劑(Ambion公司)、反轉錄試劑盒(Roche公司)、Taq酶(TaKaRa公司)、膠回收試劑盒(Tiangen)、質粒小提試劑盒(Biomiga公司)、質粒大提試劑盒(Invitrogen公司)，胎牛血清、培養(yǎng)基DMEM(Hyclone公司)，兔抗人α-突觸核蛋白抗體(Sigma公司)；人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)由蘇州大學神經科學研究所惠贈，克隆載體和真核表達載體pLentiVENUS、人胚腎293細胞系(293T細胞系)、紅白血病細胞(K562細胞)及Top+10菌株由蘇州大學唐仲英血液病學研究室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 SNCA的克隆及突變質粒的構建：K562細胞總RNA以Trizol法提取并逆轉錄為cDNA。取cDNA 2 μL，引物1 μL進行 PCR，反應設置為94 ℃ 5 min預變性,94 ℃ 30 s變性55 ℃ 30 s退火,72℃ 45 s進行產物延伸,后三步反應反復28個循環(huán)。PCR產物電泳后由離心柱式膠回收試劑盒提純。取膠回收產物4.5 μL,加入克隆載體PMD-19T Vector 0.5 μL,Solution I 5 μL 混合為10 μL連接反應體系于16℃靜置反應30 min～1 h。將上述連接液與40 μL感受態(tài)細菌TOP+10混勻，冰浴(反應管置于碎冰中，溫度約為2～4℃)30 min后于42℃熱激90 s,置冰浴(同上) 2 min轉化感受態(tài)細菌。加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)7 μL、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranosid，X-gal)10 μL混勻，將細菌涂布于含氨芐青霉素的平板上，于37 ℃倒置過夜即可觀察到藍白斑，即藍白相間的菌落(其中白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色菌落是載體自連的轉化子)。篩選出白色陽性菌抽提質粒，以限制性內切酶BglⅡ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因是否插入質粒，陽性者可以看到大小約為480 bp的基因序列。取陽性者送蘇州金唯智公司測序，測序結果利用NCBI軟件與基因圖譜進行比對，以配對率為100%認為所獲基因序列測序正確。

取測序正確的目的基因與克隆載體連接體，利用單核苷酸差異引物定點突變法[4]構建突變質粒，反應體系為Nuclease-Free Water 35 μL,Reaction Buffer 5 μL,引物 2 μL,dNTP 4 μL,待突變質粒模板 3 μL,總體積為49 μL，適當混勻加入1 μL DNA Polymerase。PCR設置為99℃熱蓋，95℃ 1 min預變性,95℃ 40s變性,60℃ 1 min退火，68 ℃ 3.5 min延伸，72℃ 10 min延伸補全，以上6個步驟進行18個循環(huán)。反應完成后直接在PCR反應體系中加入1 μL Dpn I消化，混勻后于37 ℃孵育1 h。反應產物與40 μL感受態(tài)細菌混勻轉化感受態(tài)細菌，將混合液涂布于含氨芐青霉素的平板上板，倒置過夜。挑取單菌落，提取質粒，送檢行基因測序，若突變成功可以看到A30P的序列88位G堿基變?yōu)镃堿基，A53T的序列157位G堿基突變?yōu)锳堿基。構建突變質粒的引物由上海生工生物有限公司合成，SNCA PCR引物序列為：正向為GGAAGATCTGTGTGGTGTAAAGGAAT

TCATT，反向為GGAAGATCTAGAAACTGGGAGCAAAGATA；兩端引入BglⅡ的酶切位點(AGATCT)；單核苷酸差異引物定點突變引物序列：A30P引物序列為：正向為GCACCAGGAAAGACAAAAGAGGGTGTTCTC，反向 GG

TGCTTCTGCCACACCCTGTTTGGTTTTC；A53T引物序列為：正向為GTGACAACAGTGGCTGAGAAGACCAAAGAG，反向為TTGTCACACCATGCACCACTCCCTCCTTGGTT。

1.2.2 重組真核表達載體的構建：將測序正確的目的基因與克隆載體連接的重組體進行限制性內切酶酶切，反應體系為10×Buffer 2 μL,BglⅡ1 μL,質粒DNA17 μL,反應完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收酶切片段，T4 DNA連接酶連接Venus后于16℃過夜，連接體系為線性化Venus 1 μL,T4 DNA連接酶1 μL,10×T4 Buffer 1 μL,酶切片段 7 μL。以同樣方法將連接液轉化感受態(tài)細菌涂板，挑單菌落，抽提質粒，經酶切鑒定連接順序的正反向，正向連接者可以看到大小約為800 bp的條帶出現(xiàn)，選取正向連接者送檢行基因測序，測序正確者可以看到WT的基因序列與基因圖譜配對率100%，A30P的序列88位G堿基變?yōu)镃堿基，A53T的序列157位G堿基突變?yōu)锳堿基，測序結果與未和真核表達載體連接前相同。

1.2.3 病毒包裝及細胞轉染：將野生型及兩種突變型重組真核表達載體轉化感受態(tài)細菌混合液涂布于LB平板上，挑取單菌落利用質粒大量抽提試劑盒大量抽提質粒。分別將對照空載體Venus和抽提的目的質粒(10 μg)和慢病毒包裝必需的三種公共質粒ΔR(6.5 μg)、VSV-G(3.5 μg)和Rev(2.5 μg)混勻，加入Cacl250 μL,混勻后逐滴加入2×Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)，待有乳白色沉淀時加入293 T細胞中混勻，將293T細胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(293T細胞會胞吞含有質粒的顆粒，在細胞內合成慢病毒，然后利用胞吐作用將慢病毒吐出到培養(yǎng)基中)，48 h和72 h后收集含有慢病毒的培養(yǎng)液混合，過濾去掉細胞碎片等雜質后分裝于-80 ℃保存。將所獲得的病毒10 μL加入SH-SY5Y細胞培養(yǎng)基中侵染SH-SY5Y細胞，24 h后更換新的培養(yǎng)基洗脫病毒，以防止病毒對細胞的繼續(xù)毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h后，通過流式細胞儀分選表達熒光蛋白的陽性細胞 ，并將單個陽性細胞打入96孔板中，每孔加含雙抗的培養(yǎng)基200 μL，1周后觀察細胞生長狀況，并移入24孔板擴大培養(yǎng)，待細胞長滿整個孔的80%左右時于250倍倒置熒光顯微鏡下觀察。如圖1所示為真核表達載體pLentiVENUS的結構圖，α-突觸核蛋白與熒光蛋白由核糖體載入位點序列(internal ribosome entry site，IRES)相連，IRES可翻譯一條mRNA上的兩個開放讀框，由其連接的兩個基因的表達率相同，可以通過觀察熒光蛋白的水平來判斷α-突觸核蛋白的表達水平。表達載體可發(fā)出黃色熒光，置于倒置熒光纖維鏡的綠色濾光片下，可見綠色熒光出現(xiàn)，通過熒光蛋白的表達來觀察α-突觸核蛋白的表達。

圖1 pLentiVENUS的結構圖

1.2.4 Western blot法檢測α-突觸核蛋白表達：將1.2.3中慢病毒轉染后的細胞用胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液PBS洗兩遍后加入細胞裂解液超聲裂解，冰上放置1 h后于4℃ 12 000 g離心10 min,離心后的上清即為獲得的細胞總蛋白，取適量用于蛋白濃度測定，其余蛋白-80℃保存。根據(jù)測定的蛋白濃度，用裂解液將蛋白均稀釋至最小濃度 (一般為2.0μg/mL左右)，加入上樣緩沖液后置98℃ 5 min使蛋白變性，由于本實驗中需要觀察的蛋白α-突觸核蛋白和內參蛋白β-actin的分子大小分別是43 000及19 000 ，選用中等濃度12%(最佳分離范圍12 000～60 000)分離膠電泳，電泳完成后將膠上的蛋白轉到NC膜上然后用5%脫脂奶粉或封閉液進行封閉2 h，封閉液濃度過高顯示蛋白的特異性差，濃度過低又不容易顯色，故選用5%的濃度，將稀釋過的一抗(α-突觸核蛋白 1︰1000，內參蛋白β-actin 1︰1000)加入玻璃皿中覆蓋NC膜，4℃冰箱內于搖床上緩慢孵育過夜。次日洗膜后以HRP耦聯(lián)的二抗孵育2 h，采用凝膠成像儀ECL顯色，通過用Image Lab 3.0軟件捕獲不同曝光時長的圖像并保存，觀察空載體轉染組及載體與SNCA(包括WT、A30P及A53T)重組后轉染組蛋白條帶的顏色深淺，如果有α-突觸核蛋白過表達，可以看到分子量為19 000的蛋白條帶顏色較深。

1.2.5 Rt-PCR法檢測mRNA水平：Trizol法提取1.2.3步驟中慢病毒轉染后獲得的細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA,以此為模板進行PCR，反應體系為25 μL，包括LA Taq酶0.25 μL、2×buffer 12.5 μL、cDNA 0.5 μL、dNTP 2 μL、primer 0.5 μL，以無菌水補足25 μL。反應設置為94℃ 5 min預變性,94℃ 30 s變性,55℃ 30 s退火,72℃ 45 s進行延伸,后三步反應反復28個循環(huán)。PCR反應完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察空載體轉染組及載體與SNCA(包括WT、A30P及A53T)重組后轉染組的條帶的亮度來觀察DNA水平進而觀察逆轉錄前的mRNA水平，如果有α-突觸核蛋白過表達，會看到480 bp處的條帶較亮。

2 結果

2.1SNCAPCR獲得目的片段、載體連接及酶切鑒定 提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA,加入SNCA引物進行PCR，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果顯示有分子大小約480 bp左右的條帶出現(xiàn)(圖2A)，即SNCA。PCR產物與克隆載體連接后用限制性內切酶BglⅡ酶切再次鑒定，依然可以看到分子大小約480 bp左右的條帶(圖2B)。將剩余的與克隆載體連接后的質粒進行基因測序，測序正確的質粒用限制性內切酶BglⅡ酶切，再次電泳可見分子大小約480 bp左右的條帶(圖2C)。

A：SNCA PCR產物；B：SNCA與克隆載體連接后利用限制性內切酶酶切；C：測序正確的質粒酶切后電泳圖；1：Marker；2：PCR產物；載體：圖中黑箭頭所示；SNCA：圖中燕尾箭頭所示 圖2 SNCA RT-PCR、載體連接及酶切鑒定

2.2SNCATA克隆及重組表達載體的測序SNCA與克隆載體連接后進行基因測序，利用NCBI軟件將測得的序列與基因圖譜進行比對正確率達100%(圖3)，即獲得了正確序列的SNCA。利用單核苷差異引物定點突變法使SNCA發(fā)生突變，基因測序結果與正?；蜻M行比對，結果可見A30P突變型的序列(圖4A)88位堿基由正常的G變?yōu)镃，A53T突變型的序列(圖4B)157位堿基由G變?yōu)锳，獲得了兩種突變型的SNCA。

2.3SNCA與真核表達載體連接 目的基因與真核表達載體pLentiVENUS連接后轉染感受態(tài)細菌，挑單菌落，抽提質粒，經酶切鑒定連接順序的正反向，正向連接者可以看到分子量約為800 bp(見圖5中樣本6所示)。

2.4 各組α-突觸核蛋白表達比較 倒置熒光顯微鏡下可見除未轉染慢病毒的對照組細胞外，其余4種細胞，即空載體轉染組及載體與SNCA重組后轉染組均帶有熒光(圖6)。

Western blot結果顯示，各組內參β-actin的表達相近，WT及兩種突變型的SH-SY5Y細胞均有Mr約為19 000的蛋白條帶出現(xiàn)，二轉染空載體的細胞幾乎看不到蛋白條帶(圖7)。

Query：T-A連接后的測得的序列；Sbjet：正?；驁D譜；Identities:匹配率 圖3 SNCA 與克隆載體連接后的測序結果與正常SNCA基因圖譜比對結果

圖4 突變型SNCA與正?；蛐蛄斜容^：A30P突變型的序列88位堿基由正常的G變?yōu)镃，A53T突變型的序列157位堿基由G變?yōu)锳

1：Marker；2-8表示不同的菌落樣本 圖5 SNCA與真核表達載體連接后酶切產物電泳圖

Rt-PCR法檢測SNCAmRNA水平，結果顯示，四種細胞均可見大小100 bp左右、亮度相近的β-actin條帶，WT及A30P、A53T突變型細胞擴增后均出現(xiàn)大小為480 bp左右的條帶，空載體轉染過的細胞也有相同大小條帶出現(xiàn)，但亮度很低(圖8)。

3 討論

脂質體轉染法和病毒介導的轉染法是目前常用的細胞轉染技術?，F(xiàn)有眾多的文獻報道均認為，脂質體本身會參與細胞生理活動,引起基因表達的上調或下調，如參與蛋白激酶C(PKC)通路調節(jié)、抑制ATP酶的活性[14]等；自噬通路的抑制被認為是PD發(fā)病的主要因素，而脂質體轉染過程中的血清剝奪會對自噬產生顯著的影響，這些會對相關研究結果產生嚴重干擾，甚至影響研究結論。病毒載體轉染因其轉染效率高目前也應用較多，常用的病毒載體有腺病毒、γ-逆轉錄病毒和慢病毒，其中慢病毒應用最為廣泛。慢病毒是一種復雜的逆轉錄病毒，病毒顆粒中含有線性的單鏈RNA基因組的同型二聚體，其與γ-逆轉錄病毒相似，可以將目的基因穩(wěn)定插入宿主染色體中，使目的基因持續(xù)表達，與逆轉錄不同的是，慢病毒可以轉染分裂期和非分裂期的細胞并可以保持目的基因長期表達；且載體轉染后沒有病毒蛋白的表達，不產生任何有效的細胞免疫應答，對宿主沒有毒性，因此，慢病毒轉染具有更為廣闊的應用前景。因為SH-SY5Y能過表達標志性多巴胺β-羥化酶和酪氨酸羥化酶活性，具有許多神經元的生化和功能特征，常常被用來做PD細胞模型用來研究PD的發(fā)病機制，所以本文選擇SH-SY5Y作為轉染的對象。

A：對照組(未進行慢病毒轉染的正常細胞)；B：空載體轉染組；C：WT轉染組(載體與SNCA重組后轉染組)；D：A30P突變型轉染組(載體與A30P突變型SNCA重組后轉染組)；E：A53T突變型轉染組(載體與A53T突變型SNCA重組后轉染組) 圖6 各組細胞熒光蛋白表達比較(倒置熒光纖維鏡×250)

Venus：空載體轉染組；WT：載體與A30P突變型SNCA重組后轉染組；A30P：載體與A30P突變型SNCA重組后轉染組；A53T：載體與A53T突變型SNCA重組后轉染組；α-synuclein：α-突觸核蛋白 圖7 各組α-突觸核蛋白表達比較(免疫印跡法)

Venus：空載體轉染組；WT：載體與A30P突變型SNCA重組后轉染組；A30P：載體與A30P突變型SNCA重組后轉染組；A53T：載體與A53T突變型SNCA重重組后轉染組；α-synuclein：α-突觸核蛋白 圖8 各組SNCA mRNA表達水平比較(Rt-PCR法)

本實驗中使用的真核表達載體pLentiVENUS-YFP是一個大小為7927 bp的環(huán)形DNA分子，包含有一段核糖體IRES，它可翻譯一條mRNA上的兩個開放讀框，由其連接的兩個基因的表達率相同，前后的兩個基因分別為熒光蛋白和SNCA所取代，因此可以通過測定熒光蛋白的表達來檢測SNCA的表達。只要有表達載體轉染就會有熒光蛋白的表達(圖6)。但是在空載體與目的基因轉染組都有熒光蛋白的表達，二者之間單純通過熒光顯微鏡不能區(qū)分，還需進一步區(qū)分。因此，本研究利用PCR技術進行mRNA水平的檢測，在內參表達量相同的情況下，空載體與目的基因轉染組都能擴增出大小為480 bp左右的條帶，但是與目的基因轉染組相比，空載體轉染組條帶亮度很低，所以空載體轉染組轉錄的mRNA水平較低(圖8)。由于不能保證所有mRNA都會編碼蛋白，故本實驗中還利用蛋白免疫印跡方法在蛋白水平上進行檢測，結果同樣表明轉染目的基因的細胞，不論是WT還是突變型α-突觸核蛋白(A30P、A53T)水平都較空載體表達率高(圖7)?？梢姡员緦嶒灚@得的SH-SY5Y細胞株是過表達α-突觸核蛋白的細胞株，從蛋白的轉錄與翻譯水平均可表明，結果準確可靠。SNCA的突變是第一個被確認的引起PD的遺傳因素，SNCA所編碼的蛋白α-突觸核蛋白是含140個氨基酸的蛋白質。這種蛋白在1988年首次被Maroteaux等[5]描述為分布在突觸前神經末梢和核內的特異性神經元蛋白，并因此命名為突觸核蛋白。α-突觸核蛋白受到廣泛關注始于1997年發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的一個基因突變與家族早發(fā)性PD相關[2]。LB中檢測到α-突觸核蛋白也進一步支持這種蛋白在PD和路易體癡呆這些突觸蛋白病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。盡管α-突觸核蛋白與PD密切相關，但是α-突觸核蛋白與黑質紋狀體多巴胺能神經元的退變、LB的形成等病理生理機制還不是很清楚。許多證據(jù)表明，α-突觸核蛋白在神經遞質的釋放方面有重要作用[6]。α-突觸核蛋白的過表達對神經元有毒性作用，包括促進氧化應激[7-8]、蛋白聚集[9-10]和線粒體功能紊亂[11-12]，不管是野生型還是突變型過表達的α-突觸核蛋白都會引起神經元的功能缺失和退變[6,13]。過表達α-突觸核蛋白的轉基因果蠅和轉基因小鼠都會出現(xiàn)PD癥狀，當SNCA敲除小鼠α-突觸核蛋白缺乏時會出現(xiàn)線粒體毒素引起的細胞毒性抵抗[15-16]。以上研究的前提是有可靠的實驗模型，所以本文通過分子克隆技術和慢病毒轉染技術成功建立過表達α-突觸核蛋白的WT及A53T、A30P突變型SH-SY5Y單克隆細胞株，可能為進一步研究α-突觸核蛋白的作用提供可靠的細胞實驗模型。

綜上可見，本研究對SNCA重組真核表達載體的構建和過表達人野生型及致病突變A30P、A53Ta-synuclein單克隆SH-SY5Y細胞株的建立，為建立更加合理高效的PD細胞模型提供了實驗方法，為今后探討α-突觸核蛋白在多巴胺能神經細胞變性壞死中的作用、PD的發(fā)病機制以及臨床治療的靶點奠定了一定實驗基礎。

[1]Chen X, de Silva HA, Pettenati MJ, et al. The human NACP/alpha-synuclein gene: chromosome assignment to 4q21.3-q22 and TaqI RFLP analysis[J]. Genomics,1995,26(2):425-427.

[2]Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease[J]. Science,1997,276(5321):2045-2047.

[3]Shults CW. Lewy bodies[J]. Proc Nael Acad of Sci U S A,2006,103(6):1661-1668.

[4]Choong CJ, Say YH. Neuroprotection of alpha-synuclein under acute and chronic rotenone and maneb treatment is abolished by its familial Parkinson’s disease mutations A30P, A53T and E46K[J]. Neurotoxicology,2011,32(6):857-863.

[5]Maroteaux L, Campanelli JT, Scheller RH. Synuclein: a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal[J]. J Neurosci,1988,8(8):2804-2815.

[6]Nemani VM, Lu W, Berge V, et al. Increased expression of alpha-synuclein reduces neurotransmitter release by inhibiting synaptic vesicle reclustering after endocytosis[J]. Neuron,2010,65(1):66-79.

[7]Chan T, Chow AM, Cheng XR, et al. Oxidative stress effect of dopamine on alpha-synuclein: electroanalysis of solvent interactions[J]. ACS Chem Neurosci,2012,3(7):569-574.

[8]Siddiqui A, Chinta SJ, Mallajosyula JK, et al. Selective binding of nuclear alpha-synuclein to the PGC1alpha promoter under conditions of oxidative stress may contribute to losses in mitochondrial function: implications for Parkinson’s disease[J]. Free Radic Biol Med,2012,53(4):993-1003.

[9]Lastres-Becker I, Ulusoy A, Innamorato NG, et al. alpha-Synuclein expression and Nrf2 deficiency cooperate to aggravate protein aggregation, neuronal death and inflammation in early-stage Parkinson’s disease[J]. Hum mol Genet,2012,21(14):3173-3192.

[10]Wu J, Lou H, Alerte TN, et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo[J]. Neuroscience,2012,207:288-297.

[11]Devi L, Anandatheerthavarada HK. Mitochondrial trafficking of APP and alpha synuclein: Relevance to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases[J]. Biochim Biophys Acta,2010,1802(1):11-19.

[12]Wu F, Poon WS, Lu G, et al. Alpha-synuclein knockdown attenuates MPP+induced mitochondrial dysfunction of SH-SY5Y cells[J]. Brain Res,2009,1292:173-179.

[13]Burre J, Sharma M, Tsetsenis T, et al. Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro[J]. Science,2010,329(5999):1663-1667.

[14]Chesselet MF. In vivo alpha-synuclein overexpression in rodents: a useful model of Parkinson’s disease?[J]. Exp Neurol,2008,209(1):22-27.

[15]Irvine GB, El-Agnaf OM, Shankar GM, et al. Protein aggregation in the brain: the molecular basis for Alzheimer’s and Parkinson’s diseases[J]. Mol Med,2008,14(7-8):451-464.

[16]Datiles MJ, Johnson EA, McCarty RE. Inhibition of the ATPase activity of the catalytic portion of ATP synthases by cationic amphiphiles[J]. Biochim Biophys Acta,2008,1777(4):362-368.

(本文編輯：鄒晨雙)

Establishment of monoclonal SH-SY5Y cell lines overexpressing WT,mutation A30P and A53T α-synuclein

*DONGWeiling,FANGQi*,ZHANGXiuyan,ZHAOYun,SHANLidong#,HUIGuozhen△.

#DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu,215006,China;△NeurobiologyDepartmentofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu, 215123,ChinaCyrusTangHematologyCenterofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu,215123,China.

Corresponding author：SHAN Lidong，Email：danlidong@suda.edu.cn；HUI Guozhen，Email: guozhen-hui@163.com

*These authors contributed equally to the work.

Objective To establish recombinant eukaryotic expression vector pLentiVENUS-YFP-SNCAincluding Wild-type(WT) and A30P(G88C),A53T(G157A)α-synuclein gene(SNCA)and monoclonal SH-SY5Y cell lines overexpressing WT, mutation A30P and A53T α-synuclein by molecular cloning techniques and lentivirus infection method. Methods SH-SY5Y cells overexpressing WT α-synuclein was generated, RNA extracted from k562 cells was reversely transcribed with reverse transcriptase into cDNA, and PCR was used to amplify humanSNCA. The gene was sequenced after T-A clone(in vitro ligation of SNCA and cloning vector PMD-19T) and then the right one was digested by restriction endonuclease. The right sequence was ligated into the eukaryotic expression vector pLentiVENUS-YFP. WT recombinant eukaryotic expression vector was established. The familial PD-linked A53T and A30P mutation were generated by site-directed gene mutagenesis using primer difference in mononucleotide on the base of WTSNCA. We confirmed the orientation and sequence of each construction by restriction analysis and sequencing. We obtained the lentiviral vector containing the recombinant eukaryotic expression vector of pLentiVENUS-YFP-SNCAby calcium phosphate precipitate method in 293T cells. Then these lentiviral vectors infected SH-SY5Y cells, and then positive cells were sorted by BD AriaⅢ. Finally, the expression levels of α-synuclein were assessed by inverted fluorescence microscope, protein immunoblot，and RT-PCR. Results The results of PCR and gene sequence detection shown that we obtained objective gene. The recombinant eukaryotic expression vector pLentiVENUS-SNCAwere built, and checked by restriction enzyme digestion and sequencing. Inverted fluorescence microscope showed that cells expressed fluorescence protein except nontransfected cells, which indicated plasmids expressed. The result of protein immunoblot and RT-PCR proved that the protein content and RNA expression level were higher in the cells transfected with SNCA than the empty vector group. Conclusions We successfully establish the monoclonal SH-SY5Y cell lines overexpressing WT, mutation A30P and A53T α-synuclein by molecular cloning techniques and lentiviral vector infection.

α-synuclein; eukaryotic expression vector pLentiVENUS-SNCA; monoclonal SH-SY5Y cell lines

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.006

蘇州市科技計劃項目基金(基金編號：SYS201103)

215006蘇州大學附屬第一醫(yī)院神經內科(東惟玲、方琪*、惠國楨)；215123蘇州大學醫(yī)學部神經生物學教研室(東惟玲、單立冬)；215123唐仲英血液病學研究中心(張秀艷、趙昀)

單立冬，Email：danlidong@suda.edu.cn；惠國楨，Email：guozhen-hui@163.com

R742.5

A

1006-2963(2016)06-0408-07

2014-11-13)

*與第一作者工作同等重要