無糖基化修飾GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表達、純化

喬曉芳， 王春艷， 顧寶華 ， 田慶南1,

(1.鄭州大學 藥學院 河南 鄭州 450001; 2.安陽市城鄉(xiāng)一體化示范區(qū)食品藥品監(jiān)督管理中心 河南 安陽 455000； 3.鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

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無糖基化修飾GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表達、純化

喬曉芳1,2， 王春艷3， 顧寶華3， 田慶南1,3

(1.鄭州大學 藥學院 河南 鄭州 450001; 2.安陽市城鄉(xiāng)一體化示范區(qū)食品藥品監(jiān)督管理中心 河南 安陽 455000； 3.鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種腸促胰島素激素，具有很好的綜合降糖效果，但其在血漿中的半衰期只有短暫幾分鐘,限制了GLP-1在臨床方面的應用.為延長GLP-1的半衰期，合成了GLP-1-Fc融合基因，將N-糖基化作用的受體天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔瑯?gòu)建了無糖基化修飾的GLP-1-Fc(N126A)融合表達載體，利用酵母表達系統(tǒng)成功表達了GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白，并利用rProteinA獲得了高純度融合蛋白.

胰高血糖素樣肽-1； Fc融合蛋白； 酵母表達

0 引言

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptid-1, GLP-1)是由直腸、結(jié)腸和遠端回腸的L細胞分泌、由前胰升血糖素衍生的一種多肽激素[1].GLP-1的腸促胰島素作用依賴于血漿中的葡萄糖濃度，在高血糖的情況下，可促進胰島素的分泌.因此，GLP-1在II 型糖尿病的治療中具有重要的價值[2].但是，GLP-1在血漿中極易被降解，半衰期較短，僅有3～5 min[3-4]，嚴重限制了GLP-1在臨床方面的應用.因此，利用基因工程的方法構(gòu)建能延長GLP-1半衰期的GLP-1類似物是解決這一問題的良好方法.本研究將GLP-1與Fc片段融合，以延長GLP-1的半衰期[5-6].

目前，人們常用的蛋白表達系統(tǒng)有大腸桿菌表達系統(tǒng)、哺乳動物表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng).酵母菌表達系統(tǒng)作為真核表達系統(tǒng)，具備了原核生物快速繁殖、易于培養(yǎng)的特點，同時能夠分泌表達，完成蛋白質(zhì)修飾[7-8].但是，在酵母表達修飾系統(tǒng)中，糖基化修飾能引起免疫原性，降低半衰期，因此如何利用酵母表達系統(tǒng)獲得無糖基化的融合蛋白是進一步優(yōu)化GLP-1表達的難點.

本研究通過構(gòu)建GLP-Fc融合表達載體，利用畢赤酵母GS115表達系統(tǒng)，獲得了GLP-Fc融合表達蛋白，并通過突變N-糖基化位點N126,進一步獲得無糖基化修飾融合蛋白，為獲得半衰期長、免疫原性低、生產(chǎn)成本低的GLP-1融合蛋白提供了一種有效途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:PPIC3.5k質(zhì)粒、大腸桿菌XL-10、畢赤酵母GS115、GS115-DT-6，均由本實驗室提供和保存.

1.2 試劑

rTaq酶、25 mmol/L dNTPs、T4 DNA連接酶、DL2000DNA分子量marker、DL5000DNA分子量marker；限制性內(nèi)切酶(NotI、BamHI)為NEB公司產(chǎn)品；pfuDNA聚合酶購自上海生工公司；GoldView TM核酸染料購自Biorule；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物有限公司；無縫克隆試劑盒購自上海近岸科技有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建 GLP-1-Fc基因由上海生工生物工程有限公司合成，在基因的5’端添加XhoI的酶切位點，3’端添加TAA終止密碼子和NotI酶切位點.利用重疊延伸PCR，構(gòu)建aF-GLP-1-Fc基因片段.分別利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切pPIC3.5k質(zhì)粒及目的基因，并進行純化回收.經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10，經(jīng)菌落PCR驗證后，抽提質(zhì)粒進行基因測序.

1.3.2 GLP-1-Fc(N126A)的構(gòu)建 突變體表達載體構(gòu)建主要采用QuikChange 定點突變技術(shù).以Ala的密碼子序列為中心、設計上下游引物.對合成引物進行磷酸化，利用磷酸化后引物進行QuikChange PCR，經(jīng)DpnI 酶切后轉(zhuǎn)化XL-10.挑選菌落進行菌落PCR驗證，并提取質(zhì)粒進行序列分析.

1.3.3 GLP-1-Fc(N126A)的表達SaCI單酶切重組質(zhì)粒pPIC3.5k-aF-GLP-1-Fc，對質(zhì)粒進行線性化.利用乙醇沉淀法純化線性化后的質(zhì)粒.通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，經(jīng)菌落PCR驗證后，挑取陽性菌落接種于BMGY培養(yǎng)液中220 rpm、29 ℃培養(yǎng)約24 h.24 h培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至其終濃度為0.5%，開始蛋白的誘導表達.加入濃度為0.5%的甲醇誘導6 d.取樣的菌液按照12 000 rpm離心10 mim后,將上清和沉淀分開，保存至-20 ℃冰箱中.

1.3.4 GLP-1-Fc(N126A)的分離純化 HiTrap rProtein A FF預裝柱及KTAprimeTMPLUS蛋白純化系統(tǒng)對融合蛋白進行親和層析.結(jié)合緩沖液采用20 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)緩沖液，洗脫液采用0.1 mol/L檸檬酸鈉(pH 3.0)緩沖液.

1.3.5 Western blot檢測目的蛋白 將純化獲得的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，待電泳結(jié)束后，取出凝膠，參照蛋白marker，切下目的蛋白應在部分，做好標記后放在1×電轉(zhuǎn)液中浸泡5 min.經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，按1∶8 000用封閉液稀釋羊抗人IgG Fc(HRP)抗體，將NC膜轉(zhuǎn)入其中，放在脫色搖床上室溫孵育2 h.將NC膜取出洗膜30 min后，在暗室內(nèi)，按照ECL試劑盒說明書取A液與B液各1 mL在EP管中充分混勻后，均勻加到NC膜上，孵育1.5 min，曝光并保存圖片.

2 結(jié)果

2.1 aF-GLP-1-Fc表達載體的構(gòu)建、鑒定

提取含有已經(jīng)優(yōu)化過的信號肽的酵母基因組，PCR獲得信號肽aF，并對PCR產(chǎn)物進行純化，純化的DNA片段大小為288 bp；目的基因GLP-1-Fc由生工生物公司合成，基因大小為914 bp.通過重疊延伸PCR的方法構(gòu)建目的基因aF- GLP-1-Fc，片段大小為1 202 bp.利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切pPIC3.5k質(zhì)粒及目的基因片段，并通過T4連接酶將目的基因連入表達載體.重組質(zhì)粒利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切鑒定(如圖1)，大小正確，同時，DNA測序結(jié)果分析讀碼框正確、未發(fā)生移碼.

2.2 GLP-1-Fc(N126A)的構(gòu)建

N-糖基化的第一步是將14C的核心寡聚糖添加到新形成的多肽鏈的天冬酰胺受體上，其特征氨基酸的序列為Asn-X-Ser/Thr.通過分析GLP-1-Fc序列，第126位天冬氨酸為融合蛋白N-糖基化位點.因此，本研究為獲取無糖基化修飾蛋白，構(gòu)建了GLP-1-Fc(N126A)突變體(如圖2).突變體構(gòu)建采用QuikChange 定點突變技術(shù)，引物磷酸化后，通過QuikChange PCR，轉(zhuǎn)化XL-10，經(jīng)酶切驗證、測序分析后挑取陽性克隆進行后續(xù)培養(yǎng)、蛋白純化.

M：DL5000；1～2：提取的陽性質(zhì)粒

圖1 af-GLP-1-Fc重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
Fig.1 The double digests analysis of af-GLP-1-Fc construction

A：QuikChange PCR；B：aF-GLP-1-Fc與aF-GLP-1-Fc(N126A)序列比對

2.3 GLP-1-Fc(N126A)的誘導表達

將含有GLP-1-Fc(N126A)表達載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母.以BMGY作為培養(yǎng)液經(jīng)甲醇誘導6天后取上清，SDS-PAGE檢測，30～40 kD處含有誘導蛋白表達條帶(如圖3).為了進一步確認融合蛋白的表達，利用抗Fc抗體對上清液進行Western blot實驗檢測，ECL顯色進一步確認表達蛋白中含有Fc片段(如圖4).

圖3 SDS-PAGE電泳檢測GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表達Fig.3 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

圖4 Western blot檢測GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表達Fig.4 Western blot analysis of the GLP-1-Fc(N126A) fusion protein expression

2.4 GLP-1-Fc(N126A)的表達和純化

rProtein A親和層析柱能夠特異結(jié)合Fc片段蛋白，如圖5所示，利用rProtein A親和層析柱進行一次純化即可獲得單一的洗脫峰(473.5 mL).將洗脫峰進行SDS-PAGE檢測，GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白純度為80%(如圖6).

圖5 rProtein A親和層析純化GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白色譜圖 Fig.5 Affinity chromatography of GLP-1-Fc(N126A)with rProtin A

圖6 SDS-PAGE檢測GLP-1-Fc(N126A)的純化結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

3 討論

近幾年，II型糖尿病發(fā)病率急劇提高，醫(yī)學及分子生物學領(lǐng)域越來越關(guān)注II型糖尿病的治療，使其成為科研工作者研究的熱點問題.GLP-1具有促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素合成、減退食欲、減少食物吸收等作用，在降血糖的同時還可以降低體重、副作用不明顯，所以其在治療II型糖尿病方面存在巨大潛力[9-11].

本研究將GLP-1與人的Ig4蛋白基因進行融合，并構(gòu)建酵母表達載體(如圖1所示)，通過增加融合蛋白的分子量，降低腎臟清除融合蛋白的速率，并利用Fc的循環(huán)受體(ecycling receptors，F(xiàn)cRn)使得重組蛋白能循環(huán)利用，進一步延長重組蛋白在血漿中的作用，從而延長融合蛋白的半衰期.美國FDA已經(jīng)批準上市的融合蛋白GLP-1-Fc采用細胞表達系統(tǒng)，生產(chǎn)成本高，本研究選擇易于大規(guī)模培養(yǎng)、能夠進行分泌表達的畢赤酵母作為表達系統(tǒng)，首先從發(fā)酵條件上極大程度減少了生產(chǎn)成本.此外，酵母表達系統(tǒng)存在糖基化修飾，容易表達糖蛋白進而縮短半衰期、增加免疫原性[12-13]，通過對融合蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，GLP-1-Fc僅存在N126一個N-糖基化位點.為減少糖基化修飾的影響，本研究進一步將N126位點天冬氨酸成突變?yōu)榱吮彼?如圖2所示)，通過改變N-糖基化的特征序列避免N-糖基化的形成，進一步減少了免疫原性.融合蛋白在酵母中經(jīng)甲醇誘導6天后在發(fā)酵上清中存在顯著過表達條帶(如圖3所示)，表明融合蛋白胞外表達成功，簡化了胞內(nèi)表達蛋白純化所需步驟.發(fā)酵上清在液相色譜經(jīng)ProteinA純化中僅出現(xiàn)單一峰，僅經(jīng)一步純化即可獲得高純度產(chǎn)物(如圖5、6)，所需純化工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn).綜上所述，本研究從表達和純化兩方面減少了GLP-1-Fc生產(chǎn)成本，為國內(nèi)GLP-1的新藥研發(fā)打下了基礎(chǔ).

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(責任編輯：王浩毅)

Expression and Purification of Non-glycosylated Glp-1-Fc(N126A)
Fusion Protein in Yeast Expression System

QIAO Xiaofang1,2， WANG Chunyan3, GU Baohua3， TIAN Qingnan1,3

(1.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.CenterofAnyangHigh-
TechZoneFoodandDrugAdministration,Anyang455000,China; 3.SchoolofLifeScience,Zhengzhou
University,Zhengzhou450001,China)

Glucagon-like peptide-1(GLP-1) is a kind of ducdenin, which has good and comprehensive hypoglycemic effect.The GLP-1 was easy to be degraded in plasma. To prolong the half-life of GLP-1, the GLP-1-Fc(N126A) was constructed through mutant N-glycosylation asparagine receptor into alanine. The GLP-1-Fc(N126A) fusion protein was obtained by yest expression system, and was purified by rProteinA.

glucagon-like peptide-1(GLP-1); Fc fusion protein; yeast expression

2016-09-27

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31601867)；中國博士后基金特別資助項目(2016T90674)．

喬曉芳(1977—)，女，河南安陽人，主管藥師，主要從事生物醫(yī)藥研究，E-mail:ayqiaoxiaofang@163.com；通訊作者：田慶南(1986—)，男，河南商丘人，講師，主要從事生物醫(yī)藥研究，E-mail:tqn127@163.com．

喬曉芳，顧寶華，田慶南.無糖基化修飾GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表達、純化[J] ．鄭州大學學報(理學版)，2016，48(4)：86-89．

Q784;Q786;Q789

A

1671-6841(2016)04-0086-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2016697