基于微流控技術(shù)的微生物細(xì)胞梯度稀釋分離方法

徐 娟， 藍(lán) 英， 潘迎捷,2,3， 趙 勇,2,3， 張煒佳,2,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

基于微流控技術(shù)的微生物細(xì)胞梯度稀釋分離方法

徐 娟1， 藍(lán) 英1， 潘迎捷1,2,3， 趙 勇1,2,3， 張煒佳1,2,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

隨著微流控分析技術(shù)的快速發(fā)展，集成化的微流控芯片在滿足實(shí)驗(yàn)高通量的同時(shí)，還在微生物細(xì)胞分離領(lǐng)域呈現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究基于微流控技術(shù)，制備了以聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻片為材料的細(xì)菌細(xì)胞梯度稀釋分離芯片。該芯片的核心是通過(guò)一系列復(fù)雜的梯度網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌懸液的連續(xù)稀釋，最終被分離的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入通道末端的存儲(chǔ)孔內(nèi)。結(jié)果顯示，該方法能分離出的最少細(xì)菌細(xì)胞數(shù)低于10個(gè)。此芯片平臺(tái)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低，為微生物單細(xì)胞研究提供了新的途徑。

微流控芯片；微生物細(xì)胞分離；連續(xù)梯度稀釋

傳統(tǒng)微生物研究常以微生物群為分析對(duì)象，其所得到的群體平均信息往往掩蓋了微生物細(xì)胞之間的差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差[1]。微生物單細(xì)胞分析(single-cell analysis)突破了以往診斷技術(shù)的瓶頸，可以研究微生物群中單個(gè)細(xì)胞獨(dú)特的功能和狀態(tài)，深入解析微生物細(xì)胞間的異質(zhì)性、相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)以及生理病理等運(yùn)作機(jī)制[2]。從單個(gè)細(xì)胞入手闡明細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)[3-5]、耐藥性[6-8]、趨化性[9]、運(yùn)動(dòng)行為[10]、群感效應(yīng)[11]、被膜形成[12]以及進(jìn)化[13]等生命活動(dòng)的規(guī)律，成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)之一。以微機(jī)電加工發(fā)展起來(lái)的微流控技術(shù)，因集成度高、微型化、高通量等優(yōu)勢(shì)在微生物細(xì)胞分離研究領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用潛力[14]。目前，微流體細(xì)胞分離設(shè)備主要分為液滴式微流控和芯片式微流控兩大類。這兩種裝置有很大差異，但它們的共性是將微生物細(xì)胞分離到微升(μL)或納升(nL)級(jí)的反應(yīng)室中，以此實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞分離，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)成本[15]。芯片式微流控具有與微生物細(xì)胞大小相匹配的通道尺寸(1～100 μm)，通過(guò)靈活的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和精確的流路控制，在微生物細(xì)胞的定向操縱和微環(huán)境調(diào)控中呈現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[16]。Probst等[17]利用流體力學(xué)原理，在芯片入口注入氣泡，使通道中液流流經(jīng)氣泡時(shí)由原本的層流狀態(tài)變?yōu)閷?duì)流。借助液流流向改變，成功將谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)截留在皮升級(jí)的微孔中，達(dá)到單個(gè)細(xì)菌接種的目的。通過(guò)凝膠包埋的方式，Choi等[18]將金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和腸球菌(Enterococci)固定在芯片瓊脂糖通道內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌單細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)時(shí)觀察和藥敏檢測(cè)。液滴式微流控由傳統(tǒng)的單相微流控芯片技術(shù)發(fā)展而來(lái)，可以將微生物細(xì)胞封裝入液滴而不受外界條件的干擾，是良好的單細(xì)胞分離及反應(yīng)設(shè)備[19-20]。Leung等[21]設(shè)計(jì)了一種編程式液滴芯片，該芯片由底部的蠕動(dòng)泵和頂部的陣列液滴反應(yīng)孔組成，每個(gè)微液滴包裹一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，單次實(shí)驗(yàn)即可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)菌單細(xì)胞的培養(yǎng)。以上實(shí)驗(yàn)多需要微通道內(nèi)的流體模擬、灌注凝膠和制備液滴等，與之相比，微流控濃度梯度芯片可以利用多層次的分流匯流將樣品溶液快速稀釋，具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷等特點(diǎn)，為微生物細(xì)胞分離提供了新的方法[22]。徐艇[23]發(fā)明了一種微流控型人源細(xì)胞分離器，該裝置主要包括底座、斜面活動(dòng)盤以及樹(shù)狀微流道。細(xì)胞懸浮液在斜面活動(dòng)盤的樹(shù)狀微流道及重力作用下，實(shí)現(xiàn)分流分離。本研究根據(jù)上述連續(xù)梯度稀釋網(wǎng)絡(luò)的芯片設(shè)計(jì)及其在細(xì)胞分離研究中的應(yīng)用，制備了一種針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞分離的圣誕樹(shù)型微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌單細(xì)胞水平的分離。該芯片的核心是借助一系列復(fù)雜的梯度網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌懸液的連續(xù)稀釋。此外，以更小尺寸的連接通道將主稀釋通道和細(xì)菌存儲(chǔ)孔相連的構(gòu)型及入口角度的設(shè)計(jì)，使少量細(xì)菌細(xì)胞隨液流方向改變進(jìn)入存儲(chǔ)孔中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該芯片性能良好，可對(duì)106數(shù)量的細(xì)菌細(xì)胞有效分流分離，為所需微生物細(xì)胞數(shù)目小或需從大量微生物細(xì)胞中分離出少量細(xì)胞的分析研究提供了新的角度，也拓展了微流控濃度梯度芯片在微生物細(xì)胞分離領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株VibrioparahaemolyticusATCC33847購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 材料與試劑 多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；SU-8膠(SU-8 2025,美國(guó)MicroChem公司)、Sylgard 184硅橡膠彈性體和Sylgard 184固化劑(美國(guó) Dow Corning公司)、單晶硅片(4英寸)購(gòu)自上海蒙昌儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器 URE-2000/35型光刻機(jī)(中科院光電技術(shù)研究所)；2XZ-2型真空泵(上?？崛鸨瞄y制造有限公司)；BPZ-6063LC型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KW-4A型臺(tái)式勻膠機(jī)、BP-2B型烘膠、WH-1000等離子表面處理機(jī)、LSP01-1A型微量注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；Eppendorf 離心機(jī)( 5810R，美國(guó) Eppendorf 公司)；Bio-Tek 酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；EVOS?FL Auto全自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)Life Technologies公司)； 美國(guó) Milli-Q去離子水儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離芯片的設(shè)計(jì)和制作 選用經(jīng)典的“圣誕樹(shù)”型梯度稀釋微流控芯片分離細(xì)菌單細(xì)胞[24]。如圖1所示，芯片流體層結(jié)構(gòu)主要由9級(jí)梯度形成網(wǎng)絡(luò)(Concentration Gradient Generator，CGG)和20個(gè)細(xì)菌存儲(chǔ)孔組成。流體層通道高20 μm，寬50 μm，梯度網(wǎng)絡(luò)的每個(gè)蛇形通道單元長(zhǎng)5.776 mm，細(xì)菌存儲(chǔ)孔的截面為直徑96 μm的圓形結(jié)構(gòu)。為減少流體通道中液流剪切力對(duì)存儲(chǔ)孔中細(xì)菌的損傷，并使細(xì)菌能夠固定在存儲(chǔ)孔中穩(wěn)定生長(zhǎng)，存儲(chǔ)孔排列在流體通道的一側(cè)。存儲(chǔ)孔以尺寸更小的連接通道(上端23 μm，下端15 μm)與蛇形通道下端的垂直通道相連。連接通道入口設(shè)定一定角度，使少量細(xì)菌細(xì)胞隨液流方向改變進(jìn)入存儲(chǔ)孔中。芯片采用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)(soft-lithography)及模塑法制作[25]。

圖1 細(xì)菌細(xì)胞分離芯片設(shè)計(jì)圖Fig.1 Design of the bacteria cell separation chipA：梯度網(wǎng)絡(luò)蛇形通道的放大結(jié)構(gòu)；b：細(xì)菌細(xì)胞存儲(chǔ)孔的放大結(jié)構(gòu)A：Magnification of the serpentine channel of the gradient generator；b：Magnification of the bacteria cell storage well

1.2.2 細(xì)菌分離芯片的處理 將制備好的芯片于1×105Pa滅菌15 min，65 ℃烘干。使用前向芯片內(nèi)灌注10 μg/mL的多聚賴氨酸溶液(Poly-L-lysine, PLL)對(duì)芯片進(jìn)行包被，連續(xù)通入30 min后，將芯片放入培養(yǎng)皿內(nèi)待用[26]。

1.2.3 芯片上的細(xì)菌細(xì)胞分離 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的副溶血性弧菌(OD600=0.6)于10 mL離心管中，離心10 min (3 000 r/min，25 ℃)，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，調(diào)整菌懸液的濃度使其終濃度為5×106cfu/mL。把細(xì)菌懸液和新鮮培養(yǎng)液分別加入1 mL注射器內(nèi)，將注射器固定在注射泵上，以聚四氟乙烯管與芯片上相應(yīng)入口相連。設(shè)置進(jìn)樣速率為0.1 μL/min，進(jìn)樣1 h。改變進(jìn)樣速率，以低于接種速率10倍的流速在2個(gè)入口通入新鮮培養(yǎng)液，沖走通道中未黏附的細(xì)菌。其后，利用EVOS?FL Auto 顯微鏡的全自動(dòng)成像系統(tǒng)，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞分離結(jié)果進(jìn)行觀察及拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離芯片的制作與表面處理

本研究制備的雙層結(jié)構(gòu)細(xì)菌分離芯片由上層帶有流體通道的PDMS和下層適合細(xì)菌貼壁的玻片鍵合而成(圖2)。PDMS作為微流控技術(shù)中理想的使用材料之一，具有很多良好的特性，如熱穩(wěn)定性高、生物兼容性強(qiáng)、透氣透光性好，易于在顯微鏡下觀察等。盡管PDMS有諸多優(yōu)點(diǎn)，但未經(jīng)處理的芯片還不能直接用于細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用75%的酒精多次沖洗芯片通道，以清除芯片加工過(guò)程中殘留的灰塵粒子等雜質(zhì)；對(duì)芯片進(jìn)行高壓滅菌處理，可保證芯片內(nèi)沒(méi)有其他雜菌的污染。由于PDMS具有較強(qiáng)的疏水性，在向通道內(nèi)輸送培養(yǎng)液時(shí)容易產(chǎn)生氣泡，對(duì)細(xì)菌造成損傷。為此，需采用合適的包被試劑，如明膠、 多聚賴氨酸、 纖連蛋白和膠原等使PDMS表面的親水性增加，以保持液體在通道內(nèi)流動(dòng)的順暢[27]。

圖2 細(xì)菌細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig.2 The photograph of bacteria cell separation chip

2.2 梯度稀釋網(wǎng)絡(luò)形成能力的驗(yàn)證

在連續(xù)稀釋過(guò)程中，混合誤差由上一級(jí)到下一級(jí)逐級(jí)累加，因此充分混合是形成穩(wěn)定濃度梯度的前提條件。液體在微通道內(nèi)的流動(dòng)阻力是影響混合效果的主要因素。當(dāng)所有微通道截面形狀相同時(shí)，流阻便取決于蛇形管道的總長(zhǎng)度L。而增加2種溶液之間的接觸面可以提高分子擴(kuò)散，因此通道長(zhǎng)度越長(zhǎng)，分子擴(kuò)散越充分，混合效果越佳。此外，溶液流速小更利于混合[28]。根據(jù)以上理論分析，在本實(shí)驗(yàn)中梯度網(wǎng)絡(luò)蛇形通道長(zhǎng)度一定的情況下，則可通過(guò)調(diào)節(jié)進(jìn)樣流速來(lái)控制濃度梯度的形成。

圖3a為用紅藍(lán)指示劑對(duì)芯片梯度網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的定性表征。芯片的2個(gè)入口分別注入紅色指示劑和藍(lán)色指示劑，控制溶液流速為0.1 μL/min。在流體剪切力的作用和擴(kuò)散效應(yīng)下，2種溶液在蛇形通道內(nèi)逐級(jí)分配、混合，最終在芯片末端的垂直通道各自形成不同的顏色。采用Color Cop軟件拾取每行的顏色，拾取顏色的順序?yàn)閺淖蟮接遥涗浢啃兄蓄伾腞GB值，選取紅色分量(Red value)進(jìn)行定量分析。從圖3b每行的線性梯度曲線可知，紅藍(lán)指示劑從梯度網(wǎng)絡(luò)的上一級(jí)到下一級(jí)均充分混合，最終可產(chǎn)生10個(gè)具有一定線性的不同濃度，直觀地表明該芯片能用于后續(xù)的細(xì)菌細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)。

圖3 芯片梯度網(wǎng)絡(luò)形成能力的驗(yàn)證Fig.3 Validation of the gradient networkA：梯度網(wǎng)絡(luò)的紅藍(lán)指示劑表征;b:以紅色分量值為指標(biāo)的行2～行9的濃度梯度曲線A：Representation of the gradient network with red and blue dye;b:Concentration gradient curve based on red and blue value from line 2 to line 9

2.3 基于芯片的細(xì)菌細(xì)胞分離原理

該芯片平臺(tái)基于連續(xù)稀釋原理，即通過(guò)一系列連續(xù)簡(jiǎn)單的稀釋以減少細(xì)菌濃度，使菌液在多層次通道網(wǎng)絡(luò)作用下實(shí)現(xiàn)分流分離。如圖4所示，芯片的2個(gè)入口同時(shí)通入新鮮培養(yǎng)液和細(xì)菌懸液，兩者在梯度網(wǎng)絡(luò)中逐級(jí)分流、匯流混合，如此循環(huán)反復(fù)，最終細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入到皮升(pL)級(jí)的存儲(chǔ)孔中。此外，以更小尺寸的連接通道將主稀釋通道和細(xì)菌存儲(chǔ)孔相連的構(gòu)型及入口角度的設(shè)計(jì)，使少量細(xì)菌細(xì)胞隨液流方向改變進(jìn)入存儲(chǔ)孔中，以此達(dá)到分離的目的。

圖4 細(xì)菌細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig.4 The bacteria cell separation chip

a:細(xì)菌細(xì)胞分離芯片，結(jié)構(gòu)a1、a2分別對(duì)應(yīng)圖b、圖c;b:芯片2個(gè)入口同時(shí)通入培養(yǎng)液和細(xì)菌懸液，在連續(xù)稀釋的作用下形成圖c所示的細(xì)菌細(xì)胞分離效果

a：Schematic drawing of the chip channel geometry；b：Medium and bacteria cells were loaded from the two inlets，With the performance of gradient network, bacteria cells were separated by continuous dilution which showed in c

2.4 芯片上的細(xì)菌細(xì)胞分離

芯片通道內(nèi)空間狹窄，細(xì)菌接種前應(yīng)將菌液充分振蕩，以免細(xì)菌細(xì)胞成團(tuán)堵塞通道或在芯片內(nèi)分布不均。選擇低進(jìn)樣流速，易于細(xì)菌細(xì)胞在存儲(chǔ)孔內(nèi)停留并貼壁。由圖5可見(jiàn)，細(xì)菌細(xì)胞在芯片內(nèi)部均勻鋪展，少有抱團(tuán)?？?～孔5中，細(xì)菌細(xì)胞以隨機(jī)分布的形式在存儲(chǔ)孔中單層呈現(xiàn)。由于通道的高(20 μm)與細(xì)菌細(xì)胞的大小(2～3 μm)不在同一尺度，當(dāng)孔內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞逐漸增多時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞在有限的存儲(chǔ)空間會(huì)出現(xiàn)上下重疊的現(xiàn)象。故選取孔1～孔8作為分析對(duì)象。如圖6所示，該芯片平臺(tái)能夠分離出的最少細(xì)菌細(xì)胞數(shù)低于10個(gè)，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞的分流分離。然而，該方法僅是依賴于通道結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單分離，只針對(duì)某一類微生物細(xì)胞，不能對(duì)大小形狀相似的不同種細(xì)胞進(jìn)行精確分離。因此，采用更精密的加工技術(shù)，優(yōu)化通道設(shè)計(jì)是下一步的研究方向。

圖5 細(xì)菌細(xì)胞分離結(jié)果顯微觀察圖Fig.5 Phase contrast fields at 40× magnification of bacteria cell well

圖6 8個(gè)存儲(chǔ)孔內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)分析Fig.6 Bacterial cell number analysis in eight storage wells

3 討 論

基于微流控芯片技術(shù)，本研究設(shè)計(jì)并制作了一種微生物細(xì)胞分離芯片。該芯片借助一系列梯度網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌懸液的連續(xù)稀釋，可對(duì)106數(shù)量的細(xì)菌進(jìn)行有效分離，且能分離出的最少細(xì)菌細(xì)胞數(shù)低于10個(gè)。該方法操作簡(jiǎn)單、分離時(shí)間短、節(jié)約試劑、避開(kāi)了熒光標(biāo)記和復(fù)雜精細(xì)的檢測(cè)系統(tǒng)，為微生物單細(xì)胞研究提供了新的技術(shù)手段。此外，該芯片平臺(tái)還可以用來(lái)進(jìn)一步探索微生物單細(xì)胞水平上的生長(zhǎng)行為、運(yùn)動(dòng)特性以及藥物刺激等研究，具有一定的應(yīng)用前景。

[1] Sweedler J V,Arriaga E A.Single cell analysis[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 387(1): 1-2.

[2] Brehm-Stecher B F,Johnson E A.Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications [J]. Microbiology and molecular biology reviews,2004, 68(3): 538-559.

[3] Grünberger A,Paczia N,Probst C,et al.A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level [J]. Lab on a chip, 2012, 12(11): 2060-2068.

[4] Johnson-Chavarria E M,Agrawal U,Tanyeri M,et al.Automated single cell microbioreactor for monitoring intracellular dynamics and cell growth in free solution[J]. Lab on a Chip, 2014, 14(15): 2688-2697.

[5] Long Z,Nugent E,Taver A,et al.Microfluidic chemostat for measuring signle cell dynamics in bacteria[J]. Lab on a Chip, 2013,13(5):947-954.

[6] Gefen O, Gabay C, Mumcuoglu M, et al. Single-cell protein induction dynamics reveals a period of vulnerability to antibiotics in persister bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(16): 6145-6149.

[7] Jiang X, Kang Y, Pan X, et al. Studies of the drug resistance response of sensitive and drug-resistant strains in a microfluidic system[J]. Integrative Biology, 2014, 6(2): 143-151.

[8] J Deris J B,Kim M,Zhang Z,et al.The innate growth bistability and fitness landscapes of antibiotic-resistant bacteria[J]. Science, 2013, 342(6162): 1237435.

[9] Mao H,Cremer P S,Manson M D.A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(9): 5449-5454.

[10]Ziegler A, Schock-Kusch D, Bopp D, et al. Single Bacteria Movement Tracking by Online Microscopy-A Proof of Concept Study[J]. PloS one,2015, 10(4): e0122531.

[11]Boedicker J Q, Vincent M E, Ismagilov R F. Microfluidic Confinement of Single Cells of Bacteria in Small Volumes Initiates High-Density Behavior of Quorum Sensing and Growth and Reveals Its Variability[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2009, 48(32): 5908-5911.

[13]Davidson C J, Surette M G. Individuality in bacteria[J]. Annual review of genetics, 2008, 42: 253-268.

[14]Wu F, Dekker C. Nanofabricated structures and microfluidic devices for bacteria: from techniques to biology[J]. Chemical Society Reviews, 2015, 10.1039/c5cs00514k.

[15]劉成.單細(xì)胞捕捉技術(shù)[EB/OL].http://www.biodiscover.com/news/research/118230.html,2015-11-15.

[16]Shields IV C W, Reyes C D, López G P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation[J]. Lab on a Chip, 2015, 15(5): 1230-1249.

[17]Probst C, Grünberger A, Braun N, et al. Rapid inoculation of single bacteria into parallel picoliter fermentation chambers[J]. Analytical methods, 2015, 7(1): 91-98.

[18]Choi J, Jung Y G, Kim J, et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system[J]. Lab on a Chip, 2013, 13(2): 280-287.

[19]肖志良, 張博. 基于液滴技術(shù)的微流控芯片實(shí)驗(yàn)室及其應(yīng)用[J].色譜, 2011, 29(10): 949-956.

[20]張凱, 胡坪, 梁瓊麟, 等. 微流控芯片中微液滴的操控及其應(yīng)用[J].分析化學(xué), 2008, 36(4): 556-562.

[21]Leung K, Zahn H, Leaver T, et al. A programmable droplet-based microfluidic device applied to multiparameter analysis of single microbes and microbial communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(20): 7665-7670.

[22]Jeon N L, Dertinger S K W, Chiu D T, et al. Generation of solution and surface gradients using microfluidic systems[J]. Langmuir, 2000, 16(22): 8311-8316.

[23]徐艇. 微流控型單細(xì)胞分離器: CN, 104152345A. 2014-11-19.

[24]Berthier E,Beebe D.Gradient generation platforms:new directions for an established microfluidic technology[J]. Lab on a Chip, 2014,14(17):3241-3247.

[25]Shao JB, Wu L, Jin QH, et al. Fabrication and application of a novel cell culture microchip[J]. Chin J Biotech, 2008,24(7): 1253-1257.

[26]李瑞, 徐建棟, 鄧玉林. 微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其應(yīng)用[J]. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程, 2013, 26(4):338-342.

[27]林曉梅, 張銘. PDMS微流控芯片加工技術(shù)研究[J]. 長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 2013, 34(2):172-179.

[28]丁喜平. 用于藥物篩選的垂直灌流式多層細(xì)胞培養(yǎng)器件[D]. 大連：大連理工大學(xué), 2010.

A Microfluidic Gradient-Dilution Chip for Rapid Microbe Cell Separation

XU Juan1, LAN Ying1, PAN Ying-jie1, 2, 3, ZHAO Yong1, 2, 3, ZHANG Wei-jia1, 2, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAqua-Prod.Process. &Preserv'n,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm'tforAqua-Prod.onStor. &Preserv'n(Shanghai),Minist.ofAgric.Shanghai201306)

Along with the rapid advances in microfluidic technology, the integrated microfluidic chip has the potential to meet the demand of high-throughput experimentations in lab and especially presents the special superiority in the field of microbe cells separation. Based on the microfluidic technology, a polydimethoxysilane (PDMS)-glass microchip was prepared in this study which contains a network of gradient-forming channels for bacteria cells separation. The core of the microchip is to realize a successive dilution process by means of a series of complicated gradient network and finally the isolated bacteria cells entered to the end of the channel. The results showed that the number of separated bacteria cells by this method could be separated at minimum of less than ten. This chip platform is simple to operate, short time consuming, and low cost, which provide a new pathway to study microbe single-cell.

microfluidic chip; microbe cells separation; successive gradient dilution

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501555)；上海市科委項(xiàng)目(14DZ1205100,14320502100)；浦江人才計(jì)劃項(xiàng)目(14PJ1404300)；

徐娟 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⒘骺匚⑸锓治鲂酒?。E-mail: yuansuwawaxj@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士。研究方向?yàn)槲⒘骺厣锘瘜W(xué)分析芯片。E-mail: wj-zhang@shou.edu.cn

2015-11-25；

2015-12-04

Q-31

B

1005-7021(2016)05-0097-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.017

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字2015第4-8號(hào))