獼猴桃細菌性潰瘍病生防菌的篩選、鑒定及其防效初探

朱海云， 馬 瑜， 柯 楊， 李 勃， 孫 超

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

獼猴桃細菌性潰瘍病生防菌的篩選、鑒定及其防效初探

朱海云， 馬 瑜*， 柯 楊， 李 勃， 孫 超

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

從健康獼猴桃植株中篩選具有生防潛力的內(nèi)生放線菌，為獼猴桃細菌性潰瘍病防治提供材料。采用平板滲透法篩選對獼猴桃細菌性潰瘍病具有拮抗作用的內(nèi)生放線菌，通過測定不同拮抗內(nèi)生放線菌發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病病原菌(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae,Psa)的最低抑制濃度(Minimal Inhibitory Concentrations，MIC)篩選高抗性菌株；采用噴霧法及注干法進行高抗性菌株的田間防治試驗；結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，明確高抗性菌株分類地位。從431株內(nèi)生放線菌中篩選出7株具有明顯抗性的菌株，其中菌株M109的抑菌效果最強(MIC值為0.91 mg/mL)。田間試驗表明，菌株M109的噴霧法防效為72.1%，注干法防效為84.6%。分類鑒定結(jié)果顯示菌株M109為肉桂地鏈霉菌(Streptomycescinnamonensis)。試驗表明，肉桂地鏈霉菌S.cinnamonensisM109 對獼猴桃細菌性潰瘍病防效顯著，具有應(yīng)用潛力。

獼猴桃細菌性潰瘍病;內(nèi)生放線菌;生物防治;菌種篩選;防效

獼猴桃潰瘍病是一種由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的細菌性病害，該病主要危害樹干、枝條，嚴(yán)重時造成植株、枝干枯死，同時也危害葉片和花蕾[1]，不僅降低產(chǎn)量，而且會導(dǎo)致果皮變厚、果實畸形。由于該病可在短期內(nèi)爆發(fā)造成大面積樹體死亡，且具有適生范圍廣、致病性強、根除難度大等特點，已被列為我國森林植物檢疫性病害[2]。自20世紀(jì)80年代初在日本首次發(fā)病以來，該病在亞、歐及新西蘭等各主產(chǎn)區(qū)迅速蔓延[3-9]，給世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。多年來，我國對該病的防治主要依賴于化學(xué)藥劑和抗生素，但由于長期盲目過量施用農(nóng)藥已經(jīng)造成耐藥菌株的出現(xiàn)[10-11]，同時也導(dǎo)致土壤農(nóng)藥殘留過高，土壤生態(tài)破壞等問題日益嚴(yán)重，因此開發(fā)新型高效、環(huán)境友好的防治藥劑已成為產(chǎn)業(yè)界的迫切需要。放線菌是抗生素、酶和酶抑制劑等生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌。迄今為止，在已發(fā)現(xiàn)的由微生物產(chǎn)生的2萬多種生物活性物質(zhì)中，45%以上的活性物質(zhì)來自于放線菌[12]。以放線菌的次級代謝產(chǎn)物制備的微生物農(nóng)藥，因具有環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，已成為新型農(nóng)藥研發(fā)和生物防治技術(shù)開發(fā)的熱點。植物內(nèi)生放線菌是指在生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)部或細胞間隙而不引起植物產(chǎn)生明顯病癥的放線菌[13]。研究表明，植物內(nèi)生放線菌不僅宿主分布廣泛、種類豐富多樣而且還能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，在植物保護領(lǐng)域被作為生防微生物的重點開發(fā)對象[14]。自2013年以來，在對陜西關(guān)中獼猴桃主產(chǎn)區(qū)戶縣、周至縣、眉縣等地的獼猴桃細菌性潰瘍病進行病原學(xué)研究的同時，通過從發(fā)病果園的健康植株組織中篩選能夠有效抑制獼猴桃潰瘍病病原菌的內(nèi)生放線菌，并對其進行鑒定及防效實驗，以期為開發(fā)新型獼猴桃細菌性潰瘍病防治藥劑提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 分別于2013年4月及2014年4月在陜西省戶縣、周至縣、眉縣等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的果園中，自未發(fā)病的健康獼猴桃植株上采集植物根、莖、葉等組織樣品共140份。

1.1.2 病原菌 丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa)，由陜西省微生物研究所園藝作物病害綠色防控實驗室自染病植株中分離獲得，現(xiàn)保藏于陜西省微生物菌種資源庫(SMRL)。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏1號培養(yǎng)基：用于菌種分離及純化；馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基：用于形態(tài)觀察；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：小米 10 g，葡萄糖10 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨 3.0 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min；病原菌培養(yǎng)基：PSA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生放線菌的分離和純化 參考陳華紅、張金麗等[15-16]的方法，將所采樣品以蒸餾水清洗干凈后進行表面除菌，用經(jīng)過滅菌處理的枝剪、解剖刀及打孔器將經(jīng)過表面消毒的葉片打孔成約1 cm2的小塊，根、莖切成約0.5～1.0 cm左右的小段(兩端均需有切口)。組織塊表面消毒采用三步法[17-18]。消毒結(jié)束后立即用無菌水將組織塊漂洗3～4次，取最后一次清洗液500 μL轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿，倒入高氏1號培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)3 d, 以檢測消毒是否徹底。將經(jīng)過表面消毒的組織塊用無菌研缽研磨，以4層滅菌紗布過濾后將濾汁進行梯度稀釋。選取10-2、10-3、10-4三個濃度的濾汁，加200 μL于高氏1號培養(yǎng)基平板上，涂布均勻后于28 ℃培養(yǎng)3～15 d，根據(jù)形態(tài)及顏色差異挑取不同菌落，純化后于斜面中保存、備用。

1.2.2 拮抗菌的篩選 利用平板滲透法篩選對病原菌Psa具有顯著抑制作用的內(nèi)生放線菌。用直徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)5 d的放線菌平板上打孔，取等量菌塊接種到容量為250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)7 d后將發(fā)酵液過濾除菌，濾液稀釋100倍備用。將PSA培養(yǎng)基熔化并在水浴中冷卻至50 ℃后，加入事先制備好的病原菌懸液，充分混勻，使培養(yǎng)基中的病原菌濃度達到1.0×106cfu/mL。取15 mL混有病原菌的培養(yǎng)基注入直徑90 mm的平皿中并迅速搖勻，待凝固后在其上等距離放置3個牛津杯，每個牛津杯中加入100 μL稀釋后的無菌發(fā)酵濾液，將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h后，依據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈的大小作為篩選依據(jù)。

1.2.3 發(fā)酵液最低抑制濃度測定 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)的《抗菌藥物紙片法敏感性試驗的實施標(biāo)準(zhǔn)》(2010)[19]，采用平板稀釋法測定有抗性的內(nèi)生放線菌發(fā)酵液對病原菌Psa的最低抑制濃度(MIC)。將病原菌稀釋后，濃度計數(shù)至1.0×104cfu/mL。將放線菌的無菌發(fā)酵濾液按倍數(shù)稀釋法加入PSA培養(yǎng)基，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿(d=9 cm)，使PSA培養(yǎng)基中含有的發(fā)酵濾液的濃度分別為(20.00、16.00、12.00、8.00、4.00、2.00、0.50、0.25 mg/mL)； 以不加入發(fā)酵濾液的PSA培養(yǎng)基平板為對照組。分別將10 μL病原菌液加入供試組與對照組PSA平板上后均勻涂布，28 ℃培養(yǎng)5 d。MIC定義為99%的病原菌被完全抑制所需的最小抑制濃度。

1.2.4 菌種鑒定 ①培養(yǎng)特征及生理生化特性：參考《微生物分類學(xué)》[20]、《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[21]及伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)[22]中的方法進行研究。②放線菌基因組 DNA 提取與16S rDNA擴增：放線菌基因組 DNA 的提取采用Walact Bacterial Genomic DNA Purification Kit(Vicband Life Sciences company (HK) Limited)試劑盒進行，以通用引物27F/1525R為引物擴增16S rDNA。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR產(chǎn)物。使用Easy Pure Quik Gel Extraction Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)對目的片段進行純化。PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(大連寶生生物工程有限公司)連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞并用載體通用引物M13F/M13R篩選陽性克隆子。將篩選得到的陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進行序列測定。③分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析：采用NCBI的Basic BLAST對所測得的DNA序列進行同源性比對，并利用ClustalX 2.0及MEGA 5.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 田間病害防治實驗 于2014年2月下旬在西安市灞橋區(qū)南鄭村進行，分別以全株噴霧和注干施藥的方法進行防效驗證，所選獼猴桃品種為徐香。①噴霧防治試驗：分別用內(nèi)生放線菌發(fā)酵液(含菌體)20倍液，72%農(nóng)用鏈霉素800倍液和1.6%噻唑酮1 000倍液進行全株噴施，并設(shè)清水對照，每組處理20株，間隔7 d噴藥1次，連續(xù)4次。分別于施藥前和最后一次施藥7 d后調(diào)查各組發(fā)病情況，并計算防效。②注干防治試驗：在距離樹干基部10～30 cm處向下傾斜45度鉆孔到植株木質(zhì)部，分別將內(nèi)生放線菌發(fā)酵液(含菌體)10倍液，72%農(nóng)用鏈霉素600倍液和1.6%噻唑酮600倍液裝入輸液袋(裝量為500 mL)掛置在高于鉆孔0.5～1.0 m處，將輸液針頭插入孔中進行輸液。設(shè)清水對照，每組處理20株，分別于施藥前和施藥30 d后調(diào)查各組發(fā)病情況，并計算防效。③防效統(tǒng)計：參考張鋒等[23]的方法，病情分級如表1所示。病情指數(shù)及防治效果計算公式如下：

防治效果(%)=

表1 獼猴桃潰瘍病分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for grading bacterial canker of Kiwifruit in fields

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離及拮抗菌篩選

研究發(fā)現(xiàn)，消毒后的組織塊最后一次清洗液倒入高氏1號培養(yǎng)基，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)3 d后未出現(xiàn)菌落。說明表面消毒效果良好，排除環(huán)境及植株表面微生物污染的可能性。從獲取的獼猴桃組織樣品中共分離具典型放線菌特征的菌株431株，通過菌落形態(tài)、氣生菌絲、基質(zhì)菌絲、產(chǎn)色素情況及孢子形態(tài)等特征進行區(qū)分，去除重復(fù)后共得到40種不同類型的內(nèi)生放線菌。采用平板滲透法對所得431株內(nèi)生放線菌進行初步抗性篩選(圖1)，共得到對病原菌Psa有明顯抑制效果的內(nèi)生放線菌7株。由表2可見，通過對其發(fā)酵濾液的MIC測定，菌株M109的抑菌效果最強，其MIC值為0.91 mg/mL。

圖1 內(nèi)生放線菌發(fā)酵液對病原菌Psa的抑制效果Fig.1 Inbition effects of actinomycetes fermentation broth to Psa表2 內(nèi)生放線菌發(fā)酵液的最低抑制濃度Table 2 MICs of the fermentation broth of the endophytic actinomycetes

編號最低抑制濃度/(mg·mL-1)M312.74M443.16M1011.84M1090.91M1841.33M2282.48M4261.14

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化特征 菌株M109初培養(yǎng)時菌落小(d=1.0～2.0 mm)且分散呈地衣狀；最初表面光滑，后氣生菌絲發(fā)育，菌落呈顆粒狀。菌絲多核、纖細(d=0.5～2.0 μm)；基內(nèi)菌絲多分枝，橫隔稀疏，很少斷裂，在馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基上可產(chǎn)生紫紅色色素；氣生菌絲比基內(nèi)菌絲稍粗，為外鞘所包，氣生菌絲可部分分化成直形、柔曲、鉤環(huán)狀至松散或緊密螺旋形的指骨狀孢子鏈(圖2C箭頭所示)，正常含50個左右的孢子，短者含5～10個孢子；孢子為節(jié)孢子，由菌絲斷裂而成，孢子壁光滑。該菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

圖2 菌株M109形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphologic characteristic of strain M109A：菌落特征；B：基生菌絲；C：氣生菌絲A：Colony morphology;B:Substrate hyphae;C:Aerial hyphae

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株M109的16S rDNA PCR產(chǎn)物約1.5 kb，其在NCBI的注冊號為KT265728。利用Basic BLAST將菌株M109的16S rDNA序列和NCBI中已登錄的放線菌16S rDNA序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株M109與鏈霉菌屬的肉桂地鏈霉菌(Streptomycescinnamonensis)的16S rDNA核苷酸序列同源性最為相似，利用MEGA5構(gòu)建的N-J法系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結(jié)合生理生化鑒定和同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，可認(rèn)定菌株M109為Streptomycescinnamonensis。

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)

圖3 菌株M109的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain M109

2.3 田間病害防治效果

由表4可見，在全株噴霧防治實驗中，1.6%噻唑酮1 000倍液的效果最好，防效為76.2%；而M109發(fā)酵液20倍的效果優(yōu)于72%農(nóng)用鏈霉素1 000倍液，防效分別為72.1%和64.3%。注干法防治實驗中，1.6%噻唑酮和72%農(nóng)用鏈霉素的防治效果較差，防效分別為61.8%和54.2%；M109發(fā)酵液的效果最好，防效為84.6%。此外，經(jīng)田間觀察，在各實驗組中，經(jīng)M109發(fā)酵液注干后的獼猴桃長勢明顯好于其他各處理組，說明菌株M109的代謝產(chǎn)物中除具有抗病的活性物質(zhì)外，還可能含有其他能夠促進植株生長的活性物質(zhì)。

表4 不同藥劑及施藥方法防治獼猴桃潰瘍病的效果Table 4 Control efficacy of Kiwifruit bacterial canker by different agentia and methods

3 討 論

在進行內(nèi)生放線菌分離時，本研究使用了類似內(nèi)生細菌分離的組織勻漿稀釋涂布法，該方法可以有效減輕內(nèi)生真菌(尤其是鐮刀菌(Fusarium)、鏈格孢菌(Alternaria)等優(yōu)勢內(nèi)生真菌種群)的干擾，通過梯度稀釋在一定程度上避免優(yōu)勢內(nèi)生細菌類群的干擾，因而獲得了大量(431株)的內(nèi)生放線菌。但該方法不適合分離組織內(nèi)密度較低的稀有放線菌類群。利用平板滲透法對所得到的內(nèi)生放線菌進行抗性篩選，獲得7株具有顯著抗性的菌株。但該方法僅適用于通過透明圈大小對內(nèi)生菌抗性進行定性和初篩。因為受加液量的影響，發(fā)酵液在培養(yǎng)基中擴散后形成的透明圈半徑有限，所以當(dāng)有多個抗性顯著的菌株存在時，其相互間的透明圈大小便難以體現(xiàn)各菌株間抗菌能力的真實差異。為了進一步對這些抗性菌株的抗病能力進行定量評價，本研究參考NCCLS的《抗菌藥物紙片法敏感性試驗的實施標(biāo)準(zhǔn)》(2010)，在相同發(fā)酵條件下，采用平板稀釋法對7株抗性顯著的內(nèi)生放線菌發(fā)酵液進行了最小抑制濃度測定。結(jié)果顯示，菌株M109的抗性最為顯著，其MIC值達到了0.91 mg/mL。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，可以確認(rèn)該菌株為鏈霉菌屬的肉桂地鏈霉菌(Streptomycescinnamonensis)。

由于微生物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的能力一般是為了滿足在特殊生長條件下的一種生理行為，有些活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能需要特殊物質(zhì)的誘導(dǎo)，因而體外培養(yǎng)的抗性篩選結(jié)果只能說明該菌株在離體條件下具有抗菌活性，無法判斷其在植物組織內(nèi)是否可以表現(xiàn)出抗性。因此，在進行田間病害防治試驗時，本研究分別采用噴霧法和注干法對S.cinnamonensisM109的防效進行驗證。結(jié)果表明，將S.cinnamonensisM109發(fā)酵液進行20倍稀釋后進行全株噴霧，其防效可達72.1%，與現(xiàn)有常用化學(xué)藥劑的防治效果相近。此外，通過注干法試驗發(fā)現(xiàn)，S.cinnamonensisM109能夠在獼猴桃植株體內(nèi)發(fā)揮更好的抗病效果，其田間病害防效可達84.6%，顯著高于對照藥劑的水平。

目前，藥劑防治獼猴桃細菌性潰瘍病的常用方法主要包括全株噴霧處理、傷口涂抹施藥、灌根給藥三種方法。噴霧處理可使藥液均勻分布在植株表面而形成保護層，既可預(yù)防病原菌侵染，又能起到治療作用，但易受光照、溫度、雨水等氣候條件影響，防治效果不穩(wěn)定。涂抹施藥法是將病變部位的組織刮除后用藥，藥劑在短時間內(nèi)直接與病原菌接觸，能很快抑制病情發(fā)展，但防治時會加重果樹的傷流，減弱樹勢，而且裸露的傷口愈合緩慢，容易導(dǎo)致二次感染。灌根法主要用于對根系及周邊土壤中的病原進行消毒，可有效殺滅土壤中潛伏的病原菌，但用藥量大、防治費用較高，而且會殺滅大量根際中的益生菌，嚴(yán)重破壞根際土壤的微生態(tài)環(huán)境。為了探索適用于內(nèi)生拮抗菌防病的給藥方法，本研究嘗試將具有抗病作用的植物內(nèi)生放線菌及其活性代謝產(chǎn)物注入獼猴桃樹體內(nèi)，借助傷流作用的滲透壓差使其被輸送至樹體各部位，從而起到抑菌防病的作用。研究證明該方法是可行的，與現(xiàn)有的傳統(tǒng)防治方法相比，除防效顯著外，還具有用量少、操作簡便、不受氣候條件影響等優(yōu)勢。因此，作為一種新型的防治獼猴桃細菌性潰瘍病的注干藥劑菌株，S.cinnamonensisM109具有很好的應(yīng)用開發(fā)潛力。

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Screening, Identification and Controlling Effects of Biocontrol Strain against Chinese Gooseberry or Kiwi Fruit Bacterial Canker

ZHU Hai-yun, MA Yu, KE Yang, LI Bo, SUN Chao

(ShaanxiMicrobiologyInstitute,Xi’an710043)

Endophytic actinomycetes (EA) having biocontrol potential inhibition against Chinese gooseberry (Actinidiachinensis) (CGB) or kiwi fruit bacterial canker were screened from healthy native plants of CGB to provide material to control the disease adopting plate osmotic method. Different minimal inhibitory concentration (MIC) of fermented broth of EA against CGB canker pathogenPseudomonassyringaepv.Actinidiae(Psa) was tested to screen high resisting strain (HRS), and adopt spraying method and trunk injection method to carry out field experiment for the HRS; combined with morphology, physiological and biochemical and 16S rDNA sequencing analysis to confirm the taxonomical location of the HRS. From a total of 431 EA strains were isolated from the native plants of CGB seven strains were screened that had obvious resistance against the pathogen. Among them strain M109 exhibited the strongest inhibition activities againstPsawith MIC value at 0.91 mg/mL. Field experiments showed that the controlling efficiency with spraying method was at 72% and 84.61% with trunk injection method. The strain M109 was identified asStreptomycescinnamonensis. The experiments showed thatS.cinnamonensisstrain M109 against CGB canker had a significant controlling efficiency and possessed application potential.

Chinese gooseberry (CGB) or Kiwi fruit bacterial canker; endophyticactinomycete; biocontrol; strain screen; control efficiency

陜西省農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)開發(fā)項目(2014K02-10-01)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目(2015NY042)；西安市農(nóng)業(yè)科技

朱海云 女，助理研究員，碩士。主要從事農(nóng)業(yè)微生物病害防治研究。Tel：029-85350847，E-mail：zhyhaiyun@yahoo.com

* 通訊作者。女，副研究員，博士。主要從事農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail:wefly@ms.xab.ac.cn

2015-10-08；

2015-11-12

Q93-3

A

1005-7021(2016)05-0090-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.016

計劃項目(NC1404(3))