TLR4激活劑對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)感染早期免疫應(yīng)答的影響

呂衍民， 郁春云， 劉 飛， 劉 軍， 曹雅明

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

TLR4激活劑對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)感染早期免疫應(yīng)答的影響

呂衍民， 郁春云， 劉 飛， 劉 軍， 曹雅明*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

通過(guò)外源性給予LPS，探討TLR4在瘧疾感染早期免疫應(yīng)答的作用特點(diǎn)及其免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)Plasmodiumyoelii17XL 感染的BALB/c小鼠建立鼠瘧模型并在感染前給予LPS，于感染第0、3和5 天制備脾細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞懸液中TLR4+DCs和Tregs百分含量；ELISA方法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-10水平。結(jié)果顯示，LPS處理能夠顯著延長(zhǎng)宿主生存期，降低原蟲(chóng)血癥水平，同時(shí)顯著提升脾上清中的IFN-γ水平，降低抑炎性細(xì)胞因子IL-10水平。在感染早期，LPS處理可誘導(dǎo) Th1 型免疫應(yīng)答的有效建立，明顯遏制P.y17XL紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的感染進(jìn)程。

TLR4；Th1型免疫應(yīng)答；致死型約氏瘧原蟲(chóng)；保護(hù)性免疫

瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生原蟲(chóng)疾病，流行于102個(gè)國(guó)家和地區(qū)，每年約有3～5億瘧疾感染病例，100多萬(wàn)人因其死亡，死亡患者多為5歲以下兒童[1-2]。目前迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是抗瘧疾疫苗的研制開(kāi)發(fā)和免疫治療策略的確定，而明確瘧原蟲(chóng)感染引起的保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制是瘧疾疫苗研發(fā)的前提。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠活化初始T細(xì)胞，連接固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答建立。在瘧原蟲(chóng)感染早期，DCs可通過(guò)分泌IL-12誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞活化，產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子，如IFN-γ,以達(dá)到清除瘧原蟲(chóng)的目的[3-5]；隨后Th2型細(xì)胞活化，分泌細(xì)胞因子輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體,有效清除瘧原蟲(chóng),防止復(fù)發(fā)和再燃[6-7]。在這一過(guò)程中，DCs通過(guò)Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)對(duì)于病原相關(guān)分子模式(PAMPs)進(jìn)行識(shí)別，向T細(xì)胞提呈抗原。其中，TLR4是DCs識(shí)別瘧原蟲(chóng)抗原的主要模式識(shí)別受體，其表達(dá)水平或功能狀態(tài)可能對(duì)DCs的活化和功能產(chǎn)生影響。進(jìn)而干擾DCs對(duì)CD4+T細(xì)胞不同亞群應(yīng)答模式的調(diào)控作用，影響正常的免疫應(yīng)答過(guò)程。研究顯示，TLR4可識(shí)別脂多糖(LPS)、酵母甘露聚糖以及熱休克蛋白等病原相關(guān)的分子模式。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可作為T(mén)LR4的激活劑，通過(guò)My88途徑誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8-9]。本研究以Plasmodiumyoelii17XL(P.y17XL)感染BALB/c小鼠建立瘧疾感染模型，外源給予TLR4激動(dòng)劑LPS，誘導(dǎo)DCs活化，觀察DCs表面TLR4分子表達(dá)水平的變化以及對(duì)感染后促炎性和抗炎性細(xì)胞因子分泌水平的影響，探討瘧疾感染早期TLR4在保護(hù)性免疫應(yīng)答中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠瘧原蟲(chóng)感染 BALB/c雌性小鼠6～8周齡，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，經(jīng)腹腔接種1×106個(gè)P.y17XL瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞(日本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng))。部分正常小鼠于感染前一天分別注射TLR4激動(dòng)劑LPS。小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.1.2 脾細(xì)胞的培養(yǎng) 殺鼠留取血清，無(wú)菌情況取出正常和處理組小鼠的脾臟，采用200目篩網(wǎng)研磨后，用10 mL含10%熱滅活小牛胎血清(FCS)的RPMI 1640 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸浮液 350×g，室溫離心10 min，采用冷藏0．17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞，RPMI 1640 清洗2次。采用含10% FCS的RPMI 1640將脾細(xì)胞終濃度調(diào)整至1×107/mL，接種到24孔培養(yǎng)板中，每孔加入 500 μL細(xì)胞懸液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，收集上清，-80 ℃保存，檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞因子的檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA 試劑盒，分別檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-10的分泌水平。酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用 SoftMaxPro 4.3.1L s 軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

1.2.2 DCs亞群分化與功能分析 抗CDllc-FITC mAb(clone HL3,BD Pharmigen)與TLR4-PE mAb(cloneMTS510,eBioscience)分析TLR4的表達(dá)水平。

1.2.3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs) 0.1 mL的脾細(xì)胞懸液中加入抗CD4-FITC mAb(clone GK1.5,BD Pharmingen)與抗CD25-PE mAb(clone PC61, BD Pharmingen)，4 ℃避光染色30 min，細(xì)胞經(jīng)洗滌后，固定透膜1 h，加入抗Foxp3-APC mAb(clone FJK16s, eBioscienc)，4 ℃避光染色30 min。上述染色的脾細(xì)胞最終經(jīng)200 μL 2%多聚甲醛PBS溶液固定懸浮，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)，利用FlowJ07.6對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student’st檢驗(yàn)和單因素方差分析法比較各組均值的差異性,α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS處理對(duì)小鼠原蟲(chóng)血癥水平和生存率的影響

對(duì)照組小鼠在感染后3 d原蟲(chóng)血癥水平迅速上升高達(dá)60%，并于5～8 d左右死亡。與對(duì)照組相比，感染前給予LPS的BALB/c小鼠，原蟲(chóng)血癥水平緩慢上升，于9～11 d達(dá)峰值，在感染后15 d左右開(kāi)始下降。生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，生存率可達(dá)60%以上(圖1)。結(jié)果表明，外源性給予LPS可顯著降低小鼠原蟲(chóng)血癥水平并提高生存率。

2.2 LPS處理對(duì)感染小鼠脾臟中TLR4+DCs百分率的影響

感染后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟中TLR4+DCs表達(dá)量均明顯增高，其中，LPS處理組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明在瘧原蟲(chóng)侵入小鼠體內(nèi)后，作為啟動(dòng)初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答的唯一的抗原提呈細(xì)胞——DCs發(fā)生活化增殖。 經(jīng)LPS處理后，DCs表達(dá)TLR4明顯增加(圖2)。

圖1 P.y 17XL 感染后不同時(shí)間的原蟲(chóng)血癥水平(A)和生存率(B)Fig.1 The parasitemia(A) and survival rate (B) at different time points after P.y 17XL infection #:組間數(shù)據(jù)相比P< 0.05，下圖同 #: P <0.05 when compared with the other group,same the follow

圖2 P.y 17XL 感染后不同 時(shí)間的TLR4 DCs百分比Fig.2 The percentage of TLR4 DCs at different time points after P.y 17XL infection

2.3 LPS處理對(duì)小鼠脾臟中炎癥應(yīng)答的影響

在小鼠感染后第 0、3、5 天，檢測(cè)LPS組和對(duì)照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖3)中 IFN-γ水平。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后第3 天，對(duì)照組和LPS組脾上清中 IFN-γ水平顯著升高，LPS組IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。在感染后第5 天，對(duì)照組與LPS組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IFN-γ水平同時(shí)下降，但LPS組水平仍高于對(duì)照組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，給予LPS后，感染P.y17XL 的 BALB/C小鼠促炎癥性細(xì)胞因子顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的發(fā)生。

圖3 LPS可增強(qiáng)感染P.y 17XL的BALB/c 小鼠炎癥應(yīng)答Fig.3 LPS enhances pro-inflammatory immune responses in P.y 17XL infected BALB/C mice

2.4 LPS處理對(duì)感染瘧疾小鼠脾 Tregs和 IL-10 的影響

在鼠瘧模型中 Tregs通過(guò)分泌 IL-10 對(duì)Th1型免疫應(yīng)答具有抑制作用[16]。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了 Tregs 和 IL-10 的水平。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在感染后3 d Tregs的百分含量和IL-10的水平明顯上升，于第5 天下降，LPS處理組與對(duì)照組趨勢(shì)一致但LPS組Tregs和 IL-10的水平明顯低于對(duì)照組(圖4)。結(jié)果表明，LPS處理可顯著降低Tregs和 IL-10的水平。

圖4 LPS對(duì)感染P.y 17XL 的BALB/C 小鼠 Treg 細(xì)胞(A)以及脾培養(yǎng)上清中 IL-10(B)的影響Fig.4 Percentage of Treg gated in CD4+ T cells and concentration of IL-10 in spleen culture supernatant at various time points

3 討 論

TLR作為模式識(shí)別受體, 突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥應(yīng)答，并且促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟，從而誘導(dǎo)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答[10-11]。本研究結(jié)果顯示通過(guò)外源性給予TLR4激動(dòng)劑明顯延長(zhǎng)了小鼠的生存時(shí)間，同時(shí)降低了原蟲(chóng)血癥水平，上調(diào)DCs和IFN-γ水平，降低Treg的數(shù)量以及IL-10的分泌，從而增強(qiáng)了瘧疾感染早期的保護(hù)性免疫應(yīng)答。DCs可以通過(guò)TLR識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13種TLR，其中人類表達(dá)有10種。TLR4表達(dá)于細(xì)胞表面，主要識(shí)別一些細(xì)菌特有成分，如脂多糖、脂蛋白、肽聚糖等脂類物質(zhì)。嚙齒類動(dòng)物研究表明，TLR4可識(shí)別瘧原蟲(chóng)表達(dá)的過(guò)氧化還原蛋白和糖基磷脂酰肌醇等成分。而LPS作為T(mén)LR4的激動(dòng)劑，可以與TLR4結(jié)合，通過(guò)MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑傳導(dǎo)活化信號(hào)，從而介導(dǎo)炎癥性免疫應(yīng)答；可以增強(qiáng)DCs吞噬抗原的能力，誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子，如CD80、CD86和CD40等的表達(dá)，可促進(jìn)DCs分泌IL-12和I型干擾素，誘導(dǎo)DCs的成熟[12-13]。因此，在本研究中給予感染小鼠TLR4激動(dòng)劑后，可增加DCs表面TLR4的表達(dá)，從而利于DCs的成熟和分化。

在感染早期，Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮了極其重要的作用。DCs提呈瘧原蟲(chóng)抗原誘導(dǎo)Th1細(xì)胞活化，促進(jìn)IFN-γ等前炎癥細(xì)胞因子的釋放。這在抑制瘧原蟲(chóng)的爆發(fā)性增殖、控制瘧原蟲(chóng)血癥水平中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[12]。因此，在感染早期宿主建立有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答是控制瘧原蟲(chóng)增殖的關(guān)鍵。在本研究中，給予感染小鼠LPS后，通過(guò)促進(jìn)DCs的活化，進(jìn)而增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答的發(fā)生，引起IFN-γ水平的升高。保護(hù)性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，抑制了原蟲(chóng)血癥水平的劇增。

Tregs是機(jī)體內(nèi)具有抑制功能的免疫細(xì)胞，對(duì)Th1型免疫應(yīng)答和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有抑制作用。在瘧疾感染中，可通過(guò)接觸抑制和分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10等發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，從而促進(jìn)瘧原蟲(chóng)的免疫逃逸[14-16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，P.y17XL感染BALB/c小鼠后，LPS組的脾中Tregs百分含量和IL-10水平均低于對(duì)照組，進(jìn)一步表明LPS增強(qiáng)了抗瘧原蟲(chóng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

綜上所述，TLR4激動(dòng)劑可通過(guò)促進(jìn)有效的Th1型免疫應(yīng)答的建立，對(duì)宿主具有保護(hù)性免疫作用。TLR家族作為天然免疫系統(tǒng)識(shí)別受體，在研究感染性疾病發(fā)病機(jī)制和臨床治療方面都具有十分重要的意義，可根據(jù)需要抑制或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界微生物感染的應(yīng)答能力，以減少感染后的免疫病理?yè)p傷。在此基礎(chǔ)上也為藥物和新疫苗的研發(fā)提供了新的理論依據(jù)。

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Effect of TLR4 against Early Immune Response duringPlasmodiumyoeliiInfection

LYU Yan-min, YU Chun-yun, LIU Fei, LIU Jun, CAO Ya-ming

(Dept.ofImmunol.,Schl.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

The effective characteristics and the role of TLR4 in early immune response and immune regulation were investigated during plasmodium infection by exogenous administration of LPS, Malaria model was established byPlasmodiumyoelii17XL infected BALB/c mice and the LPS was administered prior to the infection. Spleen cell suspension was prepared on day of 0, 3 and 5 after the infection. The percentages of TLR4+DCs and Tregs were detected by flow cytometry. The concentration of IFN-γ and IL-10 were tested by Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). The results showed that LPS treatment could reduce the parasitaemia level and prolong the survival time. At the same time the IFN-γ levels in spleen supernatant were significantly increased and reduced the levels of inflammation-inhibitory cytokines. In the early stages of infection, the treatment of LPS could effectively establish Th1 immune response and significantly contain theP.y17XL infection process during endoerythrocytic stage.

TLR4; Th1 immune response; lethalPlasmodiumyoelii17XL; protective immunity

2011年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20112104110018)

呂衍民 女，碩士。主要從事抗感染免疫研究。E-mail:995740393@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事抗感染免疫研究。E-mail: ymcao@mail.cmu.edu.cn

2015-12-28；

2016-02-03

Q939.91;R392

A

1005-7021(2016)05-0057-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.010