不同濃度嗜酸乳酸桿菌對急性期實驗性結(jié)腸炎腸黏膜屏障的研究

摘要：目的 研究不同濃度嗜酸乳酸桿菌對急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障的作用。方法 50只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、不同濃度嗜酸乳酸桿菌組，對小鼠進行急性期潰瘍性結(jié)腸炎動物模型建立；觀察小鼠一般情況，體重變化，糞便隱血及結(jié)腸病理表現(xiàn)，免疫組織化學熒光染色測定結(jié)腸組織zo-1、occludin緊密連接蛋白的變化。結(jié)果 不同濃度嗜酸乳酸桿菌治療模型小鼠的一般情況及病理組織學均有明顯改變，與模型組比較，不同濃度嗜酸乳酸桿菌組結(jié)腸組織zo-1、occludin蛋白表達增加，但1×106CFU/ ml濃度嗜酸乳酸桿菌組蛋白較其他濃度組zo-1、occludin蛋白表達顯著增加。結(jié)論 可見1×106CFU/ ml濃度嗜酸乳酸桿菌對急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：嗜酸乳酸桿菌；潰瘍性結(jié)腸炎；急性期動物模型；腸黏膜屏障

1資料與方法

1.1動物與試劑 動物：雄性C57BL/6小鼠（體重18～22g；7～12w），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公；嗜酸乳酸桿菌 LT0637為湖南康哲中南醫(yī)藥研究有限公司提供，培養(yǎng)液離心后用生理鹽水均稀釋成1×105 CFU/ml，1×106 CFU/ml，1×107 CFU/ml濃度；右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）（Sigma公司美國）；兔抗zo-1抗體（Invitrogen）、 鼠抗occludin抗體（美國Santa Cruz公司）、HRP 抗鼠IgG 、HRP 抗兔IgG （北京中杉有限公司）；主要試劑的配制2%DSS：10 g DSS （分子量36 000～50 000）溶于500 mL蒸餾水中，配成2 %濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存。

1.2造模方法 動物造模與急性期造模及不同濃度嗜酸乳酸桿菌干預：50只雄性C57BL/6小鼠按隨機數(shù)字表隨機分入正常對照組、模型組、1×105 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組、1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組，每組10只；模型組自由飲用2% DSS 7d，正常對照組和不同濃度嗜酸乳酸桿菌組小鼠自由飲用蒸餾水7d；不同濃度嗜酸乳酸桿菌組小鼠自實驗開始至結(jié)束，每組分別予1×105 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；正常組和模型組予PBS灌胃作對照，時間均為1w，從第8d處死所有動物。

1.3小鼠一般情況及結(jié)腸病理組織染色 每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、體重、活動情況、毛發(fā)光澤度、食欲、大便性狀等。在實驗結(jié)束時處死小鼠，取部分腸段置于多聚甲醛內(nèi)固定，包埋、切片，HE染色，行組織病理學觀察。

1.4結(jié)腸組織免疫組織化學熒光染色 新鮮腸組織以5μm的厚度進行連續(xù)冰凍切片，按以下步驟進行zo-1和occludin的免疫熒光染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗滌液洗5 min 3次，封閉液封閉，室溫1 h，加兔抗zo-1多克隆抗體/小鼠抗occludin單克隆抗體，4℃過夜，洗滌液洗5 min 3次，滴加標記綠色熒光的抗兔FITC/標記紅色熒光的抗小鼠Cy3，室溫1 h綠色熒光/紅色熒光為陽性表達。陰性對照組用PBS替代一抗，其余步驟同上。

2結(jié)果

2.1動物的一般狀況 實驗期間，正常對照組小鼠大小便正常、體重持續(xù)增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活動、精神狀態(tài)均正常。急性期模型組動物飲用2%DSS水后第1d，體重增長，飲水和進食較多；飲用DSS第3d，模型組小鼠體重出現(xiàn)下降，飲水和進食明顯減少，大便松散，量增多；飲用DSS第5d，小鼠體重下降明顯，精神萎靡，體毛凌亂，并出現(xiàn)稀便；實驗第8d模型組小鼠體重明顯減輕，肛周可見肉眼血便。嗜酸乳酸桿菌組于實驗第1d分別予1×105 CFU/ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml灌胃治療，第2d嗜酸乳酸桿菌組動物體重逐漸回升，精神好轉(zhuǎn)，并出現(xiàn)稀便；第5d，嗜酸乳酸桿菌組動物體重明顯增加，大便稀，量多；第7d，嗜酸乳酸桿菌組動物體重回升明顯，精神狀態(tài)良好，飲水和進食較多，大便量多。

2.2嗜酸乳酸桿菌組對小鼠結(jié)腸組織病理的影響 正常對照組結(jié)腸黏膜光滑，無水腫、充血等表現(xiàn)；模型組小鼠結(jié)腸黏膜缺損，腺體破壞或消失，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量炎性細胞浸潤，隱窩增生，組織上皮破損，炎癥細胞廣泛浸潤，呈典型炎癥改變。給予嗜酸乳酸桿菌組可見炎癥細胞浸潤少，炎癥程度較模型組明顯減輕。1×106 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸道屏障修復作用最明顯，減輕炎癥細胞浸潤效果最佳；1×105 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌、1×107 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸病理表現(xiàn)較模型組炎癥浸潤、病變深度、隱窩破壞均不同程減輕。

2.3免疫熒光染色檢測結(jié)腸黏膜zo-1、occludin蛋白的定位分布 Zo-1、occludin蛋白的免疫熒光表達更具有特異性。激光共聚焦顯微鏡下見zo-1蛋白呈現(xiàn)綠光，occludin蛋白呈現(xiàn)紅光。急性期正常對照組zo-1、occludin蛋白表達可見熒光沿胞膜分布，熒光強度強，邊緣光滑；模型組熒光分布較正常對照組分散，熒光強度減弱，邊緣粗糙呈鋸齒狀；1×105 CFU/ ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組熒光仍沿胞膜分布，強度較正常對照組稍減弱，但仍強于模型組；1×105CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組和1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸組織中Zo-1、occludin蛋白表達熒光分布較1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組分散，熒光強度減弱，邊緣粗糙呈鋸齒狀。

3討論

UC作為一種以腸道癥狀為主要表現(xiàn)的疾病，且主要發(fā)病部位集中在腸道細菌呈高濃度的結(jié)直腸部位，結(jié)合環(huán)境因素的改變繼而發(fā)病率改變的現(xiàn)象，提示其發(fā)病與腸道細菌有密切關(guān)系。近年研究更顯示腸道菌群的紊亂是誘發(fā)的一個重要因素，相關(guān)研究報道用糞便灌腸治療法能緩解腸道炎癥，這表明細菌在本病發(fā)病中起著重要作用[1]。

參考文獻：

[1]Wills ES，Jonkers DM，Savelkoul PH，et al.Fecal microbial composition of ulcerative colitis and Crohn's disease patients in remission and subsequent exacerbation[J].PLoS One，2014，9（3）：e90981.

編輯/丁一