沙門氏菌invA基因ICAN快速檢測法的研究

摘要：嵌合引物介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，ICAN）反應(yīng)需要三個特殊的組成：5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物、耐熱的RNaseH及具有鏈取代活性的DNA聚合酶，此法只需在55℃左右恒溫反應(yīng)一個小時即可[1]。本文闡述了為建立快速檢測沙門氏菌invA基因的ICAN法進(jìn)行的研究，結(jié)果沒有出現(xiàn)如報道中描述的清晰的三條帶，但是與陰性和其他腸桿菌科細(xì)菌相比，沙門菌有明顯的特異性條帶。本文對出現(xiàn)此結(jié)果的原因進(jìn)行了比較詳盡的分析。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；ICAN；invA基因

沙門氏菌（Salmonella）為腸桿菌科沙門氏菌屬成員，是一類條件性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性腸桿菌。絕大多數(shù)沙門氏菌對人和動物有致病性，能引起人和動物多種不同的臨床表現(xiàn)，主要引起發(fā)熱、胃腸炎、腹瀉和敗血癥等，中毒嚴(yán)重的，可引起死亡，病死率一般是0.5%～1%[2，3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，給各國經(jīng)濟(jì)造成重大損失。因而，在醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上具有非常重要的意義。目前，對沙門氏菌檢測大多采用細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR等方法，過程煩瑣、費(fèi)時費(fèi)力，并且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉，因此，這些檢測方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性[4～6]。Cocolin等[7]利用PCR擴(kuò)增invA 基因快速檢測食品中的沙門氏菌；Bohaychuk[8]等人利用熒光定量PCR技術(shù)對沙門氏菌invA基因進(jìn)行定量檢測。隨著對分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，2007年日本學(xué)者Hiroyuki Mukai[1]等發(fā)明了一種嵌合引物介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增法（即ICAN法）。ICAN反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物、耐熱的RNaseH及具有鏈取代活性的DNA聚合酶是ICAN反應(yīng)必需的。該反應(yīng)的原理包括多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換兩個機(jī)理， RNaseH在新合成鏈的引物部分的RNA處引入切口后，馬上就會在切口處發(fā)生鏈取代反應(yīng)取代新合成的鏈，同時，反應(yīng)液中的嵌合引物立即與模板雜交開始新的延伸反應(yīng)，多條鏈同時在同一模板進(jìn)行的鏈合成反應(yīng)稱多引物反應(yīng)機(jī)理；模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)是指：原反應(yīng)液中的模板合成的新模板在RNaseH酶和鏈取代酶的作用下，可以快速轉(zhuǎn)換出新的模板。由于多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)的同時進(jìn)行，ICAN比起一般的擴(kuò)增方法更加快速。ICAN法區(qū)別于其他檢測方法的最重要的特點(diǎn)是：反應(yīng)時間短（一般只需60min）、所需模板量少（只需PCR所要求的模板量的1/5）、靈敏度高、擴(kuò)增反應(yīng)不需特殊的儀器（普通水浴鍋即可），另外，因?yàn)镮CAN采用恒溫擴(kuò)增系統(tǒng)，所以我們只要簡單地增加反應(yīng)液的體積卻不需改變反應(yīng)條件，這有助于DNA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[9]。本文主要對ICAN法應(yīng)用于沙門氏菌檢測的研究情況加以介紹。

1 材料與方法

1.1菌株 本次試驗(yàn)的菌株全部來自浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所，名稱見表1。

1.2主要試劑和儀器 PCR儀（eppendorf Mastercycler Gradient）、離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5417R）、DU800紫外/可見分光光度計、MiniRun GE-100型凝膠電泳儀、凝膠成像儀（BIO-RAD）、Bca BEST DNA聚合酶（TaKaRa）、Tli RNaseH Ⅱ（TaKaRa）、Hepes（sigma-aldrich）、dNTP Mixture（TaKaRa）。

1.3 ICAN引物 由上海生工生物技術(shù)委托IDT公司合成（引物序列見下表）

1.4菌培養(yǎng)、DNA模板的制備和DNA濃度純度的測定

1.4.1細(xì)菌的培養(yǎng) 從半固體培養(yǎng)基中挑取菌落接種于普通瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h，再從平板上挑取典型單菌落，用LB肉湯培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)過夜。

1.4.2 DNA模板的制備 用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）制備，其步驟為：

1.取1～4ml的過夜培養(yǎng)菌液，10000rpm離心2min，棄上清；

2.用150μl的SP Buffer（含RNase A1）充分懸浮細(xì)菌沉淀； 注：注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮

3.加入20μl的Lysozyme溶液，均勻混合后室溫靜置5min；

4.加入30μl的EDTA Buffer，均勻混合后室溫靜置5min；

5.加入200μl的Solution A，劇烈振蕩后65℃保溫10min；注：①若Solution A出現(xiàn)沉淀，請于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用；②65℃保溫10min后，溶液將由乳濁液變成透明液。如果此時溶液沒有變成透明，說明細(xì)菌沒有裂解基因組DNA將不能釋放；

6.加入400 μl的Solution B，劇烈振蕩15s； 注：若Solution B出現(xiàn)沉淀，請于65℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用；

7.加入650 μl的Solution C，上下顛倒均勻混合；

8.12000 rpm離心1min；

9.先棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液（無色下層）移入預(yù)先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中，12000rpm離心1min； 注：有機(jī)相（上層）請務(wù)必除盡，否則會阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上；

10.棄Filter Cup，在濾液中加入450μl的DB Buffer，混合均勻；

11.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

12.將上述操作11的混合液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

13.將500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

14.將700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液； 注：請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份；

15.重復(fù)操作步驟14；

16.將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸水或Elution Buffer，室溫靜置1min； 注：把水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率

17.12000rpm離心1min洗脫DNA。

1.4.3 DNA濃度和純度的測定 其步驟為：

1.打開儀器DU800紫外/可見分光光度計后部（電源處）的開關(guān)，指示燈亮；

2.打開儀器輔助電腦，雙擊進(jìn)入DU-800軟件的主界面，此時儀器自檢；

3.待檢測完成后，點(diǎn)擊\"Continue\"進(jìn)入操作界面；

4.點(diǎn)擊\"UV\"打開紫外燈，此過程中會顯示\"UV LAMP IS WARMING\"，從黃色的UV燈不閃動開始需預(yù)熱20min左右，才能開始下一步操作；

5.向石英杯內(nèi)加入對照樣本（DNA提取中用到的無菌去離子水），放入池架中，點(diǎn)擊軟件中的\"BLANK\"按鈕，設(shè)置一個空白對照（加樣過程中槍頭不能碰到樣品槽透明面）；

6.取出石英杯，吸去對照樣本，將樣品（9月22日提取DNA樣品）以1：3（50ul樣品：150ul去離子水）比例充分混勻，加入石英杯并點(diǎn)擊軟件界面的\"GO\"按鈕，讀出OD值（A260，A280），記錄結(jié)果；

7.打開杯蓋，取出樣品槽，吸除液體，并用無菌去離子水洗滌三遍（每測一個樣品后都需進(jìn)行此操作），放回杯盒中；

8.關(guān)閉DU-800軟件，此時軟件提示：\"是否關(guān)閉燈\"，若短時間內(nèi)不用，請點(diǎn)擊\"YES\"關(guān)閉， 關(guān)閉電腦后再關(guān)閉儀器后部電源。

1.5 ICAN擴(kuò)增的方法和步驟 ICAN反應(yīng)體系參考Hiroyuki Mukai[8]，反應(yīng)體積25μL，反應(yīng)體系成分為：2mM IF3、2 mM IB3、0.5U TLiRNaseH II、2.75U BcaBEST DNA聚合酶、32mM Hepes-KOH buffer（PH 7.8）、0.5 mM dNTPs、100 mM KAc、4 mM Mg（Ac）2 、0.11%BSA、1%DMSO、100ng DNA模板，不足25μL部分用無菌去離子水補(bǔ)足。離心（5000rpm，1min）混勻，63℃等溫擴(kuò)增1h。將陽性和陰性對照于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在生物凝膠成像分析儀（BIO-RAD）下觀察結(jié)果。

1.6 使用PCR緩沖液進(jìn)行invA基因的恒溫擴(kuò)增 只用Takara Ex Taq buffer代替Hepes-KOH buffer（PH 7.8），其他的反應(yīng)液組成及操作步驟都與ICAN擴(kuò)增相同

2 結(jié)果

2.1不同溫度下鼠傷寒沙門菌的ICAN反應(yīng) 對ICAN反應(yīng)溫度的初步試驗(yàn)，得到反應(yīng)溫度為62.8℃時擴(kuò)增效率較好（見圖1）。

圖1 不同溫度下84年鼠傷寒沙門菌的ICAN實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖

注：1.59.6℃，2.61.1℃，3.62.8℃，4.64.7℃，5.68.5℃，6.70.1℃，7.72.2℃，8.陰性對照

2.2鼠傷寒沙門菌的ICAN反應(yīng)

圖2 不同年份鼠傷寒沙門菌的ICAN實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖

注：1.06年鼠傷寒沙門菌（N-06），2.84年鼠傷寒沙門菌（N-84），3.95年鼠傷寒沙門菌（N-95），4.陰性

2.3用Takara Ex Taq buffer代替的恒溫擴(kuò)增情況 使用Takara Ex Taq buffer 代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）時，對反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、TLiRNaseH II濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到反應(yīng)條件為：擴(kuò)增溫度55℃、Mg2+濃度為100mM、TLiRNaseH II為0.5u時條帶最亮。

圖3 沙門氏菌和其它腸桿菌科細(xì)菌恒溫擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果圖（緩沖液用Takara Ex Taq buffer代替）

注：1.鼠傷寒沙門菌（N-84），2.鼠傷寒沙門菌（N-95），3.鼠傷寒沙門菌（N-06）4.鴨沙門菌（W-1），5.腸炎沙門菌（W-2），M.marker，6.陰性對照，7.耶爾森菌（W-3）8.陰溝腸桿菌（W-4）9.福氏志賀菌（W-5），10. 奇異變形桿菌（W-6），11.大腸桿菌（W-7）

3 討論

ICAN是日本學(xué)者Hiroyuki Mukai[1]等人于2007年發(fā)明的一種核酸恒溫擴(kuò)增新技術(shù)。該方法使用一對5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物，耐熱的RNaseH酶和具有鏈取代活性的BcaBEST DNA聚合酶，通過多引物反應(yīng)和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)兩個機(jī)理實(shí)現(xiàn)等溫條件下基因快速擴(kuò)增，具有擴(kuò)增反應(yīng)快（只需1個小時）、靈敏度高（PCR所要求的DNA量的1/5對ICAN來說已足夠了）、特異性強(qiáng)、不需要昂貴的儀器（普通電熱恒溫水浴鍋即可）等優(yōu)點(diǎn)。ICAN的高效率得益于三個關(guān)鍵因素。第一個因素是嵌合引物可以高效地與模板DNA雜交形成dDNA-引物復(fù)合體。與PCR不同，嵌合引物不需要與互補(bǔ)模板鏈競爭以獲得靶模板鏈。在PCR中，引物與互補(bǔ)模板鏈的競爭是DNA擴(kuò)增反應(yīng)的限制因素，尤其是在DNA擴(kuò)增的后期階段[10]。第二個因素是由于RNaseH的作用，從同一模板上同時進(jìn)行的反應(yīng)可以達(dá)到PCR的兩倍或更高倍數(shù)。這是因?yàn)?，RNaseH可以在DNA-RNA嵌合引物上切開每一個RNA殘基的5'端，繼而引導(dǎo)模板鏈的擴(kuò)增反應(yīng)。第三個因素是由Bca BEST DNA聚合酶引導(dǎo)的多引物反應(yīng)與RNaseH和嵌合引物共同作用。在ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖像中，可以看到三條特異性條帶：最大的條帶含有兩條引物序列；中間大小的條帶含有其中的一條引物序列；最小的條帶不含引物序列。基于ICAN的高效率，我們可以在需要提供大量已知DNA序列作為模板的情況下采用ICAN，這是ICAN優(yōu)于其他擴(kuò)增方法的一個很大的方面。因?yàn)镻CR所要求的DNA量的1/5對于ICAN來說已足夠了。由于ICAN采用恒溫擴(kuò)增系統(tǒng)，所以我們可以簡單地增加反應(yīng)液的體積而不需改變反應(yīng)條件。目前為止，已經(jīng)證實(shí)當(dāng)反應(yīng)體積從50ul增加到5ml而不改變反應(yīng)條件時，每體積反應(yīng)液的效率是相同的。但是PCR要求精確的溫度循環(huán)，在反應(yīng)中就很難達(dá)到這一點(diǎn)。我們期待著ICAN的這一特性可以在\"DNA產(chǎn)業(yè)\"開啟一片新天地[9]。

侵襲蛋白普遍存在于沙門氏桿菌表面[11]，它決定沙門氏桿菌的侵襲力，是毒力決定因子。編碼侵襲蛋白的基因包括invA，invB，invC，invD和invE等。Rahn[12]等以侵襲蛋白基因（invasion protein A，invA）為目的基因，對630種沙門氏桿菌（包括100多種血清型）和142種非沙門氏桿菌（包括21個菌屬）進(jìn)行檢測，結(jié)果除2個利齊菲爾德沙門氏桿菌（S.1itchfield）和2個山夫登堡沙門氏桿（S.senftenberg）外，其他沙門氏桿菌均檢出陽性，而142種非沙門氏桿菌中沒有1種菌擴(kuò)增出目的條帶。因此他首次提出invA基因適于做PCR 檢測沙門氏桿菌的靶基因。我們對該擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，在GenBank已公布的序列里，只有沙門菌具有該擴(kuò)增片段，大腸桿菌、福氏志賀菌、耶爾森氏菌和陰溝腸桿菌等其他腸桿菌科細(xì)菌均沒有該擴(kuò)增片段。另外，使用引物分析軟件對擴(kuò)增此片段的兩條引物F3：5'-GGCGATATTGGTGTTTATGGGG和B3：5'-AACGATAAACTGGACCACGG分析，其Tm值與Hiroyuki Mukai[1]等人研究中引物的Tm很接近，因此本項(xiàng)研究選擇invA基因作為檢測沙門菌屬目的基因。invA基因全長244bp，根據(jù)ICAN的反應(yīng)機(jī)理，結(jié)果應(yīng)得到一條244bp的片段（含兩條引物序列）；一條224bp或222bp的片段（只含其中一條引物序列）；另一條202bp的片段（不含引物序列）。

反應(yīng)溫度對擴(kuò)增特異性的影響--使用PCR擴(kuò)增時，可以通過調(diào)節(jié)退火溫度得到最佳反應(yīng)條件。因此，可以設(shè)想：擴(kuò)增溫度也是影響ICAN反應(yīng)的一個重要因素。如圖1所示：鼠傷寒沙門菌DNA在7個不同的溫度下擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳顯像可見，當(dāng)擴(kuò)增溫度為61.1℃或62.8℃時，在目的片段大小處有條帶，擴(kuò)增效果較好。因此，我們可以通過調(diào)節(jié)擴(kuò)增溫度對ICAN進(jìn)行優(yōu)化。

ICAN反應(yīng)體系組成對擴(kuò)增結(jié)果的影響--觀察圖2，不同的鼠傷寒沙門菌ICAN擴(kuò)增后都在目的條帶附近有連續(xù)的條帶，但并不是三條清晰的條帶。這個問題應(yīng)該可以通過改變反應(yīng)條件加以解決。但是我們在嘗試了很多次之后，結(jié)果并不理想，當(dāng)使用與2.2完全相同的實(shí)驗(yàn)條件做重復(fù)試驗(yàn)時，也沒有重復(fù)出圖2所示的結(jié)果。因此，我們猜想：首先，自己配制的緩沖液穩(wěn)定性不夠好，所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性一直不好。另外，研究中用到的KAc、Mg（Ac）2也是自己配制的。最后，因?yàn)槲覀儫o法購得TLiRNaseH酶，所以就用TLiRNaseH II代替了。這兩類酶在特性方面的差異可能也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

用PCR緩沖液代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）做ICAN--由于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直不穩(wěn)定，猜測是緩沖液不好的緣故。保持原實(shí)驗(yàn)條件不變，換用Takara Ex Taq buffer做ICAN，結(jié)果沙門菌都在稍大于8023bp處擴(kuò)增出了單條片段，而陰性和其他腸桿菌科細(xì)菌都沒有該片段，如圖3。AbouHaidar[13]對Mg2+的催化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于55℃或PH值大于7.5時，Mg2+催化RNA水解的活性增強(qiáng)。我們對此反應(yīng)的Mg2+濃度優(yōu)化，得出當(dāng)Mg2+濃度為100mM時效果較好。對反應(yīng)的擴(kuò)增溫度和TLiRNaseH II優(yōu)化，得到擴(kuò)增溫度55℃、TLiRNaseH II為0.5u時擴(kuò)增效果較好。對沙門菌，如副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、鴨沙門菌及腸炎沙門菌等，使用blast對IF3、IB3兩條引物比對后，發(fā)現(xiàn)各菌都沒有擴(kuò)增出大于8000bp片段的可能性。因此我們猜想，實(shí)驗(yàn)得到的大于8023bp的片段是多條小片段疊加的結(jié)果，為了驗(yàn)證這種可能性，最好對這條片段測序。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hiroyuki Mukai，Takashi Uemori，Osamu Takeda，et al. Highly Efficient Isothermal DNA Amplification System Using Three Elements of 5'-DNA-RNA-3'Chimeric Primers，RnaseH and Strand-displacing DNA Polymerase[J].J Biochem，2007，142（2）：273-281.

[2]Kamenskaia IN， Markina EIu， Chernysheva NA， et al. Biological characteristics of Salmonella typhimurium obtained from different sources 1975-1980[J].Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，1983，（3）：26-32.

[3] Mead， P. S.， L. Slutsker， V. Dietz， L F. MeCalg， J. S. Bresee，et al. 1999. Food-related illness and death in the United States[J].Emerg. Infect Dis，5：607-625.

[4]Nassjb TA，El-DinMZ，El一Sharoud WM.Assessment of the presence of Salmonella spp.in Egyptian dairy products using various detection media[J].Lett Appl Microbiol，2003，37（5）：405-409.

[5]Pangloli P，Dje Y，Oliver SP，et al.Evaluation of methods for recovery of Salmonella from dairy cattle，poultry，and swine farms[J].Food Prot，2003，66（11）：1987-1995.

[6]Valentin-Bon IE，Brackett RE，SEO KH，et al.Preenrichment versus direct selective agar plating for the detection of Salmonella enteritidis in shell eggs[J].Food Prot，2003，66（9）：1670-1674.

[7]Cocolin L， Manzano M， Cantoni C， Comi G.Use of polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis to directly detect and identify Salmonella typhimurium in food[J].J Appl Microbiol，1998， 85（4）：673-677.

[8]Bohaychuk VM， Gensler GE， McFall ME， et al.A real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and food-animal matricest[J].J Food Prot，2007，70（5）：1080-1087.

[9]Uemori T，Mukai H，Takeda O，et al.Investigation of the Molecular Mechanism of ICAN a Novel Gene Amplification Method[J].J Biochem，2007，142（2）：283-292.

[10] Odelberg， S.J.， Weiss， R.B.， Hata， A.， and White， R.Template-switching during DNA synthesis by Thermus aquaticus DNA polymerase I[J].Nucleic Acids Res，2005，23：2049-2057

[11] Kwag SI， Bae DH， Cho JK，et al.Characteristics of persistent Salmonella Enteritidis strains in two integrated broiler chicken operations of Korea[J].J Vet Med Sci，2008，70（10）：1031-1035.

[12]Rahn K， De Grandis SA， Clarke RC， et al.Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella[J].Mol CellProbes.1992，6（4）：271-279.

[13]AbouHaidar， M.G. and Ivanov， I.G. Non-enzymatic RNA hydrolysis promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions[J].Verlag der Zeitschrift fur Naturforschung，1999，54：542-548.

編輯/安樺