肺炎鏈球菌的檢驗(yàn)技術(shù)探析

摘要：肺炎鏈球菌臨床上容易引起大葉性肺炎，對(duì)人體造成較大的危害，特別是有莢膜的肺炎球菌可以抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬，細(xì)菌可以在寄主體內(nèi)大量繁殖。而由于臨床長期藥物使用的不規(guī)范，造成了肺炎鏈球菌的耐藥性變化，致使多種藥物治療效果降低或無效，臨床對(duì)肺炎鏈球菌檢驗(yàn)主要為明確肺炎鏈球菌的類型，并依據(jù)不同的類型進(jìn)行治療的數(shù)據(jù)支持，意義重大。本次研究主要為肺炎鏈球菌的檢驗(yàn)技術(shù)和進(jìn)展分析，探討近年來肺炎鏈球菌檢驗(yàn)方法和手段，并對(duì)肺炎鏈球菌的耐藥性和分子流行病學(xué)的研究方法進(jìn)行總結(jié)，具有一定的臨床參考意義。

關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌；檢驗(yàn)技術(shù)；進(jìn)展；耐藥性分析

肺炎鏈球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）簡稱肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分別在法國和美國分離出來。肺炎球菌菌體似矛頭，呈短鏈狀排列或成雙排列的球菌，革蘭氏陽性，絕大多數(shù)兼性厭氧，偶有專性厭氧，肺炎鏈球菌的主要致病物質(zhì)是肺炎球菌溶血素和莢膜[1]。近年來，越來越多的國家和地區(qū)出現(xiàn)耐藥性肺炎鏈球菌菌株的報(bào)道，嚴(yán)重威脅著肺鏈感染的臨床治療，已成為一個(gè)嗆待解決的健康問題。

1藥敏試驗(yàn)

1.1微量稀釋法 該法是美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的肺炎鏈球菌藥敏試驗(yàn)的參考方法。該法主要使用經(jīng)過離子校正的M-H肉湯+2%～5%的溶血馬血作為培養(yǎng)基的，然后將抗生素稀釋后加人培養(yǎng)基中。將在羊血平板上的菌落制備菌液，以0.5 濁度分裝微量板。在35℃普通條件下培養(yǎng)24h后，人工判斷結(jié)果。具體 MIC見NCCLS的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2紙片擴(kuò)散法 NCCLS推薦使用的紙片法藥敏試驗(yàn)，主要使用羊血平板，以0.5濁度的菌液接種平板。對(duì)于臨床分離株的藥敏試驗(yàn)，CO2是必備的環(huán)境。平板應(yīng)于35℃條件下在5%的CO2中培養(yǎng)24h后進(jìn)行測(cè)量，從正面量取。抑菌環(huán)的大小和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)詳見NCCLS的規(guī)定。紙片擴(kuò)散法的優(yōu)點(diǎn)是簡單方便，對(duì)非β-內(nèi)酞胺藥物的重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較高，但是在應(yīng)用于青霉素和頭抱類抗生素時(shí)準(zhǔn)確性明顯降低[3]。

2肺炎鏈球菌的耐藥性檢驗(yàn)

目前有很多實(shí)驗(yàn)室在對(duì)血液、腦脊液等體液分離得到的肺炎鏈球菌耐藥性測(cè)定時(shí)，只檢測(cè)青霉素的耐藥性。事實(shí)證明，多重耐藥和對(duì)三代頭抱耐藥的肺炎鏈球菌越來越多，因此，NCCLS已經(jīng)明確要求，從腦膜炎者分離出來的肺炎鏈球菌必須做青霉素、頭孢曲松或者頭孢他啶的MIC，另外還應(yīng)檢測(cè)對(duì)萬古霉素的耐藥性。對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外分離而來的肺鏈球菌， 則首先應(yīng)該選用苯唑西林來檢測(cè)其是否對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。若抑菌環(huán)>200 mm，證明其對(duì)青霉素和β-內(nèi)酞胺類藥物敏感物耐藥性；若抑菌環(huán)<19 mm，則須進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)青霉素、頭孢曲松或頭孢他啶的耐藥性。同時(shí)，對(duì)于非中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的菌株還應(yīng)進(jìn)行紅霉素、復(fù)方磺胺藥物敏感性的測(cè)定。阿奇霉素、克拉霉素等新大環(huán)內(nèi)脂類藥物 的敏感性則可通過紅霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果推知，而不必進(jìn)行常規(guī)的檢測(cè)[4]。自1965年波士頓報(bào)道了首例耐青霉素肺炎鏈球菌以來，世界各地不斷有耐藥性肺炎鏈球菌的菌株被發(fā)現(xiàn)，雖然各地報(bào)道的耐藥率和檢出率不盡相同，但是一個(gè)總的趨勢(shì)就是，肺炎鏈球菌耐藥性正在逐年上升。臨床上和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該特別注重肺炎鏈球菌耐藥性的檢測(cè)和使用抗生素進(jìn)行治療。

3微生物學(xué)檢查

3.1標(biāo)本根據(jù)感染部位不同采取不同標(biāo)本，如痰液、膿液、血液、腦脊液等。

3.2直接涂片鏡檢對(duì)痰、膿或腦脊液沉淀物標(biāo)本，可涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)典型的成雙排列、有莢膜的革蘭陽性球菌，結(jié)合臨床癥狀可做初步診斷。

3.3分離培養(yǎng)與鑒定將痰或膿液直接接種于血瓊脂平板上，37℃孵育24h后，挑選溶血的可疑菌落做進(jìn)一步鑒定。血液及腦脊液先在血清肉湯培養(yǎng)基中增菌后，接種到血瓊脂平板上分離培養(yǎng)并鑒定。

3.4肺炎鏈球菌的鑒定主要應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵和奧普托辛試驗(yàn)最為常用。必要時(shí)可做小鼠毒力試驗(yàn)。在上述試驗(yàn)中，肺炎鏈球菌均為陽性，而 甲型溶血性鏈球菌為陰性。

4肺炎鏈球菌型別鑒定

4.1莢膜腫脹試驗(yàn) 亦稱為Quellug試驗(yàn)。新鮮標(biāo)本懸液與等量不稀釋的肺炎球菌分型診斷血清混合后，覆以蓋玻片，油鏡下觀察。標(biāo)本中肺炎球菌若與同型免疫血清相遇，莢膜將顯著增大。

4.2凝集試驗(yàn) 將可疑肺炎球菌與已知標(biāo)準(zhǔn)分型血清做玻片凝集試驗(yàn)，若細(xì)菌凝集成堆，為同型肺炎球菌。

5分子流行病學(xué)研究方法

近年來，由于傳統(tǒng)的細(xì)菌藥敏試驗(yàn)和英膜血清學(xué)分型具有一定的局限性，分子流行病學(xué)研究方法被作為一種重要的補(bǔ)充手段用于肺炎鏈球菌感染和耐藥性的分析中。主要包括以下三個(gè)方面，①BOX-PCRP：它是肺炎鏈球菌染色體上的一段重復(fù)序列，呈現(xiàn)高度保守性，由三個(gè)亞單位組成，分別為A、B、C。其中以BOXA1為引物的 PCR 檢測(cè)法被廣泛應(yīng)用。②核酸分子雜交：該技術(shù)又被稱為核糖體分型。首先利用限制性內(nèi)切酶切割DNA，電泳后將DNA1轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，使其與被標(biāo)記的BOX片段進(jìn)行雜交，從而比較DNA片段的同源性。③限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）：該法與上法有類似之處，首先利用限制性內(nèi)切酶切割 DNA，經(jīng)電泳分離后，直接比較各菌株的 DNA 指紋，從而判斷其同源性[5]。

參考文獻(xiàn)：

[1]李杰，俞桑潔，揚(yáng)水弘.肺炎鏈球菌疾病及其預(yù)防[J].中國計(jì)劃免疫， 2009，5（3）：176-179.

[2]陳軍，丁云芳，陶云珍.肺炎鏈球菌PBP1a、PBP2b基因突變分析[J].江蘇醫(yī)藥，2005，11（11）：34-36.

[3]糜祖煌，丁云芳.肺炎鏈球菌耐藥基因檢測(cè)[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2003，7（07）：75-78.

[4]丁云芳，張建華，糜祖煌.兒童肺炎鏈球菌分離株青霉素、紅霉素耐藥性與耐藥相關(guān)基因研究[J].中華兒科雜志，2015，5（05）：29-31.

[5]丁云芳，糜祖煌，秦玲.肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺酶TEM基因的發(fā)現(xiàn)[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2012，12（12）：135-137.編輯/孫杰