八角茴香油對變形鏈球菌細菌生物膜的影響

摘要：目的 探討不同濃度的八角茴香油對變形鏈球菌抗菌效果及對其生物膜形成的抑制能力。方法 ①通過抑菌實驗和殺菌實驗測定八角茴香油對變形鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）；②配制不同濃度的八角茴香油（1.25%、2.5%、5%、10%），作用于培養(yǎng)24h形成成熟生物膜的變形鏈球菌，利用AO/EB熒光染料染色，在激光共聚焦顯微鏡掃描生物膜并分析活菌與死菌比例。結(jié)果 八角茴香油對變形鏈球菌有良好的抑制作用，MIC為5%，MBC為10%。不同濃度的八角茴香油對變形鏈球菌生物膜的形成均有一定破壞作用，5.0%、10%濃度八角茴香油對變形鏈球菌生物膜破壞最大，活菌與死菌比例分別為（0.192±0.011）、（0.062±0.004）。結(jié)論 八角茴香油能夠有效的抑制并殺滅變形鏈球菌，而且能抑制其生物膜的形成。

關(guān)鍵詞：細菌；八角茴香油；生物膜；變形鏈球菌

八角茴香（IlliciumverumHook.f.）簡稱八角，俗稱大茴香、大料[1]，木蘭科八角屬。八角茴香油（StarAniseOil）提取自八角茴香的果實或枝葉。其在醫(yī)學(xué)上有廣泛的作用，如良好的抗氧化[2]、抑菌[3]、殺蟲[4]、鎮(zhèn)痛[5]和升高白細胞[6]的作用，且毒性作用小、副作用少。細菌生物膜（bacterialbiofilm）是細菌為適應(yīng)環(huán)境生長而附著在材料表面形成的一種群落，與浮游生物明顯不同的是它能增加微生物對抗生素的抵抗能力，還可誘導(dǎo)耐藥機制的產(chǎn)生。

目前國內(nèi)對于八角茴香油的抑菌研究主要集中在殺菌，抑菌實驗，但對生物膜的抑制作用的相關(guān)研究甚少。本研究主要通過在體外復(fù)制變形鏈球菌生物膜模型，利用激光共聚焦顯微鏡觀察八角茴香油對生物膜的作用，期望為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 ①八角茴香油購買于廣州晶晶生物科技有限公司；②變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175購買于中國微生物菌種保藏中心；③培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基，購買于青島日水生物科技有限公司；④激光共聚焦顯微鏡（Olympus），高壓蒸汽滅菌器（SANYO），恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠），振蕩搖床（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠THZ-D）。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備 菌種活化培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并用10倍稀釋法將菌液稀釋計數(shù)，配置菌懸液濃度分別為107cfu/ml、1×105cfu/ml，標(biāo)準(zhǔn)菌懸液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2八角茴香油MIC的測定 采用試管二倍稀釋法，測定八角茴香油抑制變形鏈球菌生長的最小抑菌濃度。八角茴香油倍減梯度濃度系列為30%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%，共6個濃度試管，充分震蕩混勻，使各管中含菌量為106cfu/ml，分別設(shè)生理鹽水陰性對照以及相應(yīng)濃度的酒精對照。37℃培養(yǎng)24h后，從各管肉湯中取出培養(yǎng)液0.1ml，分別涂布平板，培養(yǎng)24h后，觀察有無細菌生長，有為陽性，無為陰性，以無細菌生長的最小藥物濃度為MIC。

1.2.3八角茴香油MBC的測定 將MIC實驗各管稀釋2倍后繼續(xù)37℃培養(yǎng)24h后，從各管肉湯中取出培養(yǎng)液0.1ml，分別涂布平板，培養(yǎng)24h后，觀察有無細菌生長，有為陽性，無為陰性，以無細菌生長的最小藥物濃度為MBC。

1.2.4八角茴香油對變形鏈球菌生物膜形成的影響 6孔板中浸入經(jīng)濃硫酸和75%酒精處理的滅菌蓋玻片，每孔加入0.2ml菌懸液（1×105cfu/ml）和4.8ml培養(yǎng)液，37℃條件下培養(yǎng)24h，每12h更換培養(yǎng)液。棄掉培養(yǎng)液，加入相應(yīng)濃度的八角茴香油5ml，以生理鹽水和5%乙醇作為對照組。37℃條件下培養(yǎng)24h，將染液AO/EB按1∶1混合均勻，取300ul混合染液加入各孔內(nèi)，室溫避光染色15min，用PBS緩沖液徹底清洗掉殘余染料，激光共聚焦觀察生物膜形態(tài)變化，波長488nm/543nm，并記錄其平均熒光強度。

2 結(jié)果

2.1八角茴香油的MIC和MBC 八角茴香油的MIC和MBC分別為5%和10%，而酒精對照組并不能有效的抑制變形鏈球菌的生長，說明八角茴香油能有效抑制變形鏈球菌的生長。

2.2八角精油對成熟菌體生物膜抑制作用 激光共聚焦顯微鏡下可見生物膜中死菌在相應(yīng)的激光激發(fā)條件下呈紅色，活菌呈綠色。由圖1和表1觀察可得：空白組的生物膜形成最好，大量的變形鏈球菌聚集成片；當(dāng)精油濃度較低時，細菌生物膜依然較完整，但是死菌比例（紅色熒光強度）明顯升高，平均熒光強度（活菌/死菌）降至（0.653±0.017）及（0.712±0.042）；隨著精油濃度的升高（5%時），大量的細菌自生物膜脫落，細菌密度顯著降低，僅剩少量細菌粘附在玻片上；經(jīng)10%精油作用后，生物膜基本消失，只剩少量死菌粘附。

3 討論

本文主要研究了八角茴香油對變形鏈球菌的抑菌能力及對其生物膜的抑制和清除作用。實驗結(jié)果表明，八角茴香油對變形鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）為5%，當(dāng)濃度達到10%時，可有效的殺滅變形鏈球菌。由八角茴香油抑制變形鏈球菌生物膜的結(jié)果顯示，低濃度（1.25%、2.5%）的八角茴香油就可殺滅生物膜上的細菌，但生物膜依然較完整；當(dāng)濃度更高（5.0%、10.0%）時，可有效的抑制并清除已經(jīng)形成的生物膜。以上實驗均表明了八角茴香油能夠有效的抑制并殺滅變形鏈球菌，而且可以抑制并清除變形鏈球菌的生物膜。八角茴香油是日常生活的常用調(diào)味料，方便易得，成本低，天然無毒，因此具有潛在的應(yīng)用前景。

參考文獻：

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[2]付敏東，李成歡.八角茴香油的提取工藝及抗菌、抗氧化性作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，08（34）：29-31.

[3]梅林，賴容.八角茴香抑菌活性試驗研究[J].激光雜志，2010，31（3）：97-97.

[4]趙鴻崢，駱驕陽，劉秋桃，等.藥用植物揮發(fā)油驅(qū)蚊作用的研究進展[J].中國中藥雜志，2016（1）.

[5]黃麗貞，楊玲玲，鄧家剛，等.八角茴香水提物對實寒證大鼠的影響[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015（5）：971-975.

[6]連錦花，孫果宋.八角的研究進展[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2010，39（3）：31-33.編輯/倪冰冰