淺談心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其進(jìn)展

摘要：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中最常用和最重要的技術(shù)之一，本文就心肌細(xì)胞的經(jīng)典培養(yǎng)模型和新進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；三維培養(yǎng)

Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.

Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，也是疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的基礎(chǔ)。因此，細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究中最重要的環(huán)節(jié)。在體細(xì)胞研究存在諸多局限性，如成本高、影響因素復(fù)雜、可重復(fù)性差等，為解決這些困難，離體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運而生。細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是細(xì)胞在離體條件下的克隆性增殖過程，具有成本低、周期短、數(shù)量多、單克隆性、條件可控等諸多優(yōu)勢?？梢哉f，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中最基礎(chǔ)最重要的技術(shù)之一。本文僅就心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其進(jìn)展作一淺述。

1經(jīng)典心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型

鼠心肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞培養(yǎng)最常用的材料，包括未成熟心肌細(xì)胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌細(xì)胞（adult cardiomyocyte，ACM）兩種。ICM培養(yǎng)技術(shù)是由Harary等在1960年建立的[1]，經(jīng)過后人改進(jìn)形成了經(jīng)典的Simpson培養(yǎng)法[2]。ICM主要來源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d內(nèi)的乳鼠心室肌細(xì)胞最常用。ACM相互間有大量閏盤和外基質(zhì)緊密相連，又沒有分裂增殖能力，其分離和培養(yǎng)比ICM要困難得多，直到上世紀(jì)60年代才通過逆行主動脈生物酶灌注法分離出單個ACM[3]，但是當(dāng)時ACM因置于生理濃度鈣溶液中而迅速死亡，這個現(xiàn)象被稱為\"鈣反常（calcium paradox）\"[4]。1976年， Powell首次報道了分離活性的鈣耐受成熟心室肌細(xì)胞的技術(shù)[5]。Jacobson則在1977年首次成功培養(yǎng)出ACM。

經(jīng)典的心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括細(xì)胞分離、純化、接種、培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)等步驟。

1.1心肌細(xì)胞的分離 ICM的分離一般采用組織塊消化法，即將心肌組織剪成小碎塊，然后加入消化分離液將心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞分開。消化分離液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、膠原酶和透明質(zhì)酸酶[6]，其中胰蛋白酶作用最強(qiáng)，但也最容易損傷心肌細(xì)胞；膠原酶作用溫和；透明質(zhì)酸酶作用弱，不宜單用。目前多采用兩種或三種消化酶聯(lián)合，以胰蛋白酶和膠原酶Ⅰ聯(lián)合最常用。消化分離液中可加入牛血清白蛋白以保護(hù)心肌細(xì)胞，提高細(xì)胞質(zhì)量[7]；也可加入脫氧核糖核酸酶，防止DNA聚積在心肌組織表面而影響分離效率[6，8]；乙二胺四乙酸（EDTA）是一種常用的螯合劑，能吸附溶液中的Ca2+、Mg2+等金屬離子而促進(jìn)細(xì)胞分離（細(xì)胞間粘附因子發(fā)揮作用需有上述金屬離子存在），而且對細(xì)胞功能影響極小[9]，故加入EDTA可進(jìn)一步提高分離效率，但是EDTA不能被血清中和，后續(xù)必須洗凈，以免影響細(xì)胞貼壁。心肌細(xì)胞分離后加入含胎牛血清的培養(yǎng)液以終止消化，即得到初步的心肌細(xì)胞懸液[10]。在實際操作中，消化分離液的酶類、酶濃度、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及時間長短等因素相互影響、相互制約，需要反復(fù)摸索才能得到最佳方案。

ACM的分離方法相對更復(fù)雜，主要有組織浸泡法、貼塊培養(yǎng)法和離體心臟生物酶灌注法。效果最好和最常用的是離體心臟生物酶灌注法，又稱為Langendorff離體心臟灌注法，是Oscar Langendorff在1895年發(fā)明的[11]，經(jīng)過預(yù)熱、消毒、洗滌、經(jīng)升主動脈逆灌消化酶溶液循環(huán)灌流、震蕩釋放心肌細(xì)胞和梯度復(fù)鈣等步驟，最終得到活性的單個ACM[12，13]。

1.2心肌細(xì)胞的純化 心肌組織由多種細(xì)胞構(gòu)成，以心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量最多。在體外培養(yǎng)的特殊環(huán)境中，非心肌細(xì)胞對心肌細(xì)胞的影響是巨大的，主要表現(xiàn)在：①非心肌細(xì)胞貼壁和生長增殖能力更強(qiáng)，容易成為優(yōu)勢細(xì)胞，通過空間競爭、分泌抑制因子等機(jī)制影響心肌細(xì)胞的生長增殖和功能[14，15]；②非心肌細(xì)胞對干預(yù)因素的反應(yīng)與心肌細(xì)胞不同，影響實驗結(jié)果。因此，細(xì)胞分離后的純化是必要的。常用的純化方法有差速貼壁法和化學(xué)試劑法，主要是除去成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞：①差速貼壁法利用不同細(xì)胞貼壁速度的不同（心肌細(xì)胞貼壁較慢）進(jìn)行分離和純化。通過差速貼壁法純化的心肌細(xì)胞純度可達(dá)到90%以上[16，17]，且操作簡單、成本低、對心肌細(xì)胞影響小，但缺點是作用時間短，不能單獨用于長時間培養(yǎng)的實驗；②化學(xué)試劑法利用某些化學(xué)試劑對不同細(xì)胞的抑制強(qiáng)度不同來達(dá)到純化目的。5-溴脫氧尿嘧啶核苷可明顯抑制成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，而對心肌細(xì)胞影響小，是心肌細(xì)胞純化常用的試劑[18，19]?；瘜W(xué)試劑能夠持續(xù)起作用，但缺點是對心肌細(xì)胞可能具有潛在影響。在實際操作中，差速貼壁法和化學(xué)試劑法常聯(lián)用。

1.3心肌細(xì)胞接種和培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩種，后者更常用。心肌細(xì)胞常用的培養(yǎng)基有DMEM、M199、MEM、EMEM等。為了促進(jìn)細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)基中可加入促吸附因子（Ⅰ型膠原、Ⅵ型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等）；為了預(yù)防細(xì)菌污染，有時加入抗生素[20]。細(xì)胞密度是影響細(xì)胞生長、增殖、分化表型、生存時間等的重要因素，接種密度需根據(jù)實驗?zāi)康亩?，如果是為了觀察單個細(xì)胞的行為，密度宜較低，一般為1～2×105/mL；如果是為了獲取細(xì)胞產(chǎn)物，密度則宜較高，一般為5～6×105/mL[21]。接種在多孔培養(yǎng)板時，應(yīng)放棄周邊孔并加入空白培養(yǎng)基以避免\"邊緣效應(yīng)\"。

ACM的培養(yǎng)比較復(fù)雜，分為去分化法和快速吸附法兩種[22]。去分化法使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，研究表明[23]，通過該法培養(yǎng)的ACM在超微結(jié)構(gòu)、分子水平和電生理水平表型上都發(fā)生了\"去分化（dedifferentiation）（向胎兒表型的逆轉(zhuǎn)）\"，因此被稱為\"去分化法\"。去分化法的優(yōu)點是細(xì)胞存活時間較長，達(dá)數(shù)周到數(shù)月，缺點是發(fā)生了表型逆轉(zhuǎn)而且逆轉(zhuǎn)程度尚不明確[24]，也正因為如此，現(xiàn)在多采用快速吸附法?？焖傥椒ㄊ菍CM接種在經(jīng)促吸附因子預(yù)處理過的基質(zhì)上，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。ACM可在接種3 h內(nèi)吸附到培養(yǎng)基質(zhì)上，并且始終保持急性分離時的柱形、紋狀形態(tài)，也不會自發(fā)性收縮，尤其適用于分子生物學(xué)和電生理試驗[25]?？焖傥椒ǖ娜秉c是細(xì)胞存活時間較短，只有1～2 w。

1.4 ICM的傳代培養(yǎng) ICM具有分裂能力，為了調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，有時需要傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)實質(zhì)上是將原代細(xì)胞收集起來稀釋后重新接種和培養(yǎng)的過程。由于心肌細(xì)胞是貼壁生長的，傳代培養(yǎng)的關(guān)鍵是使細(xì)胞脫壁、分離成細(xì)胞懸液，分離方法主要有兩種：①生物酶法：加入低濃度（0.01%～0.05%）胰蛋白酶溶液使細(xì)胞分離；②機(jī)械法：通過吸管的刮吹使細(xì)胞分離。

2心肌細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)

經(jīng)典的心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型，細(xì)胞接種在二維基質(zhì)中，與在體的三維環(huán)境完全不同，勢必導(dǎo)致細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，影響科學(xué)研究的效果。所以，人們迫切需要一種既能盡量保留在體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特點、又具有體外培養(yǎng)優(yōu)勢的技術(shù)。隨著生物、材料、納米、組織工程等學(xué)科的快速發(fā)展，細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運而生了[26]。

劉霞等用三維的PLGA泡沫支架材料培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，觀察到心肌細(xì)胞形成了心肌組織樣結(jié)構(gòu)，超微結(jié)構(gòu)保持良好，代謝活性也較二維培養(yǎng)更高[27]。劉興茂等將乳鼠心肌細(xì)胞接種于鼠尾膠原膜三維支架中培養(yǎng)，并與二維培養(yǎng)作橫向比較，發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)的心肌細(xì)胞保持了良好的形態(tài)和功能[28]。Eschenhagen等將雞胚心肌細(xì)胞接種到膠原凝膠上，觀察到心肌細(xì)胞形成了可收縮的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29]。Hussain等將乳鼠心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共同接種于經(jīng)層粘連蛋白處理過的生物活性殼聚糖納米纖維三維支架中，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞能長期維持在體的形態(tài)和功能，形成同步化收縮[30]。

總之，心肌細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)還方興未艾，是未來的發(fā)展方向之一。

3結(jié)論

心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已走過半個多世紀(jì)的歷史，廣泛應(yīng)用于電生理、信號通路、細(xì)胞凋亡以及藥物安全性評價和新藥篩選等領(lǐng)域，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。同時，隨著三維培養(yǎng)、反義寡核苷酸和基因轉(zhuǎn)染等新技術(shù)手段的涌現(xiàn)，心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)又是歷久彌新、蒸蒸日上，必將為人類的健康事業(yè)更立新功。

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編輯/丁一