FAK在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達及其與診斷治療關(guān)系的研究

胃腸間質(zhì)瘤是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，由于基于腫瘤大小以及核分裂數(shù)的提出，單純的用良性和惡性定義胃腸間質(zhì)瘤已經(jīng)沒有任何的意義[1]。隨著診斷標準的精確化，以往多種消化道腫瘤在相關(guān)臨床診斷指標中均與GIST相同，應(yīng)歸屬于GIST[2]。胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)病和絲氨酸激酶的過度激活有關(guān)，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)GIST過表達CD117和DOG1，并且大多數(shù)病例具有C-Kit基因擴增現(xiàn)象[3]，KIT 或者PDGFRA基因的持續(xù)激活可以啟動細胞的過度增殖[4]。然而，在一些KIT 或者PDGFRA基因正常的GIST患者中，琥珀酸脫氫酶亞型SDHx（SDHA， SDHB， SDHC， and SDHD）也被證實發(fā)生了致病性突變[5]。GIST的發(fā)病也和細胞周期的紊亂有關(guān)，MDM2或者TP53發(fā)生突變，導(dǎo)致細胞周期調(diào)節(jié)紊亂，這種現(xiàn)象在高危險的胃腸間質(zhì)瘤中尤其常見[6]。除此以外，一些常見的胃癌致病的環(huán)境因素，諸如飲酒、不良飲食習(xí)慣亦可能成為胃腸間質(zhì)瘤的誘導(dǎo)因素[7]。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月～2015年10月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院行根治性手術(shù)的40例胃腸間質(zhì)瘤患者的臨床病理資料，見表1。2014年10月～2015年3月在我院行根治性手術(shù)的3例胃腸間質(zhì)瘤患者的臨床病理資料，所有入組患者病歷資料完整，手術(shù)前均未進行化療，避免由于放療導(dǎo)致的病理及其生理變化。所有研究對象術(shù)后病理診斷明確，均按照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）2010年出版的《AJCC癌癥分期手冊》（第2版）進行胃腸間質(zhì)瘤侵襲危險程度分期。

1.2免疫組化方法 免疫組織化學(xué)采用免疫學(xué)原理，將制好的切片經(jīng)過帶有標記的抗體孵育后顯色，以觀察相關(guān)的蛋白表達量。本課題中采用的是PH 6.0的檸檬酸鹽修復(fù)、DAB顯色的方法，用PBS代替一抗作為陰性對照。染色結(jié)束后，用蘇木素進行復(fù)染，以使顏色更加鮮艷。

1.3 Western-Bolt采用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用兔源抗FAK一抗（ abcam 40794），再用HRP標記的抗兔的二抗（WB150614）與一抗結(jié)合，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.4結(jié)果判讀標準 免疫組織化學(xué)染色評分系統(tǒng)采用德國半量[8]評分：在光學(xué)顯微鏡下在200×及400×下觀察切片面積及陽性染色強度。顯微鏡下觀察到胞漿和（或）胞核呈棕色或黃色判定為陽性著色，陽性細胞數(shù)比率<10%記0分，1分為10%～25%，2分為25%～50%，3分為50%～75%，4分為>75%，與陰性對照比較著色強度分四級：0、1、2、3分，無染色為陰性 （0分），細胞漿和（或）細胞核呈淡棕色為弱陽性 （1分），呈棕色者為陽性（2分），深棕色為強陽性 （3分），然后根據(jù)陽性細胞數(shù)比率和染色強度得分的乘積將組織染色結(jié)果進行評分分級：0～1為陰性（-），2～4為弱陽性（+），5～8為陽性（++），9～12為強陽性（+++）。

1.5統(tǒng)計方法 使用SPSS 20.0（IBM）統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有統(tǒng)計的資料均采用雙側(cè)檢驗，P值<0.05將認為所檢驗的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗數(shù)據(jù)包括計數(shù)資料和計量資料。免疫組化檢測FAK表達情況的實驗總所獲得的計數(shù)資料采用卡方檢驗比較二者之間構(gòu)成比的差異。

2 結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果

2.1.1 不同侵襲危險程度組FAK的表達水平 胃腸間質(zhì)瘤組織中存在FAK的表達，定位于間質(zhì)的細胞漿，不同侵襲危險程度組FAK表達水平不同，見圖1，統(tǒng)計學(xué)分析組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.827，P<0.01）。

圖1 不同侵襲危險程度組FAK免疫組化染色圖片，A為高危險度GIST，B為中危險度GIST，C為低危險度GIST，D為極低危險度GIST

2.1.2 胃腸間質(zhì)瘤組織中FAK的表達與胃腸間質(zhì)瘤患者性別和年齡的關(guān)系 將FAK的表達水平與胃腸間質(zhì)瘤患者的性別和年齡分組進行比較，年齡（χ2=0.131，P>0.05），性別（χ2=0.162，P>0.05），差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.1.3胃腸間質(zhì)瘤組織中FAK的表達量與胃腸間質(zhì)瘤相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系 使用統(tǒng)計學(xué)的方法分析胃腸間質(zhì)瘤的腫瘤部位、侵襲危險程度和細胞類型與FAK表達水平的關(guān)系，統(tǒng)計結(jié)果顯示：FAK的表達量在不同級別的胃腸間質(zhì)瘤中（P=0.08）、腫瘤部位（P=0.664）和細胞類型（P=0.093）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

由于在侵襲危險程度中我們采用了不同級別的分類方法，并且其表達差異的P值非常接近0.05，所以我們對不同級別的胃腸間質(zhì)瘤按照AJCC的胃腸間質(zhì)瘤劃分方法進行進一步的細分，得到以下評分等級資料，其P值等于0.016，小于0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其表達情況統(tǒng)計結(jié)果如圖2。

圖2 不同侵襲危險程度GIST中FAK表達情況統(tǒng)計圖，在GIST組織中FAK隨著侵襲危險程度的升高而表達上升，表達差異用χ2檢驗，（P<0.05用*表示）。

2.2 Western-Bolt結(jié)果 胃腸間質(zhì)瘤新鮮組織提取總蛋白行Western-Bolt檢測FAK的表達水平，結(jié)果顯示：在正常組織和腫瘤組織中，F(xiàn)AK在胃腸間質(zhì)瘤組織中的表達量顯著增加，結(jié)果見圖3。

3 討論

黏著斑激酶（focal adhesion kinase， FAK）是一個分子量為125kD的胞漿酪氨酸激酶，在正常組織中，F(xiàn)AK主要對細胞的錨著依賴（anchorage dependent）性生長起調(diào)控作用，在侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤中，F(xiàn)AK表達較高水平，且在腫瘤進展過程中起關(guān)鍵性作用。免疫組化和Western-Bolt的實驗結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)：胃腸間質(zhì)瘤組織中存在FAK高表達，侵襲危險程度不同，F(xiàn)AK的表達水平不同，隨著胃腸間質(zhì)瘤侵襲危險程度的增高，F(xiàn)AK的表達量增多，呈現(xiàn)逐步遞增的趨勢。

比較FAK的表達量與胃腸間質(zhì)瘤患者侵襲危險程度分期的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)FAK的表達水平與胃腸間質(zhì)瘤組織侵襲危險程度分期有關(guān)，不同的侵襲危險程度分期組，F(xiàn)AK的表達水平不同。實驗結(jié)果顯示：極低侵襲危險程度期和中侵襲危險程度期，極低侵襲危險程度期和極高侵襲危險程度期之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），我們認為隨著腫瘤分期的進展，F(xiàn)AK的表達量增多，表明FAK的表達水平與胃腸間質(zhì)瘤臨床進展有關(guān)，推測FAK可作為胃腸間質(zhì)瘤患者臨床進展的監(jiān)測指標，并對胃腸間質(zhì)瘤患者的預(yù)后有一定的參考價值。

FAK與性別的相關(guān)性分析中，結(jié)果是男性組和女性組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），因此推斷性別與FAK表達水平的相關(guān)性不大。FAK與胃腸間質(zhì)瘤的腫瘤部位及細胞類型的分析結(jié)果顯示腫瘤部位及細胞類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），推測腫瘤部位及細胞類型對胃腸間質(zhì)瘤中FAK表達無顯著影響。研究表明，F(xiàn)AK的高表達與患者的預(yù)后不良有顯著關(guān)系。

綜合上述研究結(jié)果，我們認為FAK的表達量與胃腸間質(zhì)瘤的臨床進展相關(guān)。故此，我們提出FAK診斷GIST的新方法，即活檢標本進行FAK基因診斷和FAK免疫組化診斷結(jié)合的方法。我們的研究在組織學(xué)上為FAK作為GIST的潛在治療靶標也提供了可靠的依據(jù)。

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編輯/金昊天